火針對坐骨神經(jīng)損傷大鼠神經(jīng)功能及Nrg1/ErbB2通路的影響

王玲姝，張 宇，李冠男，陳瑞艷

(1. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

周圍神經(jīng)損傷是由外傷、擠壓、壓迫、拉伸、撕脫、手術(shù)等引起的常見臨床病癥，會導(dǎo)致運(yùn)動、感覺和自主神經(jīng)功能障礙甚至完全喪失[1]。周圍神經(jīng)有較強(qiáng)的再生能力,但是恢復(fù)緩慢及預(yù)后不良仍然是目前治療周圍神經(jīng)損傷的一大難題[2]。許多研究發(fā)現(xiàn)，Nrg1/ErbB2信號通路可通過調(diào)節(jié)雪旺細(xì)胞活性，促進(jìn)髓鞘修復(fù)及神經(jīng)軸突再生，在周圍神經(jīng)損傷修復(fù)過程中起著重要作用[3-6]。本實(shí)驗(yàn)旨在通過觀察火針對周圍神經(jīng)損傷大鼠髓鞘再生情況及Nrg1/ErbB2信號通路的影響，探尋火針治療周圍神經(jīng)損傷的分子機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 SPF級SpragueDawley雄性大鼠54只，6～8周齡，體重(200±20)g，購自濟(jì)南朋悅動物繁育有限公司，動物生產(chǎn)及使用許可證號：SCXK(魯)20190003。飼養(yǎng)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)室，飼養(yǎng)條件：溫度(25±2)℃，濕度40%～50%。動物實(shí)驗(yàn)遵照國家醫(yī)學(xué)動物實(shí)驗(yàn)條例執(zhí)行。

1.2主要試劑與儀器設(shè)備 兔源Nrg1、ErbB2抗體(北京博奧森生物科技有限公司)，檸檬酸(pH 6.0)抗原修復(fù)液、PBS緩沖液、4%多聚甲醛、正常兔血清、蘇木素染液、蘇木素分化液、蘇木素返藍(lán)液、組化試劑盒DAB顯色劑(武漢Servicebio公司)。Donatello型脫水機(jī)(DIAPATH公司)，JB-P5型包埋機(jī)(武漢俊杰電子有限公司)，RM2016病理切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司)，KD-P型組織攤片機(jī)(浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司)，MX-F型渦旋混合器(武漢Servicebio公司)，Eclipse Ci-L型正置白光拍照顯微鏡(Nikon，Japan)及Image-Pro Plus 6.0分析系統(tǒng)(Media Cybemetics，U.S.A)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，采用SPSS 26.0軟件隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、火針組，每組18只。模型組與火針組進(jìn)行神經(jīng)損傷造模：造模前大鼠禁食24 h，稱重后10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)腹腔注射麻醉，右側(cè)后肢備皮，碘伏消毒，沿臀股交界至膝關(guān)節(jié)連線處剪開1.5 cm皮膚，眼科直剪鈍性分離股二頭肌后暴露坐骨神經(jīng)，采用止血鉗(20 cm)鉗夾在第3個(gè)卡扣造成2 mm損傷，每次鉗夾10 s,休息10 s后再次進(jìn)行鉗夾，共進(jìn)行3次。鉗夾完成后肉眼可見損傷處神經(jīng)呈透明狀,僅有神經(jīng)外膜連接。4-0無菌縫合線逐層縫合肌肉、皮膚，并肌肉注射青霉素鈉以抗感染，術(shù)后24 h禁食后正常喂養(yǎng)。假手術(shù)組僅暴露神經(jīng)不進(jìn)行鉗夾處理。大鼠造模成功24 h后,火針組大鼠進(jìn)行火針干預(yù)：參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[7]定位環(huán)跳穴(后肢髖關(guān)節(jié)后上緣)、委中穴(后肢腘橫紋中線)。取賀氏鎢鋼火針(0.35 mm×40 mm),實(shí)驗(yàn)員持針柄將針尖放置在酒精燈火焰外焰燒至變紅發(fā)白后，稍離外焰退火，再放置內(nèi)焰重新加熱變紅，迅速刺入大鼠右側(cè)后肢環(huán)跳穴、委中穴，針刺深度0.6～1 cm，留針30 s后取針，休息1 min后重復(fù)1次上述火針操作，隔日火針治療1次,共干預(yù)14 d。模型組和假手術(shù)組大鼠僅進(jìn)行與火針組相同的束縛，不給予火針干預(yù)。

1.4檢測指標(biāo)及方法

1.4.1行為學(xué)檢測 分別于造模后即刻及干預(yù)1 d、7 d、14 d后，將大鼠雙后肢沾滿黑色碳素墨水，放置在自制大鼠行走箱(60 cm×15 cm×20 cm)內(nèi)，行走箱內(nèi)鋪A4白紙，自由行走，每只大鼠重復(fù)進(jìn)行3次，收集3張有效足印。根據(jù)Bain公式[8]計(jì)算坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(SFI)。SFI=-38.3(EPL-NPL)/NPL+109.5(ETS-NTS)/NTS+13.3(EIT-NIT)/NIT-8.8。PL為足印長度，即從足跟到足尖的距離；TS為足趾寬度，即第1趾到第5趾連線距離；IT為中間足趾距離，即第2趾到第4趾連線距離。SFI=0為正常；SFI=-100為神經(jīng)完全損傷。

1.4.2坐骨神經(jīng)損傷處超微結(jié)構(gòu) 行為學(xué)檢測后，每組隨機(jī)取6只大鼠，稱重后采用10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)腹腔注射麻醉，剪開胸腔暴露心臟。剪開右心耳，50 mL注射器沿左心尖刺入，注射生理鹽水至肺臟、四肢變白后迅速取出損傷側(cè)后肢損傷處上下共1 cm左右的坐骨神經(jīng)，一部分經(jīng)2.5%戊二醛中固定后，切成約1 mm3，0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗3次，50%～90%梯度乙醇和90%丙酮脫水后純丙酮與包埋液(2∶1)包埋。烘烤箱固化，超薄切片機(jī)切成50～60 nm切片，3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，進(jìn)行透射電鏡觀察，拍照。

1.5損傷坐骨神經(jīng)組織中Nrg1、ErbB2陽性表達(dá)免疫組化觀察 取經(jīng)4%多聚甲醛固定的后肢損傷處坐骨神經(jīng)，制備石蠟切片，二甲苯脫蠟至水，組織切片置滿檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液(pH 6.0)的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)，切片放入3%雙氧水溶液，室溫避光孵育阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，血清封閉后分別加入一抗、二抗后進(jìn)行DAB顯色，復(fù)染細(xì)胞核后脫水封片,顯微鏡鏡檢，蘇木素染細(xì)胞核為藍(lán)色，DAB顯色棕黃色為Nrg1、ErbB2陽性表達(dá)。采集圖像，分別測量每張切片中3個(gè)視野陽性的累積光密度值(IOD)以及對應(yīng)的陽性面積(Area)，計(jì)算出平均光密度值(AOD)，AOD=IOD/AREA，AOD值越大表明陽性表達(dá)水平越高。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及統(tǒng)計(jì)圖表繪制。計(jì)量數(shù)據(jù)如呈正態(tài)分布且方差齊，多組比較采用多重組間方差分析，兩兩比較采用LSD法；不滿足方差分析條件時(shí)，采用秩和檢驗(yàn)(Keuskal-Wallis法)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠足印情況 造模后即刻，模型組和火針組大鼠患側(cè)下肢步行中出現(xiàn)明顯無力、拖拽現(xiàn)象；干預(yù)1 d、7 d、14 d后，火針組大鼠足趾足印逐漸分開、清晰，患肢肌力明顯恢復(fù)，恢復(fù)情況好于模型組。見圖1。

圖1 假手術(shù)組和坐骨神經(jīng)損傷各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)足印情況

2.2各組大鼠SFI比較 火針組與模型組干預(yù)1 d、7 d、14 d后SFI均明顯低于假手術(shù)組(P均<0.05)，火針組與模型組干預(yù)1 d后SFI比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；火針組干預(yù)7 d、14 d后SFI均明顯高于同期模型組(P均<0.05)，且火針組干預(yù)14 d后SFI評分明顯高于干預(yù)7 d后(P<0.05)。見圖2。

圖2 假手術(shù)組和坐骨神經(jīng)損傷各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)坐骨神經(jīng)功能指數(shù)比較

2.3各組大鼠坐骨神經(jīng)損傷處超微結(jié)構(gòu) 干預(yù)1 d后，模型組和火針組線粒體等細(xì)胞器變形腫脹，髓鞘損傷變形，以破碎變性的舊髓鞘及細(xì)胞器損傷為主。干預(yù)7 d后，模型組各類細(xì)胞出現(xiàn)少量增殖，有少量新生髓鞘，厚度較?。换疳樈M出現(xiàn)較為明顯的新生髓鞘，線粒體等細(xì)胞器恢復(fù)較快，以舊髓鞘修復(fù)伴隨新生髓鞘為主。干預(yù)14 d后，模型組線粒體等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)趨于正常，細(xì)胞增殖，髓鞘僅出現(xiàn)少量再生；火針組大量新生髓鞘和舊髓鞘同時(shí)存在，新生髓鞘變厚，線粒體等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)正常。見圖3。

圖3 坐骨神經(jīng)損傷各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)透射電鏡下?lián)p傷處超微結(jié)構(gòu)

2.4各組大鼠坐骨神經(jīng)損傷組織中Nrg1、ErbB2表達(dá)情況 干預(yù)1 d后，各組大鼠坐骨神經(jīng)組織中Nrg1陽性表達(dá)光密度值比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，模型組、火針組ErbB2陽性表達(dá)光密度值均明顯低于假手術(shù)組(P均<0.05)；干預(yù)7 d、14 d后，火針組Nrg1、ErbB2陽性表達(dá)光密度值均明顯高于同期模型組(P均<0.05)；干預(yù)14 d后，火針組Nrg1、ErbB2陽性表達(dá)光密度值與假手術(shù)組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見圖4～6。

圖4 假手術(shù)組和坐骨神經(jīng)損傷各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)坐骨神經(jīng)損傷組織中Nrg1陽性表達(dá)情況(×200)

3 討 論

坐骨神經(jīng)由腰、骶神經(jīng)根(L4～S3)發(fā)出，沿梨狀肌下孔出盆腔行于臀大肌深面，在股骨大轉(zhuǎn)子與坐骨結(jié)節(jié)之間下行，支配大腿后側(cè)肌群，在腘窩處分為腓神經(jīng)和脛神經(jīng)[9]。坐骨神經(jīng)損傷后坐骨神經(jīng)沿線及分布區(qū)出現(xiàn)疼痛并向下肢放射，患側(cè)下肢出現(xiàn)運(yùn)動及感覺障礙，坐骨神經(jīng)及其分支所支配的骨骼肌如腓腸肌等出現(xiàn)不同程度的萎縮，嚴(yán)重者甚至出現(xiàn)關(guān)節(jié)變形等[10]。

坐骨神經(jīng)損傷屬于中醫(yī)“痹證”“痿證”范疇。大量研究表明針刺環(huán)跳穴、委中穴能促進(jìn)坐骨神經(jīng)損傷的恢復(fù)[11-12]。環(huán)跳穴位于坐骨神經(jīng)走行區(qū)域，為膽經(jīng)要穴，《針灸甲乙經(jīng)》中記載：“腰脅相引痛急，髀筋瘛脛痛不可屈伸，痹不仁，環(huán)跳主之?！蔽醒樽闾柦?jīng)穴，《靈樞·本輸》稱其有疏經(jīng)通絡(luò)、強(qiáng)腰健膝的功能。兩穴用于臨床治療坐骨神經(jīng)痛療效顯著[13]。動物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，針刺環(huán)跳穴、委中穴可通過下調(diào)炎性因子IL-1β、TNF-α表達(dá)水平而改善坐骨神經(jīng)運(yùn)動功能和傳導(dǎo)功能[14]?；疳樧鳛楣糯裴樦?，在針刺治療作用的基礎(chǔ)上增加了“火”的溫?zé)岽碳ぷ饔茫^普通針刺有更明顯的刺激強(qiáng)度，從而達(dá)到溫通經(jīng)脈、激發(fā)經(jīng)氣的作用，近年來常被用于治療坐骨神經(jīng)損傷[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，火針干預(yù)14 d后，大鼠SFI顯著高于模型組，運(yùn)動功能明顯恢復(fù)；鏡下見大量新生髓鞘，線粒體等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)正常。說明火針治療對髓鞘具有保護(hù)作用，可促進(jìn)髓鞘的修復(fù)及再生。

Nrg1是調(diào)節(jié)雪旺細(xì)胞增殖、遷移、分化的重要調(diào)節(jié)因子，在神經(jīng)再生及髓鞘形成過程中起重要作用[16]。Nrg1與ErbB2結(jié)合后可調(diào)節(jié)雪旺細(xì)胞活性，參與神經(jīng)軸突再生及再髓鞘化過程[17]。周圍神經(jīng)損傷后軸突被破壞，雪旺細(xì)胞與軸突的相關(guān)信號中斷，雪旺細(xì)胞接受到損傷信號開始自身合成Nrg1蛋白，通過與ErbB2結(jié)合促進(jìn)自身的重編程以適應(yīng)損傷情況，促進(jìn)髓鞘的修復(fù)[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，火針干預(yù)14 d后，坐骨神經(jīng)損傷組織中Nrg1、ErbB2表達(dá)明顯上調(diào)，從而加快雪旺細(xì)胞轉(zhuǎn)型、增殖、分化，修復(fù)破損髓鞘，促進(jìn)髓鞘新生。

圖5 假手術(shù)組和坐骨神經(jīng)損傷各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)坐骨神經(jīng)損傷組織中ErbB2陽性表達(dá)情況(×200)

圖6 假手術(shù)組和坐骨神經(jīng)損傷各組大鼠坐骨神經(jīng)損傷組織中Nrg1、ErbB2光密度值比較

綜上所述，火針通過調(diào)節(jié)Nrg1/ErbB2信號通路改善大鼠的運(yùn)動功能可能是火針治療坐骨神經(jīng)損傷的分子機(jī)制之一。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。