急性缺血性腦卒中患者血清Hcy，LncRNA CAI2和ERCC1表達(dá)水平與預(yù)測(cè)并發(fā)認(rèn)知障礙的價(jià)值研究

石慶麗，賈嘉琦，李秀艷，陳奕菲，高玉蘋，譚秀革

(北京市平谷區(qū)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,北京 101200)

缺血性腦卒中為腦部供血?jiǎng)用}閉塞引發(fā)的血液循環(huán)障礙，可導(dǎo)致局部腦組織壞死，急性缺血性腦卒中（acute ischemic stroke，AIS）在缺血性腦卒中發(fā)病后2 周內(nèi)發(fā)生，AIS 其發(fā)病基礎(chǔ)為動(dòng)脈粥樣硬化，具有較高的致死致殘率，AIS 的主要并發(fā)癥為認(rèn)知障礙，可影響患者的日常生活，早期的診斷可減輕認(rèn)知功能障礙的發(fā)生率[1]。同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）在動(dòng)脈粥樣硬化與缺血性腦卒中的發(fā)生中具有重要作用[2]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA CAI2（long non-coding RNA CAI2，LncRNA CAI2）參與多種病理的生理機(jī)制，在神經(jīng)的生長(zhǎng)發(fā)育與神經(jīng)系統(tǒng)的功能中具有重要作用[3]。核苷酸切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1（nucleotide excision repair cross complementary gene 1，ERCC1）為核酸切除修復(fù)的關(guān)鍵酶，可影響機(jī)體的修復(fù)能力與效率[4]。臨床關(guān)于Hcy，LncRNA CAI2 和ERCC1 聯(lián)合預(yù)測(cè)AIS 并發(fā)認(rèn)知障礙的相關(guān)研究較少，基于上述研究背景，在本文研究中進(jìn)一步驗(yàn)證Hcy，LncRNA CAI2 和ERCC1 在AIS 并發(fā)認(rèn)知障礙患者中的表達(dá)，明確其是否參與疾病的發(fā)展，為臨床上AIS 并發(fā)認(rèn)知障礙的早期診治提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 回顧性分析北京市平谷區(qū)醫(yī)院2018年5月～2020年5月收治的AIS 患者70 例作為研究組，其中，男性40 例，女性30 例，平均年齡62.71±11.62 歲，BMI 24.01±2.41kg/m2；其中高血壓患者38 例，血糖水平＜7.8 mmol/L 25例，7.8 ～11.1mmol/L 24 例， ＞11.1mmol/L 21例。AIS 并發(fā)認(rèn)知障礙患者112 例作為AIS 并發(fā)認(rèn)知障礙組，男性55 例，女性57 例，平均年齡62.88±11.50 歲，BMI 24.01±2.41 kg/m2，其中高血壓患者58 例，血糖水平＜7.8 mmol/L 38 例，7.8 ～11.1mmol/L 35 例，＞11.1mmol/L 39 例。另外選取同期在北京市平谷區(qū)醫(yī)院體檢的健康者70例作為對(duì)照組，男性38 例，女性32 例，平均年齡63.62±10.21 歲，BMI 23.62±2.51 kg/m2；三組患者男女比例、年齡、BMI 等一般資料均衡可比（P＞0.05）,患者及家屬均知情同意本次研究，簽署了知情同意書，且經(jīng)過我院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)[批準(zhǔn)號(hào)：（2018）倫審第（47）號(hào)]。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①研究組患者符合《中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南2018》[5]中對(duì)于此病的診治標(biāo)準(zhǔn)，患者為首次發(fā)病；②AIS 并發(fā)認(rèn)知障礙患者符合《腦小血管病相關(guān)認(rèn)知功能障礙中國(guó)診療指南(2019)》[6]中對(duì)于AIS 并發(fā)認(rèn)知障礙的診治標(biāo)準(zhǔn)，患者記憶力減退，語言能力受損。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①研究組患者排除并發(fā)腦出血、意識(shí)障礙、聽覺障礙，患者心肝腎功能異常；②AIS并發(fā)認(rèn)知障礙患者排除嚴(yán)重視力障礙患者、肺缺血性腦卒中引起的認(rèn)知障礙患者、心肝腎功能異常患者。

1.2 儀器與試劑 全自動(dòng)生化分析儀（濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司，型號(hào)：BK-400）,Takara 試劑盒（上海原鑫生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 Hcy 檢測(cè)方法：采集所有患者清晨空腹靜脈血4ml，以離心半徑5cm，轉(zhuǎn)速3 000r/min 離心處理10min，分離上層血清，-80℃保存待檢。采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)Hcy 水平。

1.3.2 LncRNA CAI2，ERCC1 檢測(cè)方法：實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)LncRNA CAI2，ERCC1 水平。采用Takara 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：0.4 μl 上下游引物，1μl cDNA模板，10 μl SYB Green，加蒸餾水至20 μl。反應(yīng)條件：92℃ 2min，95℃ 15s，60℃ 30s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，采用2-△△Ct方法計(jì)算出LncRNA CAI2，ERCC1 表達(dá)量，LncRNA CAI2 上游引物序列：5’-GAAGGCGTGAAGATGTGG-3’，下游引物序列：5’-GTGGGTTTGTAGAAGCAGGC-3’；ERCC1上游引物序列：5’-GAGCCTCAAGGGAAAGACTG C-3’，下游引物序列：TCGCCCTGCTCTATGCTC TACT-3’，內(nèi)參U6 引物序列：上游：5’-CCACGAA ACTACCTTCAACTCC-3’，下游：5’-GTGATCTCCT TCTGCATCCTGT-3’。

1.3.3 AIS 并發(fā)認(rèn)知障礙嚴(yán)重程度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：采用簡(jiǎn)明精神狀態(tài)量表對(duì)患者認(rèn)知功能進(jìn)行評(píng)價(jià)，該量表共有7 個(gè)條目，包括時(shí)間定向力、注意力、語言、視空間、延時(shí)記憶、即刻記憶、計(jì)算力，總分為30分，輕度認(rèn)知障礙為21 ～26 分，中度認(rèn)知障礙為10 ～20 分，重度認(rèn)知障礙為＜10 分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）描述，多組間比較采用方差齊性檢驗(yàn)，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，Hcy，LncRNA CAI2，ERCC1之間相關(guān)性采用Pearson 相關(guān)性分析。ROC 曲線分析Hcy，LncRNA CAI2，ERCC1 對(duì)AIS 并發(fā)認(rèn)知障礙的預(yù)測(cè)價(jià)值，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hcy，LncRNA CAI2 和ERCC1 在對(duì)照組、研究組、AIS 并發(fā)認(rèn)知障礙組中的表達(dá)對(duì)比 見表1。與對(duì)照組、研究組相比，AIS 并發(fā)認(rèn)知障礙組Hcy，LncRNA CAI2 表達(dá)升高，ERCC1 表達(dá)降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

表1 Hcy，LncRNA CAI2，ERCC1 在對(duì)照組、研究組、AIS 并發(fā)認(rèn)知障礙組中的表達(dá)對(duì)比（±s）

表1 Hcy，LncRNA CAI2，ERCC1 在對(duì)照組、研究組、AIS 并發(fā)認(rèn)知障礙組中的表達(dá)對(duì)比（±s）

項(xiàng) 目對(duì)照組（n=70）研究組（n=70）AIS 并發(fā)認(rèn)知障礙組（n=112）FP Hcy（μmol/L）9.58±0.9915.36±1.5522.35±2.4064.4360.001 LncRNA CAI21.11±0.151.62±0.181.85±0.2039.9280.001 ERCC11.26±0.140.91±0.080.76±0.0747.9590.001

2.2 Hcy，LncRNA CAI2，ERCC1 與AIS 并發(fā)認(rèn)知障礙嚴(yán)重程度的關(guān)系分析 見表2。隨著AIS 并發(fā)認(rèn)知障礙嚴(yán)重程度的加重，Hcy，LncRNA CAI2的表達(dá)逐漸升高，ERCC1 的表達(dá)逐漸降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

表2 Hcy，LncRNA CAI2，ERCC1 與AIS 并發(fā)認(rèn)知障礙嚴(yán)重程度的關(guān)系分析（±s）

表2 Hcy，LncRNA CAI2，ERCC1 與AIS 并發(fā)認(rèn)知障礙嚴(yán)重程度的關(guān)系分析（±s）

項(xiàng) 目輕度（n=45）中度（n=45）重度（n=22）FP Hcy（μmol/L）16.62±1.7018.75±1.8623.62±2.3620.8270.001 LncRNA CAI21.75±0.171.82±0.191.91±0.205.1190.001 ERCC10.88±0.090.75±0.080.67±0.0714.4050.001

2.3 影響AIS 并發(fā)認(rèn)知障礙嚴(yán)重程度的因素分析 見表3。將AIS 并發(fā)認(rèn)知障礙作為因變量，將Hcy，LncRNA CAI2，ERCC1 作為自變量，納入回歸模型分析，結(jié)果顯示，Hcy，LncRNA CAI2 水平升高，ERCC1 水平降低為影響AIS 并發(fā)認(rèn)知障礙嚴(yán)重程度的因素（均P＜0.05）。

表3 影響AIS 并發(fā)認(rèn)知障礙嚴(yán)重程度的因素分析

2.4 Hcy，LncRNA CAI2，ERCC1 之間相關(guān)性分析 相關(guān)性分析顯示，Hcy 與LncRNA CAI2 呈正相關(guān)（r=0.577，P=0.001）；Hcy 與ERCC1 呈負(fù)相 關(guān)（r=-0.561，P=0.001）；LncRNA CAI2 與ERCC1 呈負(fù)相關(guān)（r=-0.511，P=0.001）。

2.5 Hcy，LncRNA CAI2，ERCC1 對(duì)AIS 并發(fā)認(rèn)知障礙的預(yù)測(cè)價(jià)值 見表4，圖1。ROC 曲線顯示，與Hcy，LncRNA CAI2，ERCC1 單項(xiàng)診斷相比，三項(xiàng)聯(lián)合對(duì)AIS 并發(fā)認(rèn)知障礙的預(yù)測(cè)價(jià)值較高（P=0.001）。

表4 Hcy，LncRNA CAI2，ERCC1 對(duì)AIS 并發(fā)認(rèn)知障礙的預(yù)測(cè)價(jià)值（%）

圖1 Hcy，LncRNA CAI2，ERCC1 預(yù)測(cè)AIS 并發(fā)認(rèn)知障礙的ROC 曲線

3 討論

急性缺血性腦卒中（AIS）的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，可能與血栓形成、心房顫動(dòng)、高血壓相關(guān)。研究表明[7]，血糖為危重病的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，血糖水平升高可導(dǎo)致患者產(chǎn)生并發(fā)癥，加重患者病情，還可降低閉塞血管支配局域的腦組織血流灌溉，使患者腦組織缺血、缺氧，導(dǎo)致AIS 的發(fā)生。AIS 發(fā)病突然且迅速，故在急性期進(jìn)行有效干預(yù)具有重要作用[8]。認(rèn)知功能為人類在覺醒狀態(tài)下存在的有意識(shí)的精神活動(dòng)與學(xué)習(xí)新事物的能力，認(rèn)知功能障礙指患者學(xué)習(xí)與解決問題的能力降低，判斷力下降，其原因可能與患者神經(jīng)元結(jié)構(gòu)功能出現(xiàn)退化相關(guān)，急性腦卒中發(fā)生后可使血管閉塞，血流量降低，使患者腦細(xì)胞內(nèi)缺乏氧氣與營(yíng)養(yǎng)，發(fā)展為血管性癡呆，還可使患者腦部小血管出現(xiàn)病變，影響思維邏輯能力、判斷力，給患者的日常生活帶來不便[9-10]。

同型半胱氨酸（Hcy）為體內(nèi)蛋氨酸代謝的產(chǎn)物，且高水平的Hcy 可促使氧自由基的生成，使血管內(nèi)皮發(fā)生損傷，動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增生，在動(dòng)脈粥樣硬化形成中具有重要作用，還可誘導(dǎo)自身免疫反應(yīng)，在血管內(nèi)皮表面產(chǎn)生抗原抗體復(fù)合物，使巨噬細(xì)胞融合并形成泡沫細(xì)胞，增加AIS 的發(fā)生率[11]。臨床研究顯示[12-13]，Hcy 為影響AIS 并發(fā)認(rèn)知障礙的獨(dú)立因素，可損傷血管壁結(jié)構(gòu)，且認(rèn)知功能出現(xiàn)障礙與腦血管疾病具有相關(guān)性。Hcy 甲基化產(chǎn)物可抗抑郁與癡呆，Hcy 水平升高可使神經(jīng)遞質(zhì)受到影響，使認(rèn)知障礙發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)加大[14]。在本文研究中，Hcy 表達(dá)升高可導(dǎo)致病情加重，其原因可能為Hcy升高導(dǎo)致患者產(chǎn)生自由基，影響血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)，并損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，使內(nèi)皮細(xì)胞釋放一氧化碳的能力降低，Hcy 升高還可減弱血管舒張功能，Hcy 存在細(xì)胞毒性，可使血管內(nèi)皮增厚，降低血管順應(yīng)性，增加細(xì)胞表皮氧化性，降低生物活性，促使代謝增高與血壓增強(qiáng)，并使血管因子的活性受到刺激，增加血小板黏附功能，影響血栓調(diào)節(jié)素的形成，增加血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致認(rèn)知障礙的發(fā)生。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)為大于200 個(gè)核苷酸的非編碼RNA，廣泛存在于腦組織中，并參與腦缺血與卒中的康復(fù)[15-16]。AIS 的大腦二次損傷與神經(jīng)興奮毒性，氧化應(yīng)激與神經(jīng)炎癥反應(yīng)相關(guān)，且AIS患者的大腦二次損傷可使其神經(jīng)康復(fù)受到阻礙，LncRNA ANRIL 表達(dá)下調(diào)與腦卒中疾病的嚴(yán)重程度與炎癥反應(yīng)呈正相關(guān)[17]。CAI2 位于9 號(hào)染色體，在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)[18]。研究表明，LncRNA在AIS 中表達(dá)水平相對(duì)于短暫性腦缺血發(fā)作患者較高，可用于對(duì)AIS 的診斷，CAI2 在多種腫瘤中高表達(dá)。本文研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA CAI2 表達(dá)與患者的病情嚴(yán)重程度相關(guān)，且參與該病的發(fā)展，可用于該病的診斷，其原因可能為L(zhǎng)ncRNA CAI2 使患者的神經(jīng)炎癥反應(yīng)加重，神經(jīng)凋亡加快，使大腦受到損傷，并影響其康復(fù)，促進(jìn)了認(rèn)知障礙的發(fā)展，臨床上可根據(jù)其表達(dá)程度預(yù)測(cè)此病。

NER 系統(tǒng)為DNA 主要的修復(fù)機(jī)制，在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，ERCC1 可代表NER 系統(tǒng)的活性，且ERCC1 基因的表達(dá)與細(xì)胞的分化有關(guān)，隨著細(xì)胞分化程度的變差，修復(fù)功能逐漸降低[19]。ERCC1 基因序列甲基化可抑制基因的表達(dá)，機(jī)體產(chǎn)生AIS 時(shí)，影響ERCC1 基因的表達(dá)，使神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)損傷DNA 分子的修復(fù)受到影響，并使AIS 反復(fù)發(fā)作[20]。AIS 發(fā)生時(shí)，缺血區(qū)與正常灌注區(qū)可形成缺血半暗帶，使其受到炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，促進(jìn)自由基的釋放，與神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)DNA 結(jié)合，使DNA 堿基斷裂，并造成斷裂DNA 集聚，使神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)功能產(chǎn)生紊亂，加劇缺血性腦損傷[21]。本文進(jìn)一步分析顯示，ERCC1 水平為影響AIS 并發(fā)認(rèn)知障礙發(fā)生的因素，其原因可能為缺氧使機(jī)體激活ERCC1 基因的功能受到抑制，無法誘導(dǎo)ERCC1 基因進(jìn)行表達(dá)，使機(jī)體NER 系統(tǒng)的修復(fù)能力與修復(fù)效率降低，并使大量損傷DNA 分子在腦損傷處堆積，影響基因組的穩(wěn)定性，加重腦組織的損傷，并引起AIS 患者的認(rèn)知障礙。另外本文采用相關(guān)性分析Hcy，LncRNA CAI2，ERCC1 之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Hcy 與LncRNA CAI2 呈正相關(guān)，Hcy 與ERCC1 呈負(fù)相關(guān)，LncRNA CAI2 與ERCC1 呈負(fù)相關(guān)，提示三者可能共同參與此病的發(fā)生進(jìn)展，但本文納入樣本量較少，且為回顧性研究，結(jié)果可能具有一定的偏倚，本文未對(duì)患者的預(yù)后進(jìn)行研究，且未深入分析Hcy，LncRNA CAI2，ERCC1AIS 在并發(fā)認(rèn)知障礙中的具體作用機(jī)制，因此本文結(jié)果還需后續(xù)研究進(jìn)一步分析，以明確三者參與AIS 并發(fā)認(rèn)知障礙的作用機(jī)制及對(duì)患者預(yù)后的影響，為臨床上此病的診治提供參考。

綜上所述，AIS 并發(fā)認(rèn)知障礙的發(fā)生可使Hcy，LncRNA CAI2，ERCC1 表達(dá)發(fā)生變化，且相關(guān)性分析顯示三者具有相關(guān)性，推測(cè)Hcy，LncRNA CAI2，ERCC1 共同參與此病的發(fā)生發(fā)展，可作為臨床上預(yù)測(cè)AIS 并發(fā)認(rèn)知障礙的重要指標(biāo)。