人非小細(xì)胞肺癌組織中轉(zhuǎn)錄因子E2F家族表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性分析

張濤元，丁雪梅，李 俏，祝擷英，曹三成，吳 爽

（1.青島大學(xué)附屬日照醫(yī)院/日照心臟病醫(yī)院，山東日照 276801；2.日照市中醫(yī)醫(yī)院，山東日照 276899；3.西安交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，西安 710003）

肺癌是世界范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的癌癥[1]之一，根據(jù)其組織學(xué)類型分為兩類：小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）。其中NSCLC 約占肺癌的85%，又分為鱗狀細(xì)胞癌、腺癌和大細(xì)胞癌三類[2]。隨著對NSCLC 發(fā)病機(jī)制的深入研究，NSCLC 的診斷和治療手段提升較大，然而NSCLC 的5年總生存率(overall survival，OS)仍小于15%[3]。因此亟需尋找更多有效的生物標(biāo)志物，用于預(yù)測NSCLC 的病理過程并作為潛在藥物靶點(diǎn)，改善預(yù)后和實(shí)施個(gè)體化治療。

迄今為止，轉(zhuǎn)錄因子E2F 家族共發(fā)現(xiàn)了8 個(gè)因子，并按其發(fā)現(xiàn)順序進(jìn)行編號（E2F1, E2F2, E2F3,E2F4, E2F5, E2F6, E2F7, E2F8）。有研究報(bào)道，E2F1, E2F2, E2F3, E2F8 與肺癌的發(fā)生密切相關(guān)[4-7]，然而E2F 家族在NSCLC 中的表達(dá)、與臨床病理相關(guān)性和可能的作用機(jī)制仍未見報(bào)道。

近些年，微陣列技術(shù)和生物信息技術(shù)已被廣泛用于鑒定基因組表達(dá)水平的改變，幫助我們識別癌癥相關(guān)的差異表達(dá)基因和相關(guān)信號通路。本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)，分析E2F 家族在NSCLC 中的表達(dá)情況，探究其與NSCLC 分期、淋巴轉(zhuǎn)移、患者預(yù)后之間的相關(guān)性，并聚焦其在NSCLC 中的基因突變情況，尋找致病機(jī)理，為NSCLC 的診斷提供新型標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 通過在線數(shù)據(jù)庫獲取所需的非小細(xì)胞肺癌的臨床病例數(shù)據(jù)，并對所有病例中E2F 家族的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2 方法

1.2.1 E2F 家族在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)差異的驗(yàn)證: 利用Oncomine 數(shù)據(jù)庫（www.oncomine.org）[8]，比較E2F 家族在癌組織與正常組織中轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)差異，同時(shí)獲取肺癌組織與正常肺組織中E2F 家族的研究數(shù)據(jù)，參數(shù)設(shè)置如下：t-檢驗(yàn)，P-Vaule 為0.01,Fold Change 為1.5, Gene Rank 為10%, Date Type 為mRNA。利用UALCAN (http://ualcan.path.uab.edu)數(shù)據(jù)庫[9]，驗(yàn)證NSCLC 患者E2F 家族mRNA 的表達(dá)情況。

1.2.2 E2F 家族與NSCLC 患者臨床病理參數(shù)的分析:利用UALCAN 數(shù)據(jù)庫，分析E2F 家族的mRNA 表達(dá)情況與NSCLC 患者的癌癥分期和淋巴轉(zhuǎn)移之間的相關(guān)性，t-檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，且P＜0.05 時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.3 E2F 家族與NSCLC 患者總生存率的分析: 利用 Kaplan Meier-Plotter(http://kmplot.com/analysis/)網(wǎng)站，分析E2F 家族與NSCLC 患者總生存期之間的相關(guān)性。將NSCLC 患者分為高表達(dá)和低表達(dá)2組，分組標(biāo)準(zhǔn)為E2F 家族mRNA 表達(dá)值的中位數(shù)，計(jì)算危險(xiǎn)比(hazard ratio,HR)、95%置信區(qū)間(95%confidence interval, 95%CI)和P值，制作生存曲線。

1.2.4 E2F 家族在NSCLC 患者基因組圖譜中的分析: 利用cBioPorta 數(shù)據(jù)庫，對E2F 家族在NSCLC患者基因組圖譜中的變化進(jìn)行分析，共納入標(biāo)本1 380 例，分析內(nèi)容包括突變、預(yù)測的GISTIC 拷貝數(shù)改變(CNA)、mRNA 表達(dá)的z評分(RNA-Seq V2 RSEM)和蛋白表達(dá)z 評分(RPPA)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 E2F 家族在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)差異的驗(yàn)證及E2F 家族與NSCLC 患者臨床病理參數(shù)的分析，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，且P＜0.05 時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；E2F 家族與NSCLC 患者總生存率的分析，計(jì)算危險(xiǎn)比(HR)、95%置信區(qū)間和P值，且P＜0.05 時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC 患者中E2F 家族在mRNA 水平高表達(dá)Oncomine 數(shù)據(jù)庫顯示，E2F 家族的mRNA 在肺癌患者中均呈現(xiàn)高表達(dá)，見圖1。UALCAN 數(shù)據(jù)庫中，對NSCLC 患者E2F 家族的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行驗(yàn)證（其中正常對照組59 例，癌癥組519 例），結(jié)果顯示，與正常肺組織相比，E2F 家族成員在NSCLC 組織中mRNA 均高表達(dá)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

圖1 Oncomine 數(shù)據(jù)庫中E2F 家族在所有腫瘤與正常組織中的mRNA 表達(dá)差異

2.2 E2F 家族轉(zhuǎn)錄水平高表達(dá)與NSCLC 患者的癌癥分期、淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān) 見表2。利用UALCAN 數(shù)據(jù)庫對E2F 家族進(jìn)行NSCLC 患者臨床病理參數(shù)相關(guān)性分析，結(jié)果顯示在癌癥分期（其中正常對照59 例，stage1 患者277 例，stage2 患者155 例，stage3 患者85 例，stage4 患者28 例）中，隨著癌癥分期的增加，E2F 家族的mRNA 水平逐漸升高；在淋巴轉(zhuǎn)移中（正常對照59 例，N0 患者331 例，N1 患者96 例，N2 患者74 例，N3 患者2 例），隨著淋巴的擴(kuò)散范圍的增大，E2F 家族的mRNA 水平顯著上升。

表1 UALCAN 數(shù)據(jù)庫中E2F 家族在NSCLC組織與正常肺組織中的mRNA 表達(dá)差異

2.3 E2F 家族與NSCLC 患者總生存率密切相關(guān) 見圖2。利用Kaplan Meier-Plotter 進(jìn)行E2F 家族與NSCLC 患者預(yù)后的相關(guān)分析，并繪制生存曲線圖，結(jié)果顯示，E2F1, E2F2, E2F4, E2F7, E2F8 的高表達(dá)組，NSCLC 患者總生存率顯著低于低表達(dá)組。

2.4 E2F 家族在NSCLC 患者基因突變的分析 見圖3。在1 380 例NSCLC 標(biāo)本中，共有435 例標(biāo)本的E2F 家族基因發(fā)生了包括突變、CAN，RNA-Seq V2 RSEM，RPPA 在內(nèi)的改變，比例高達(dá)31.52%。

3 討論

E2F 轉(zhuǎn)錄因子在包括前列腺癌、乳腺癌、肺癌等在內(nèi)的多種癌癥中高表達(dá)[13-15]，在腫瘤的進(jìn)程中起著重要作用。盡管一些研究已經(jīng)證實(shí)部分E2F 家族成員在NSCLC 中發(fā)揮關(guān)鍵作用，但是關(guān)于E2F家族在NSCLC 中的生物學(xué)分析仍未見報(bào)道。本研究首次探討不同E2F 因子在NSCLC 中mRNA 表達(dá)和預(yù)后價(jià)值，為尋找NSCLC 的診斷提供新的思路。

表2 E2F 家族在NSCLC 患者的不同癌癥分期、淋巴轉(zhuǎn)移級別中的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)差異

圖2 E2F 家族在NSCLC 患者中總生存率的生存曲線

針對NSCLC，E2F 家族中研究最多的因子為E2F1。E2F1 的過表達(dá)與NSCLC 的發(fā)生相關(guān)，且干擾pRb-p53-MDM2 能增強(qiáng)E2F1 在NSCLC 中的促癌作用[16]。另有研究發(fā)現(xiàn)，在小細(xì)胞肺癌中，E2F1 能夠通過ZEB1 促進(jìn)腫瘤的侵襲[16]。本研究通過數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，E2F1 在NSCLC 中高表達(dá)，且隨著腫瘤的進(jìn)展及轉(zhuǎn)移，E2F1 的表達(dá)量也隨之增高，提示E2F1 可作為監(jiān)測NSCLC 病情進(jìn)展的腫瘤標(biāo)志物。

圖3 NSCLC 患者中E2F 家族基因表達(dá)及基因突變分析

據(jù)報(bào)道，E2F2 是NSCLC 的腫瘤激活因子，是NSCLC 患者OS 的獨(dú)立生存指標(biāo)[17]。同時(shí)，在血液組織中檢測E2F3 表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)肺癌患者血液中E2F3 的mRNA 水平顯著高于正常人血液，即lncRNA NEAT1 能夠上調(diào)E2F3，從而促進(jìn)肺癌的發(fā)生，提示E2F3 可以作為肺癌診斷的敏感指標(biāo)[18]。最新研究發(fā)現(xiàn)，E2F3 與NSCLC 的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，預(yù)示著E2F3 在NSCLC 的預(yù)后診斷中具有一定的價(jià)值[19]。

E2F4 作為抑制轉(zhuǎn)錄因子，能夠抑制增殖，并介導(dǎo)辣椒素的抗增殖活性[20]。BANKOVIC 等[21]人通過DNA 指紋圖譜研究了NSCLC 患者基因組的不穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)E2F4 是參與其生長和轉(zhuǎn)移的基因之一。在本研究中，E2F4 高表達(dá)與NSCLC 的腫瘤分級、淋巴轉(zhuǎn)移及患者較差的OS 相關(guān)，這似乎與E2F4 作為腫瘤抑制因子的作用不一致，需要后續(xù)的驗(yàn)證試驗(yàn)加以證明。

E2F5 在前列腺癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中高表達(dá)[22-23]，但是在NSCLC 中未見報(bào)道。本研究證實(shí)E2F5 在NSCLC 中mRNA 高表達(dá)，臨床病理數(shù)據(jù)顯示E2F5 與癌癥分級相關(guān)，但與患者OS 無明顯相關(guān)性。

有研究證實(shí)，miR-424 負(fù)調(diào)控E2F6 的表達(dá)，抑制A549 細(xì)胞的增殖和侵襲[24]。在NSCLC 患者血液中，檢測E2F6 的表達(dá)，顯示其mRNA 較正常人血液樣本高表達(dá)[21]，而E2F6 與NSCLC 的患者生存情況相關(guān)性目前未見報(bào)道。

E2F7，E2F8 被證明是腫瘤激活因子，E2F8能阻斷其他E2F 家族成員與cyclin D1 的結(jié)合，并激活cyclin D1[25]；芯片測序分析表明，E2F8 能夠與uhrf1 的啟動子結(jié)合，參與其激活與調(diào)控[26]。通過生物信息學(xué)，我們發(fā)現(xiàn)隨著NSCLC 的發(fā)生發(fā)展，E2F7，E2F8 的mRNA 水平也隨之升高，且E2F7，E2F8 的高表達(dá)，與患者較差的OS 相關(guān)，預(yù)示著E2F7, E2F8 有可能作為NSCLC 的發(fā)展及預(yù)后的標(biāo)志物，指導(dǎo)臨床治療。

通過系統(tǒng)分析，我們發(fā)現(xiàn)E2F 家族的表達(dá)與NSCLC 的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，同時(shí)通過對E2F 家族突變分析，發(fā)現(xiàn)其在NSCLC 患者中突變率高達(dá)31.52%，提示E2F 家族的突變可能與NSCLC 的發(fā)生存在密切關(guān)系，預(yù)示著有可能通過E2F 家族突變檢測提示NSCLC 的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)；同時(shí)，鑒于E2F 家族特別是其中的E2F1, E2F2, E2F3,E2F5, E2F7 和F2F8 與NSCLC 患者腫瘤分級及淋巴轉(zhuǎn)移密切關(guān)系，提示他們可作為腫瘤發(fā)展、轉(zhuǎn)移等病情監(jiān)測手段；而E2F4, E2F7 和E2F8 與較差的OS 的相關(guān)性，提示他們可作為患者較差預(yù)后的檢測標(biāo)志物。

綜上所述，本文系統(tǒng)地分析了E2F 家族在NSCLC 中的表達(dá)和預(yù)后價(jià)值，并對E2F 家族及相關(guān)蛋白可能參與的NSCLC 中的生物學(xué)功能進(jìn)行了深入研究。但是，由于本文是基于公共數(shù)據(jù)庫對已公開數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，因此缺乏相關(guān)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，因此具有一定局限性，后續(xù)研究將根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果補(bǔ)充驗(yàn)證試驗(yàn)。