老年自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血患者M(jìn)THFR C677T基因多態(tài)性與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤相關(guān)性分析

吉潔，江曄，羅聰，吳少帥，畢永延，徐福林，李小六

1.復(fù)旦大學(xué)附屬閔行醫(yī)院（上海市閔行區(qū)中心醫(yī)院）康復(fù)醫(yī)學(xué)科，上海 201199；2.復(fù)旦大學(xué)附屬閔行醫(yī)院（上海市閔行區(qū)中心醫(yī)院）神經(jīng)外科，上海 201199

顱內(nèi)動(dòng)脈瘤（IAs）是1 種危及生命的疾病，需要緊急醫(yī)療救治。蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH）是IAs 破裂最常見的臨床表現(xiàn)［1］。高齡是動(dòng)脈瘤生長(zhǎng)和破裂的重要危險(xiǎn)因素，而有研究報(bào)道年齡與動(dòng)脈瘤破裂呈明顯相關(guān)性［2-3］。老年患者動(dòng)脈瘤破裂后更容易出現(xiàn)不良預(yù)后，給社會(huì)和家庭帶來了沉重的負(fù)擔(dān)［4］。流行病學(xué)研究表明，SAH 的發(fā)病率隨著年齡的增長(zhǎng)而不斷增加，老年患者SAH 的發(fā)病率是普通人群的3～4 倍［1］，這就突顯了自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血老年患者動(dòng)脈瘤破裂風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的重要性［5］。然而，數(shù)字減影腦血管造影（DSA）等影像學(xué)檢查手段因其特殊性往往在臨床應(yīng)用中有一定的局限性。亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）C677T 是677 位點(diǎn)的點(diǎn)突變（胸腺嘧啶核苷酸取代半胱氨酸），這個(gè)點(diǎn)突變使MTHFR 失去甲基化同型半胱氨酸（Hcy）的作用，影響了Hcy 正常代謝過程，因而在體內(nèi)積聚，導(dǎo)致高同型半胱氨酸血癥（HHcy）［6］。臨床上血液標(biāo)本易于采集，指標(biāo)檢測(cè)簡(jiǎn)單易行，HHcy 是IAs 發(fā)生發(fā)展的危險(xiǎn)因素，而且MTHFR 基因是Hcy 代謝進(jìn)程中再甲基化途徑的關(guān)鍵酶［7-8］，本研究擬探討老年自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血患者血清MTHFR C677T 的多態(tài)性與IAs 的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 一般資料

經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬閔行醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，收集2018年1月—2021年12月期間在復(fù)旦大學(xué)附屬閔行醫(yī)院（上海市閔行區(qū)中心醫(yī)院）確診為自發(fā)性SAH 蛛網(wǎng)膜下腔出血的老年住院患者90 例作為觀察組（老年顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂組62 例、老年非動(dòng)脈瘤SAH組28 例），另選取90 例門急診頭顱CT 排除SAH 的人群作為對(duì)照組。所有患者年齡60～96 歲、平均（72.3 ±10.6）歲，其中男性103 例，女性77 例；老年顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂組年齡60～91 歲、平均（76.1 ±12.9）歲，其中男性37 例，女性25 例；老年非動(dòng)脈瘤SAH 組年齡62～94歲、平均（73.4 ±10.8）歲，其中男性18 例，女性10 例；對(duì)照組患者年齡64～96 歲、平均（70.6±8.5）歲，其中男性48 例，女性42 例。

入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）觀察組：≥60 歲自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血患者（男女不限），根據(jù)DSA 檢查明確有/無(wú)IAs 分為老年顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂組、老年非動(dòng)脈瘤SAH組；（2）對(duì)照組：隨機(jī)入選同期門急診頭顱CT 排除SAH 的人群 體檢正常人群，年齡、性別等基礎(chǔ)資料與觀察組相匹配。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）有外傷史；（2）有惡性腫瘤、動(dòng)脈瘤病史；（3）2 周內(nèi)服用B 族維生素或抗癲癇藥物等；（4）有嚴(yán)重的精神疾患、意識(shí)障礙或其他原因不能/不愿配合治療者。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 血漿Hcy 檢測(cè)入組的研究對(duì)象分別采集空腹外周靜脈血5 mL，置于EDTA 抗凝試管，充分搖勻后保存于40 ℃溫箱。標(biāo)本經(jīng)3 000 r/min 離心分離血漿。采用循環(huán)酶法來測(cè)定Hcy 含量，根據(jù)分組記錄數(shù)據(jù)，并根據(jù)檢測(cè)數(shù)值分層為血清高Hcy 水平（＞15 μmol/L）和血清低Hcy 水平（＜15 μmol/L）。Hcy 參考范圍正常為5～5 μmol/L。

1.2.2 MTHFR 基因分型入組的研究對(duì)象分別采集空腹外周靜脈血2 mL，EDTA 抗凝處理，后經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)所得標(biāo)本。依據(jù)人MTHFR基因多態(tài)性檢測(cè)試劑盒操作說明提取血液基因組，LightCycler480（羅氏）熒光定量PCR 平臺(tái)使用PCR-熒光探針法體外檢測(cè)人外周血基因組DNA 中MTHFR基因C677T 多態(tài)性位點(diǎn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，行t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例和百分率表示，行χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組人群MTHFR C677T 基因型分布情況比較

分別計(jì)算3 組研究對(duì)象中純合突變型（TT 型）、雜合突變型（CT 型）、野生型（CC 型）在組內(nèi)所占百分比，采用χ2檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析：自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血老年患者M(jìn)THFR C677T TT 型分布頻率較對(duì)照組高，CC 型較對(duì)照組低，且3 組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；CT 型分布頻率在3 組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 MTHFR C677T 基因型頻率分布比較［例（%）］

2.2 顱內(nèi)動(dòng)脈瘤與MTHFR C677T 的TT 型的關(guān)系

分別計(jì)算各組MTHFR C677T 的TT 型在組內(nèi)所占百分比；采用χ2檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析：（1）老年顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂組患者M(jìn)THFR C677T 的純合突變型（TT型）分布頻率高于老年非動(dòng)脈瘤SAH 組、老年正常對(duì)照組患者。見表2。

表2 MTHFR C677T 的TT 型與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤關(guān)系比較

2.3 不同血清Hcy 水平下MTHFR C677T TT 基因型分析

首先根據(jù)血清Hcy 水平分別將3 組人群進(jìn)行分層；然后分別計(jì)算3 組研究對(duì)象中TT 型、CT 型、CC型在各層中所占百分比。采用χ2檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析比較各層人群中MTHFR C677T 各型頻率分布情況。MTHFR C677T 的TT 型分布頻率顯示：血清高Hcy 組高于低Hcy 組，且結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。雜合突變型CT 型、野生型CC 型在各層中頻率分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 MTHFR C677T 的TT 型頻率分布與Hcy 水平關(guān)系［例（%）］

3 討論

IAs 是位于腦主干分支動(dòng)脈的病理擴(kuò)張，有害的血流動(dòng)力學(xué)因素，如血流動(dòng)力學(xué)應(yīng)激和血管危險(xiǎn)因素（包括高血壓、脂質(zhì)積累、動(dòng)脈硬化和吸煙），以及遺傳傾向，都參與了動(dòng)脈瘤形成的過程［9］。IAs 破裂會(huì)導(dǎo)致SAH，而大多數(shù)關(guān)于IAs 形成的研究數(shù)據(jù)來自于不同部位動(dòng)脈瘤破裂的SAH 患者，這個(gè)亞群比一般人群更容易被確診為IAs［9］。老年IAs 破裂的處理仍然是腦血管疾病治療中的一個(gè)主要挑戰(zhàn)［1］。

遺傳因素在IAs 的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，編碼血管壁成分或參與血管生成和血管重構(gòu)的基因多態(tài)性被認(rèn)為與腦動(dòng)脈瘤的形成有關(guān)［10］。Hcy 是由蛋氨酸代謝而來的一種含硫的非蛋白原性氨基酸，其血漿水平為5～10 μM，高于15 μM 為HHcy［8］。由于其容易造成人體血管內(nèi)血栓形成并積聚、參與血管內(nèi)皮損傷造成微血管結(jié)構(gòu)病理變化，已成為心腦血管疾病發(fā)病的重要誘發(fā)因素［8］。據(jù)報(bào)道，影響Hcy 代謝的基因多態(tài)性不僅可促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化、缺血性中風(fēng)、頸動(dòng)脈夾層和腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)生［11-13］，也與IAs 的發(fā)生相關(guān)［7］。動(dòng)物研究證明，富含蛋氨酸的飲食誘導(dǎo)的HHcy 加速了大鼠腦動(dòng)脈瘤的形成，這可能是通過對(duì)血管壁建模關(guān)鍵分子表達(dá)的差異效應(yīng)［14］。在1 項(xiàng)針對(duì)中國(guó)漢族人群的隊(duì)列研究中，HHcy 被證實(shí)是IAs 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［15］。

MTHFR C677T 多態(tài)性T 等位基因純合的個(gè)體具有HHcy 表型［8］。它定位于1 號(hào)染色體短臂末端（1p36.6），且對(duì)葉酸代謝有重要意義。正常代謝中，在維生素B12 和葉酸存在的情況下，MTHFR 通過參與Hcy 代謝從而將Hcy 水平維持在正常范圍［16］。有研究顯示MTHFR C677T 基因第4 外顯子突變時(shí)，導(dǎo)致密碼子222 處纈氨酸轉(zhuǎn)化為丙氨酸，從而降低了該酶的活性，使得Hcy 再甲基化通路受阻，易形成HHcy［17］。純合子突變的受試者Hcy 水平較高，而雜合子突變的受試者Hcy 水平較正常、未突變的對(duì)照組略有升高［18-20］。鑒于這種多態(tài)性對(duì)患者發(fā)病率和死亡率的影響，其重要性日益增強(qiáng)，作為未來健康教育的一部分，有必要采取進(jìn)一步的預(yù)防策略和營(yíng)養(yǎng)建議，以控制血漿Hcy 水平升高造成的心腦血管病理?yè)p害［6］。

Hcy 代謝進(jìn)程中，MTHFR C677T 發(fā)揮著重要的代謝酶的作用，二者關(guān)系密切。MTHFR C677T 多態(tài)性與多種疾病有關(guān)，比如顱內(nèi)動(dòng)脈瘤、顱內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化性狹窄、頸動(dòng)脈狹窄、頸動(dòng)脈夾層、冠心病、主動(dòng)脈夾層和主動(dòng)脈瘤等都有一定的相關(guān)性。MTHFR C677T 多態(tài)性檢測(cè)適用范圍廣泛，并且有越來越多的相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)表。本研究的目的是檢驗(yàn)影響Hcy 代謝的MTHFR C677T 基因多態(tài)性和IAs 之間的相關(guān)性，這可能有助于老年患者動(dòng)脈瘤破裂的評(píng)估。老年患者往往具有多種基礎(chǔ)性疾病，本研究制定排除標(biāo)準(zhǔn)將惡性腫瘤、動(dòng)脈瘤病史排除在外，并且將老年人常見的高血壓、心臟病、糖尿病、高血脂、年齡、性別等基礎(chǔ)資料與觀察組相匹配。在本次研究收集了年齡≥60歲的老年自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血患者血液標(biāo)本，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)、統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，老年顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂組MTHFR C677T 的TT 型分布頻率高于老年非動(dòng)脈瘤SAH組、老年正常對(duì)照組；而CC 型分布頻率低于老年非動(dòng)脈瘤SAH 組、老年正常對(duì)照組；CT 型分布頻率則與老年非動(dòng)脈瘤SAH 組、老年正常對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然而，MTHFR CT 基因型與IAs 是否也有相關(guān)性，文獻(xiàn)報(bào)道不一，本研究析這種差異的原因可能有兩點(diǎn)：一是受試人群存在地區(qū)差異，二是需進(jìn)一步提高數(shù)據(jù)樣本量。為了進(jìn)一步驗(yàn)證本研究結(jié)論的準(zhǔn)確性，本研究分析了MTHFR C677T 基因多態(tài)性頻率分布與血清Hcy 的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清高Hcy 組TT 型頻率分布高于低Hcy 組，提示MTHFR C677T TT 型與血清Hcy 的表達(dá)水平相關(guān)，而血清Hcy 代謝密切影響人體心腦血管性疾病。所以，本研究為MTHFR C677T 的TT 型預(yù)測(cè)IAs 的敏感度與血清高Hcy 水平具有一致性。當(dāng)然，本研究選擇的老年自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血人群本身可能存在著選擇偏倚，研究樣本量也存在一定局限，并且本研究對(duì)象為破裂的動(dòng)脈瘤，并沒有涉及未破裂動(dòng)脈瘤，所以也存在一定需要進(jìn)步研究的問題，在MTHFR C677T 的TT 型與IAs 相關(guān)性的后期研究中會(huì)進(jìn)一步改善。

綜上述，本研究發(fā)現(xiàn)患者血清MTHFR C677T 的TT 型與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤有相關(guān)性，其可能是IAs 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，對(duì)于顱內(nèi)動(dòng)脈瘤易感人群有非常好的健康教育意義。