松香酸通過上調(diào)miR-30a-3p 表達(dá)增強(qiáng)缺氧誘導(dǎo)的HUVECs 血管生成

吳德虎 唐慧莉 陳 慧

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）的主要病理原因是冠狀動(dòng)脈閉塞后的心肌缺血和缺氧[1]。對(duì)于不能及時(shí)接受再灌注治療或再灌注治療后仍會(huì)出現(xiàn)心肌缺血的患者，增強(qiáng)血管新生可能是另一種治療途徑[2]。血管生成是血管發(fā)展和生長(zhǎng)新的毛細(xì)血管的過程[3]，其在生理?xiàng)l件下受到嚴(yán)格調(diào)控[4]。研究表明，miR-30a-3p 在血管生成、內(nèi)皮細(xì)胞功能中具有重要意義[5-6]。松香酸（abietic acid）是一種松香烷二萜類化合物，有抗過敏、抗炎、抗驚厥等作用[7]。研究顯示，松香酸可以增強(qiáng)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）遷移及小管形成。然而，松香酸對(duì)AMI 后內(nèi)皮血管生成及其具體的作用機(jī)制尚未得到明確研究。因此本研究通過體外實(shí)驗(yàn)，以HUVECs 細(xì)胞缺氧模型為研究對(duì)象，探討松香酸對(duì)AMI 后內(nèi)皮細(xì)胞血管生成及遷移的作用，為開發(fā)新的AMI 治療靶標(biāo)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試 劑 胎牛血清（Gibico，USA，10270-106），DMEM 培養(yǎng)基（Gibico，USA，11965092），松香酸（Sigma-Aldrich，USA，514-10-3），兔抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGFA）單克隆抗體（Cell Signaling Technology，USA，65373S），兔抗GAPDH 單克隆抗體（Cell Signaling Technology，USA，2118S），辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）（Beyotime，China，A0208），TRIzol RNA 分離試劑（Invitrogen，USA，15596026），M-MLV Reverse Transcriptase 試劑盒（Solarbio，China，RP1100），TaqMan primers and probes（Applied Biosystems，USA，000416）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 將HUVECs 培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 mg/mL 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中，于37 ℃，含5%CO2溫箱中培養(yǎng)。之后進(jìn)行缺氧處理，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含1%O2、5%CO2和94% N2的37 ℃溫箱中培養(yǎng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理 將培養(yǎng)好的細(xì)胞分為常氧組（正常供氧）、缺氧組（限制氧氣供給，缺氧處理）。之后在缺氧的基礎(chǔ)上，分別使用0.5、1、2 μmol/L 的松香酸處理細(xì)胞，即：缺氧+0.5、2 μmol/L 松香酸組。

為進(jìn)一步明確松香酸是否通過miR-30a-3p 發(fā)揮作用，將缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞分為：缺氧組缺氧+2 μmol/L 松香酸組，缺氧+2 μmol/L 松香酸+miR-30a-3p inhibitor 組，缺氧+2 μmol/L 松香酸+非特異性對(duì)照（NC）組。miR-30a-3p inhibitor 及NC 購自上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司。

1.4 Matrigel 小管形成測(cè)定 使用48 孔板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，首先在每孔中加入150～200 μL Matrigel，均勻覆蓋孔板底部，放置在37 ℃溫箱中，直至Matrigel 固化。之后每組取2×104個(gè)細(xì)胞分別接種至孔板中，4～6 h 后觀察血管生成的變化。

1.5 Transwell 測(cè)定細(xì)胞遷移 將各組細(xì)胞按照1.3所述進(jìn)行處理，培養(yǎng)至密度為95%，含2%血清的完全培養(yǎng)基維持24 h。消化收集細(xì)胞。將100 μL 細(xì)胞懸液加至上室，下室加500 μL 完全培養(yǎng)基。37 ℃含5% CO2溫箱中培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)基，胎牛血清輕柔洗去未遷移細(xì)胞，4%多聚甲醛固定15 min，結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察。

1.6 傷口愈合實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞遷移 使用6 孔板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，各組細(xì)胞處理方式同1.3。各組分別取3×105個(gè)細(xì)胞接種于6 孔板中，置于培養(yǎng)箱內(nèi)，細(xì)胞培養(yǎng)至單層后，使用100 μL 無菌槍頭制造劃痕。使用胎牛血清輕柔洗滌，清除劃痕區(qū)域殘留細(xì)胞，將細(xì)胞置于37℃溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)，之后于顯微鏡下觀察。

1.7 Western blot 收集各處理組細(xì)胞，提取總蛋白，檢測(cè)蛋白濃度，適當(dāng)稀釋后加樣至SDS-PAGE膠，電泳轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉封閉，洗膜3 次。加稀釋好的一抗（VEGFA，1∶1000）孵育過夜，洗膜3 次。加入二抗，ECL 顯影曝光。

1.8 qRT-PCR 收集各組細(xì)胞，使用TRIzol RNA分離試劑提取總RNA，使用M-MLV Reverse Transcriptase 試劑盒獲取cDNA，使用TaqMan 檢測(cè)miR-30a-3p 的轉(zhuǎn)錄水平，2-ΔΔCt法分析miR-30a-3p 的相對(duì)表達(dá)量。miR-30a-3p 引物序列如下：F：5'-GCGCTTTCAGTCGGATGTT-3'，R：5'-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3'。委托上海生工生物工程有限公司合成。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用GraphPad Prism 8.0.1 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用Unpaired t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 缺氧抑制HUVECs 的血管生成和遷移 為了驗(yàn)證松香酸對(duì)AMI 血管生成的影響，首先通過體外誘導(dǎo)HUVECs 細(xì)胞缺氧模型。分別通過小管形成測(cè)定、Transwell 和傷口愈合實(shí)驗(yàn)來評(píng)估細(xì)胞的血管生成和遷移，結(jié)果顯示，缺氧處理顯著抑制HUVECs 的血管生成和遷移能力。見圖1。

圖1 缺氧抑制HUVECs 的血管生成和遷移

2.2 松香酸促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)的HUVECs 的血管生成檢測(cè)松香酸對(duì)缺氧誘導(dǎo)的HUVECs 血管生成的影響。結(jié)果顯示，與單純?nèi)毖跽T導(dǎo)比較，松香酸能夠以劑量依賴性方式促進(jìn)細(xì)胞的血管生成，且隨著松香酸濃度的升高，細(xì)胞的血管生成更加明顯，VFGFA的表達(dá)水平也隨之升高，以2 μmol/L 效果最為顯著（見圖2A）。此外，Western blot 結(jié)果顯示，松香酸能夠顯著增加HUVECs 中血管生成因子VEGFA 的表達(dá)水平，且在2 μmol/L 的松香酸作用下，VEGFA 的表達(dá)量最高。見圖2B。

圖2 松香酸促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)的HUVECs 的血管生成

2.3 松香酸促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)的HUVECs 的遷移Transwell 遷移測(cè)定結(jié)果顯示，與單純?nèi)毖跽T導(dǎo)比較，松香酸處理會(huì)顯著增加細(xì)胞遷移見（圖3A）。同時(shí)，傷口愈合實(shí)驗(yàn)還表明，松香酸顯著刺激HUVECs 的傷口愈合能力（圖3B）。松香酸促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)的HUVECs 的遷移，隨著松香酸作用濃度的升高，對(duì)細(xì)胞遷移、傷口愈合的作用愈加明顯，松香酸作用濃度為2 μmol/L 時(shí)，效果最佳。因此選擇濃度為2 μmol/L 的松香酸進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 松香酸促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)的HUVECs 的遷移

2.4 松香酸上調(diào)缺氧誘導(dǎo)的HUVECs miR-30a-3p表達(dá) 通過qRT-PCR，我們發(fā)現(xiàn)松香酸處理后，miR-30a-3p 表達(dá)明顯上調(diào)（見圖4A）。為進(jìn)一步研究松香酸是否通過miR-30a-3p 對(duì)缺氧誘導(dǎo)的HUVECs 的血管生成和遷移發(fā)揮作用，首先合成miR-30a-3p inhibitor 來抑制細(xì)胞miR-30a-3p 表達(dá)水平，見圖4B。

圖4 松香酸上調(diào)缺氧誘導(dǎo)的HUVECs miR-30a-3p 表達(dá)

2.5 松香酸通過上調(diào)miR-30a-3p 表達(dá)促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)的HUVECs 的血管生成和遷移 為了進(jìn)一步驗(yàn)證松香酸是否通過miR-30a-3p 促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)的HUVECs 的血管生成、遷移和傷口愈合，在松香酸處理的基礎(chǔ)上在細(xì)胞中抑制miR-30a-3p。結(jié)果顯示，抑制miR-30a-3p 后，由松香酸促進(jìn)的血管生成被逆轉(zhuǎn)、血管生成因子VEGFA 水平下降。此外，松香酸促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)的HUVECs 的遷移，能夠被miR-30a-3p inhibitor抑制。而NC 組與松香酸組相比則無明顯變化。見圖5。

圖5 松香酸通過miR-30a-3p 促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)的HUVECs 的血管生成和遷移

3 討論

AMI 的主要特征是動(dòng)脈粥樣斑塊破裂和急性動(dòng)脈閉塞，殘留血管的再循環(huán)和快速血管生成是心肌梗死后心臟修復(fù)的關(guān)鍵[8]。血管生成與創(chuàng)傷愈合、肉芽組織形成和胚胎發(fā)生等各種生理和病理過程有關(guān)，其能夠通過促進(jìn)新毛細(xì)血管的生成，恢復(fù)缺血組織的血液流動(dòng)，進(jìn)而促進(jìn)心肌再生[9]。因此，可以通過促進(jìn)血管生成治療心血管疾病。血管內(nèi)皮細(xì)胞是一種單層，形狀不規(guī)則呈多邊形的細(xì)胞，覆蓋于內(nèi)膜表面，位于血管與血管內(nèi)皮之間，且具有通透性、選擇性、凝血、纖溶和血液運(yùn)輸能力，參與血管活性物質(zhì)的代謝和調(diào)控，產(chǎn)生生長(zhǎng)因子和纖維增生，影響血管的生成[10]。同時(shí)心肌缺氧也是導(dǎo)致AMI 的主要原因之一，因此本研究以HUVECs 為研究對(duì)象，通過構(gòu)建細(xì)胞缺氧模型來模擬體外AMI。內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移是血管生成的兩個(gè)重要環(huán)節(jié)，因此缺氧誘導(dǎo)后，通過Matrigel 小管形成實(shí)驗(yàn)、Transwell 及傷口愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了HUVECs 的血管生成和遷移功能變化，結(jié)果顯示該功能被抑制。

松香酸具有抗炎癥、抗過敏、類植物抗毒素和抗驚厥的活性，Park 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，松香酸能夠通過激活ERK 和p38 MAPKs 來促進(jìn)HUVECs 細(xì)胞遷移和血管形成。因此，松香酸或許能夠通過影響血管生成，從而調(diào)節(jié)心血管功能，但目前在此方面研究較少。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，松香酸可以促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)的HUVECs 的血管生成和遷移，并上調(diào)血管生成因子VEGFA 的表達(dá)。

miRNA 是一類與靶mRNA 結(jié)合的非編碼小RNA，導(dǎo)致靶蛋白的抑制，同時(shí)也在內(nèi)皮細(xì)胞和血管生成的許多功能中發(fā)揮重要作用[12]，進(jìn)而對(duì)機(jī)體的某些功能產(chǎn)生影響。已有研究證明，心血管疾病可引起機(jī)體內(nèi)特定miRNA 表達(dá)水平的變化，因此某些特異性的miRNA 可能在心血管疾病的診斷和預(yù)防中發(fā)揮關(guān)鍵作用。miR-30a-3p 是進(jìn)化保守的miR-30a 家族的成員之一，已被證實(shí)是多種細(xì)胞類型中重要的調(diào)節(jié)因子，具有抗增殖、促凋亡和抗炎活性[13]。Volkmann 等[6]的研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）通過下調(diào)miR-30a-3p 損傷內(nèi)皮血管生成。本研究發(fā)現(xiàn)，松香酸可以促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)的HUVECs 中miR-30a-3p 的表達(dá)。為進(jìn)一步明確松香酸是否通過miR-30a-3p 調(diào)節(jié)HUVECs 的血管生成和組織遷移，將miR-30a-3p 抑制劑miR-30a-3p inhibitor 及其對(duì)照miRNA NC 轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)，檢測(cè)血管生成及組織遷移的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-30a-3p 被抑制后，松香酸促進(jìn)HUVECs 的血管生成和遷移的作用被削弱，根據(jù)結(jié)果可以推測(cè)，松香酸可能通過上調(diào)miR-30a-3p 表達(dá)促進(jìn)缺氧情況下HUVECs 的血管生成和遷移能力。