妊娠期糖尿病患者血清miR-450a-5p和CREB表達水平及臨床意義

周 青，秦智娟，馬宗麗

（如皋市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇南通 226500）

在妊娠期間首次發(fā)生不同程度的異常糖耐量病癥被稱為妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)，每年發(fā)病率約為1%～15%，且有逐年升高的趨勢[1]。GDM 對母嬰均會產(chǎn)生不良的影響，嚴重者甚至?xí)斐蛇h期并發(fā)癥，這不僅降低了母嬰的生命健康和生活質(zhì)量，還給社會帶來了巨大的醫(yī)療負擔(dān)。隨著生育政策的放開，高齡孕婦不斷增加，預(yù)計妊娠期糖尿病發(fā)病率會進一步上升[2]?，F(xiàn)目前，GDM 的發(fā)病機制尚未明確，因此，尋找敏感度、特異度高的生物標(biāo)志物對GDM 的有效靶向治療具有重要意義。

環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(c-AMP response elementbinding protein，CREB)在細胞內(nèi)參與多種信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，可調(diào)控多種基因的表達，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用尤為明顯，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)成效果受蛋白磷酸化水平的波動影響[3]。一些研究已將CREB視為不同腫瘤類型中的推定致癌信號，尤其是在白血病和神經(jīng)膠質(zhì)瘤中。微小核糖核酸（mircro RNAs，miRNAs）通過與mRNA 非編碼區(qū)域特異性相結(jié)合而調(diào)控多種分子生物學(xué)過程[4]。miR-450a-5p 為近年來新發(fā)現(xiàn)的miRNA 分子。有研究人員[5]指出，CREB 與miR-450a-5p 之間存在結(jié)合位點，發(fā)現(xiàn)上調(diào)的miR-450a-5p 通過靶向CREB 可以消除甲基乙二醛（methylglyoxal，MGO）對胰島素的抵抗。因此，miR-450a-5p，CREB 可能是改善GDM 誘導(dǎo)胰島素抵抗的潛在治療靶點。本研究旨在探討血清miR-450a-5p，CREB 在GDM 患者中的表達水平及臨床意義，為進一步明晰GDM的復(fù)雜機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2018年4月～2020年4月在如皋市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科建檔產(chǎn)檢的120 例GDM 孕婦為GDM組，選擇同期的120例健康孕婦為對照組。妊娠期糖尿病組年齡22 ～39（29.57±4.13）歲；孕周24～29（28.50±1.60）周，孕次1～4（2.23±0.41）次，產(chǎn)次0～3（1.46±0.35）次；對照組年齡22～39（28.98±3.85）歲；孕周24 ～29(28.40±1.56)周，孕次1～4（2.29±0.44）次，產(chǎn)次0～3（1.48±0.39）次，兩組基線資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn)：① GDM 組首次確診為GDM[6]；② 在本院進行定期產(chǎn)檢；③ 孕周≥24 周。排除標(biāo)準(zhǔn)：① 多胎妊娠；② 患有高血壓、高血脂等其他妊娠并發(fā)癥；③ 孕前患糖尿病或糖尿病家族史。本研究已經(jīng)過患者及家屬知情并簽字，且經(jīng)本院道德倫理委員會批準(zhǔn)通過，符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》。

1.2 儀器與試劑 低溫高速離心機M16RS（上海邁皋科學(xué)儀器有限公司）；Trizol 試劑[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京天根生化有限公司)；miScript SYBR?Green qPCR Kit( 德國QIAGEN 公司)；qRT-PCR 儀( 美國Bio-Rad 公司)；人cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）ELISA 試劑盒(北京全式金生物公司)，酶標(biāo)儀(上海眾磊生物公司)；-80℃超低溫冰箱（美國Thermo 公司）；移液槍（德國Eppendorf 公司）；引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計并合成。

1.3 方法

1.3.1 采集樣本：患者入組后的次日清晨采集空腹靜脈血5ml，在3 000r/min 條件下離心l0min，取其上清液于EP 管內(nèi)，于-20℃保存，待測。

1.3.2 觀察指標(biāo)：①胰島素抵抗相關(guān)指標(biāo)：檢測空腹血糖（fasting plasma glucose，F(xiàn)PG）及空腹胰島素（fasting insulin，F(xiàn)INS）（全自動電化學(xué)發(fā)光分析儀分析），計算穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment-Insulin resistance，HOMA-IR)=(FPG×FINS)/22.5。②臨床參數(shù)指標(biāo)：年齡、身體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）。

1.3.3 qRT-PCR 檢測血清中miR-450a-5p 相對表達水平：在兩組患者血清中加入Trizol 試劑進行總RNA 提取，采用超微量分光光度計計算RNA 純度，符合實驗標(biāo)準(zhǔn)的吸光度A280nm參考范圍為0.0 ～2.0。采用RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。參照miScript SYBR?Green qPCR Kit 試劑盒說明書進行qRT-PCR 反應(yīng)，PCR 反應(yīng)條件：95 ℃3min，95℃10s，58℃30s，72℃10s，42 個循環(huán)，以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt計算血清中miR-450a-5p 相對表達水平，見表1。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.3.4 ELISA 檢測血清中CREB 表達水平：應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）測定已分離保存的血清CREB 水平，試驗過程嚴格按照說明書上的步驟操作，應(yīng)用酶標(biāo)儀在A450nm處讀各孔的吸光度值(A值)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出其濃度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.0 軟件對數(shù)據(jù)進行處理。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組間比較采用t檢驗。Pearson 相關(guān)性分析血清miR-450a-5p，CREB 與GDM 患者臨床病理特征的關(guān)系；采用受試者工作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲線分析miR-450a-5p，CREB 表達水平在GDM 疾病中的診斷價值；Logistic 回歸分析GDM 發(fā)生的影響因素。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床參數(shù)和胰島素相關(guān)指標(biāo)水平比較 見表2。GDM 組孕產(chǎn)婦BMI，F(xiàn)BG，F(xiàn)INS 及HOMA-IR 指標(biāo)水平均高于對照組，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

表2 兩組臨床參數(shù)和胰島素相關(guān)指標(biāo)水平比較(±s)

表2 兩組臨床參數(shù)和胰島素相關(guān)指標(biāo)水平比較(±s)

項 目GDM 組（n=120）對照組（n=120）tP年齡（歲）29.57±4.1328.98±3.851.1450.253 BMI（kg/m2）27.12±4.9325.05±4.283.4730.001 FBG（mmol/L）8.05±0.785.58±0.5129.0340.000 FINS（mIU/L）13.92±1.898.35±1.9322.5880.000 HOMA-IR5.02±2.132.42±1.0511.9940.000

2.2 血清miR-450a-5p 和CREB 在兩組中的表達水平 血清miR-450a-5p 在GDM 組中表達水平（0.69±0.15）均明顯低于對照組（1.58±0.34），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=26.235，P＜0.05），血清CREB 在GDM 組中表達水平（8.75±2.42μg/ml）均明顯高于對照組（2.64±0.66μg/ml），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=26.683，P＜0.05）。

2.3 miR-450a-5p，CREB 表達水平與GDM 患者臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析 見表3。血清miR-450a-5p 水平與FBG，HOMA-IR 呈顯著負相關(guān)（r=-0.427，-0.251），與FINS 呈顯著正相關(guān)（r=0.636）；CREB 水平與FBG，HOMA-IR 呈顯著正相關(guān)（r=0.432，0.574），與FINS呈顯著負相關(guān)（r=-0.573），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

表3 miR-450a-5p，CREB 表達水平與GDM 患者臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析

2.4 血清中miR-450a-5p，CREB 表達水平對GDM的診斷價值 見表4，圖1。ROC 曲線分析血清miR-450a-5p，CREB 水平對GDM 的診斷價值結(jié)果表明，二者的曲線下面積（AUC）分別為0.926，0.881；截斷值分別為0.952，3.888μg/ml；敏感度分別為91.7%，86.7%；特異度分別為90.8%，89.2%。

表4 血清中miR-450a-5p，CREB 表達水平對GDM 的診斷價值

圖1 血清中miR-450a-5p，CREB 表達水平對GDM 的診斷價值

2.5 Logistic 回歸分析GDM 發(fā)生的影響因素 見表5。以單因素分析中差異具有統(tǒng)計學(xué)意義的BMI，F(xiàn)BG，F(xiàn)INS，HOMA-IR，miR-450a-5p 和CREB 為自變量，以GDM 是否發(fā)生為因變量，經(jīng)Logistic 回歸分析結(jié)果顯示，血清miR-450a-5p 是GDM 的保護因素，血清CREB 是GDM 的獨立危險因素（P＜0.05）。

表5 GDM 患者血清中miR-450a-5p，CREB Logistic回歸分析

3 討論

妊娠期糖尿?。℅DM）為妊娠期常見并發(fā)癥，患有GDM 的孕產(chǎn)婦常常出現(xiàn)酮癥酸中毒、代謝功能紊亂及圍生期并發(fā)癥等，隨著病癥的加重，母嬰的死亡率也隨之增加[7]。有研究表示，約有50%的GDM 患者在妊娠之后會出現(xiàn)2 型糖尿病，且GDM不僅會對孕婦及腹中胎兒的身體健康造成影響，對胎兒成年后各種代謝性疾病的發(fā)生率也有一定影響[8]，對孕婦生活質(zhì)量及新生兒的身體健康均造成了嚴重的威脅。因此，早期診斷和預(yù)防對改善GDM妊娠結(jié)局意義重大。

糖尿病是一種胰島素分泌不足和胰島素抵抗而引起的代謝疾病。miRNA通過與靶基因mRNA 的3’端非翻譯區(qū)特異性結(jié)合而調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄，進而參與多種生理病理過程，如參與腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲等生物學(xué)進程，其作為新靶點在早期診斷和治療癌癥的過程中有重要的意義[9]。ZHAO等[10]研究發(fā)現(xiàn)，miR-450a-5p 在胃癌細胞中呈低表達，通過靶向CREB1 從而抑制胃癌細胞增殖、遷移和侵襲并誘導(dǎo)細胞凋亡，miR-450a-5p 可能是治療胃癌的新分子靶點。LIU 等[11]試驗表明miR-450a-5p 在膠質(zhì)瘤組織中呈低表達，且與吉非替尼協(xié)同抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。最近的一項研究[12]發(fā)現(xiàn)，miRNAs 通過調(diào)節(jié)胰島素的合成、分泌和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在糖尿病發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。WEI 等[5]研究表明，miR-450a-5p 的表達在高糖狀態(tài)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）中呈下調(diào)趨勢，并且隨著MGO 濃度的增加而降低。因此，可以推測miR-450a-5p 可能參與了糖酵解過程并在糖尿病的發(fā)病機制中發(fā)揮作用。與本研究相結(jié)合發(fā)現(xiàn)，GDM組患者血清中miR-450a-5p 表達水平較對照組顯著下調(diào)，且血清miR-450a-5p 水平與FBG，HOMA-IR呈負相關(guān)，與FINS 呈正相關(guān)，提示miR-450a-5p 可能參與了GDM 的發(fā)生發(fā)展過程；進一步ROC 曲線分析結(jié)果顯示，血清miR-450a-5p 水平對GDM 診斷的曲線下面積為0.926（敏感度和特異度分別為91.7%，90.8%），提示miR-450a-5p 對GDM 的早期診斷具有較高的效能。Logistic 回歸分析顯示miR-450a-5p 是GDM 的保護因素，提示miR-450a-5p 有望成為GDM 診斷及預(yù)后評估的潛在生物學(xué)指標(biāo)。推測miR-450a-5p 在GDM 中可能是通過調(diào)節(jié)胰島素分泌相關(guān)基因的表達，從而控制GDM 的發(fā)生。

環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)作為一種核轉(zhuǎn)錄蛋白，能改變短時程記憶，與長時程記憶的形成及活化有密切的關(guān)系。記憶相關(guān)因子隨著CREB 的激活而轉(zhuǎn)錄，從而產(chǎn)生多種與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)蛋白[13]。以往的研究主要集中在CREB 與神經(jīng)系統(tǒng)的關(guān)系[14]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)糖尿病狀態(tài)下，胰島素信號通路活性通常屬于下調(diào)狀態(tài)，尤其是下游Akt 的信號通路，因此認為改善糖尿病認知功能障礙可以通過調(diào)節(jié)Akt/CREB 信號通路的活性來實現(xiàn)[15]。BENCHOULA 等[16]指出，CREB 被胰高血糖素和許多其他導(dǎo)致糖尿病患者空腹血糖水平升高的因素過度激活，且CREB 核轉(zhuǎn)錄活性作為治療糖尿病和糖尿病并發(fā)癥的靶向因子，在糖尿病和糖尿病并發(fā)癥中起著至關(guān)重要的作用。在本研究中，與對照組相比，血清CREB 表達水平顯著上調(diào)，且其水平與FBG，HOMA-IR 呈正相關(guān)，與FINS 呈負相關(guān)，提示CREB 可能是GDM 患者妊娠過程中調(diào)節(jié)胰島素敏感性的重要因子之一，其可為GDM 的診斷提供參考依據(jù)；ROC 曲線顯示，血清CREB水平對GDM 診斷的曲線下面積為0.881（敏感度和特異度分別為86.7%，89.2%），提示CREB 具有作為GDM 患者血清標(biāo)志物的潛能，當(dāng)截斷值大于3.888μg/ml 時孕產(chǎn)婦有發(fā)生GDM 的風(fēng)險；Logistic回歸分析顯示血清CREB 是GDM 的獨立危險因素，提示當(dāng)CREB 呈高表達時應(yīng)加強對患者的指標(biāo)監(jiān)控及干預(yù)治療。推測CREB 在GDM 中的作用可能是因為miR-450a-5p 在肝臟中激活其靶基因CREB 時可促進肝臟胰島素抵抗，從而打破機體葡萄糖平衡，最終導(dǎo)致GDM 的發(fā)生。

綜上所述，miR-450a-5p，CREB 在GDM 患者血清中呈異常表達，二者可作為GDM 早期診斷及預(yù)后評估的潛在生物學(xué)指標(biāo)，為臨床GDM 的治療提供新的思路。本研究的不足之處在于樣本數(shù)量較少，后期應(yīng)擴大樣本量證實本研究結(jié)果的可靠性，為GDM 的具體機制研究提供數(shù)據(jù)依據(jù)。