雷軍
綿陽師范學(xué)院化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院(綿陽 621000)
醬油是我國傳統(tǒng)的調(diào)味品,因其獨(dú)特的風(fēng)味、色澤及豐富的營養(yǎng)價(jià)值,已成為我國、日韓、東南亞各國乃至歐美人民飲食生活中不可或缺的調(diào)味品[1]。甜菊糖苷和甜菊雙糖苷是一類來源于甜葉菊葉片的四環(huán)二萜類糖苷物質(zhì),被稱為繼甘蔗、甜菜之后,第三類健康綠色糖源[2-3]。甘草酸和甘草次酸等三萜類化合物是甘草的主要成分,也是甘草甜味的主要來源[4]。近年來,在醬油中陸續(xù)檢出甜菊糖苷、甜菊雙糖苷、甘草酸、甘草次酸等物質(zhì)。這類物質(zhì)加入醬油中,可抑制鹽味和苦味,增加醬油的風(fēng)味[5]。但是甜菊糖苷加入醬油中有限量要求、甜菊雙糖苷和甘草次酸并未進(jìn)入食品添加劑管理[6],若在加工過程中為了改善醬油口感超限量、超范圍添加此類物質(zhì),對(duì)人身體有一定的損害。目前,檢測其中一種或兩種成分的方法有薄層色譜法[7]、高效液相色譜法[8]、液質(zhì)聯(lián)用法[9],同時(shí)檢測這4種組分的方法只有高效液相色譜法[10],這種方法存在靈敏度不高、假陽性以及甜菊糖苷和甜菊雙糖苷色譜峰未完全分開的問題[10],導(dǎo)致無法對(duì)這4種物質(zhì)準(zhǔn)確定性及甜菊糖苷和甜菊雙糖苷準(zhǔn)確定量。
針對(duì)以上問題,試驗(yàn)建立了同時(shí)測定醬油中的甜菊糖苷、甜菊雙糖苷、甘草酸、甘草次酸的LC-MS/MS法。在提高此類物質(zhì)定性能力的同時(shí)可以實(shí)現(xiàn)甜菊糖苷、甜菊雙糖苷完全分離并實(shí)現(xiàn)甜菊糖苷和甜菊雙糖苷準(zhǔn)確定量。
甲醇(色譜純,北京百靈威科技有限公司);乙醇(色譜純,北京百靈威科技有限公司);乙酸乙酯(色譜純,賽默飛世爾科技有限公司);甲酸(色譜純,成都市科隆化學(xué)品有限公司);無水硫酸鎂(分析純,成都市科隆化學(xué)品有限公司);C18粉末(批號(hào):W103678,納譜分析技術(shù)有限公司);甜菊糖苷標(biāo)準(zhǔn)品(天津阿爾塔科技有限公司CAS:57817-89-7 99.7%)、甜菊雙糖苷標(biāo)準(zhǔn)品(天津阿爾塔科技有限公司 CAS:41093-60-1 99.8%)、甘草酸標(biāo)準(zhǔn)品(天津阿爾塔科技有限公司 CAS:1405-86-3 80.6%)、甘草次酸標(biāo)準(zhǔn)品(天津阿爾塔科技有限公司 CAS:471-53-4 99.9%)。
DGU20A-API4500高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國AB SCIEX公司);FA124型電子天平(上海市舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司);TGL-16型臺(tái)式高速離心機(jī)(四川蜀科儀器有限公司);SHA-B水浴恒溫培養(yǎng)振蕩器(常州冠軍儀器制造有限公司);KQ-700型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);ZH-2型旋渦儀(天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠)。
液相色譜柱:ZORBAX Eclipse Plus C184.6 mm×150 mm 3.5 μm;進(jìn)樣體積:10 μL;流速:0.3 mL/min;柱溫:40 ℃;流動(dòng)相:A:甲醇;B:0.1%甲酸。
DGU20A-API4500液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀,質(zhì)譜參數(shù):ESI正負(fù)離子同時(shí)掃描。離子源溫度:400 ℃;離子源電壓:4 500 V;CUR:20 psi;CAD:5 psi;GS1:30 psi;GS2:30 psi;多反應(yīng)監(jiān)測參數(shù)如表2所示。
表1 梯度洗脫
表2 多反應(yīng)監(jiān)測
1.5.1 4種甜味劑準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備
精確稱取10 mg甜菊糖苷標(biāo)準(zhǔn)品、甜菊雙糖苷標(biāo)準(zhǔn)品、甘草酸標(biāo)準(zhǔn)品、甘草次酸標(biāo)準(zhǔn)品至4個(gè)10 mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,此溶液4種甜味劑的質(zhì)量濃度為1 mg/mL,冷藏保存。
1.5.2 4種甜味劑標(biāo)準(zhǔn)混合中間液的制備
準(zhǔn)確移取甜菊糖苷、甜菊雙糖苷、干草酸、甘草次酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各0.01 mL至10 mL容量瓶中,用甲醇稀釋并定容至刻度,此混合溶液中4種甜味劑的質(zhì)量濃度為1 μg/mL。
1.5.3 4種甜味劑混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備
分別稱取6份空白醬油樣品各2.0 g(精確至0.01 g)置于25 mL離心管中,準(zhǔn)確移取0.0,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8和1.0 mL甜菊糖苷、甜菊雙糖苷、干草酸、甘草次酸標(biāo)準(zhǔn)混合中間液,按照1.6小節(jié)進(jìn)行提取和凈化,配成質(zhì)量濃度為0,4,8,16,24,32和40 ng/mL的混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液。
1.6.1 提取
稱取2.0 g(精確至0.01 g)混勻后的醬油試樣置于25 mL塑料離心管中,加入10 mL甲醇、4 g無水硫酸鎂、2 g C18粉末,旋渦1 min,振蕩提取10 min,超聲提取10 min,按10 000 r/min離心5 min,取上清液置于另一25 mL塑料離心管,重復(fù)上述步驟,合并兩次上清液,用甲醇定容至25 mL,待凈化。
1.6.2 凈化
取1 mL上述待凈化溶液至于10 mL塑料離心管中,加入100 mg無水硫酸鎂、50 mg C18粉末,渦旋混合2 min,按10 000 r/min離心5 min,過0.22 μm有機(jī)相微孔濾膜,濾液供上機(jī)分析。
根據(jù)4種甜味劑的特性,試驗(yàn)依此選擇水、乙醇、甲醇、乙酸乙酯為提取溶劑,以質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為100 μg/kg的甜菊糖苷、甜菊雙糖苷、干草酸、甘草次酸為質(zhì)控樣,按照1.6小節(jié)供試液的制備步驟,比較測得的含量。
采用1.7小節(jié)確定的提取溶劑,按照1.6.1小節(jié)的提取步驟,以質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為100 μg/kg的甜菊糖苷、甜菊雙糖苷、干草酸、甘草次酸為質(zhì)控樣,提取1,2,3和4次,其余步驟同1.6小節(jié),比較測得的含量。
將4種甜味劑標(biāo)準(zhǔn)混合中間液注入液質(zhì)聯(lián)用儀,分別記錄這4種物質(zhì)的一級(jí)質(zhì)譜圖,分別選取特異性強(qiáng)的監(jiān)測模式作為試驗(yàn)中甜菊糖苷、甜菊雙糖苷、干草酸、甘草次酸的監(jiān)測模式。
稱取9份2.0 g混勻后的空白醬油試樣于25 mL塑料離心管,3份為一組,分別加入0.1,0.4和0.8 mL甜菊糖苷、甜菊雙糖苷、干草酸、甘草次酸標(biāo)準(zhǔn)中間溶液,按照1.6小節(jié)供試品溶液制備方法操作,配制成為50,200和400 μg/kg的甜菊糖苷、甜菊雙糖苷、干草酸、甘草次酸質(zhì)控樣。
稱取6份2.0 g混勻后的空白醬油試樣于25 mL塑料離心管,按照1.6小節(jié)樣品制備方法,配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100 μg/kg的甜菊糖苷、甜菊雙糖苷、干草酸、甘草次酸質(zhì)控樣。將上述6份溶液注入液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀,測得甜菊糖苷、甜菊雙糖苷、干草酸、甘草次酸的峰面積,分別代入各自基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算濃度及SRSD值,即得精密度結(jié)果。
由表3可知,4種甜味劑在0~40 ng/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)R均>0.99。表明這4種甜味劑在0~40 ng/mL范圍內(nèi)線性良好。故選用0~40 ng/mL為試驗(yàn)的線性范圍。
表3 4種甜味劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線
由圖1可知,甘草次酸在水溶液中溶解度較小,甘草酸在乙醇中難溶,除了甘草次酸,其余三種化合物在乙酸乙酯中的溶解度均較小。這四種化合物在甲醇中均有很好的溶解性??赡艿脑蚴巧鲜鋈軇┑臉O性不同,化合物按照“相似相溶”原則,在每種溶液中溶解度不同。綜上,選擇甲醇為試驗(yàn)的提取溶劑。
圖1 不同提取溶劑的考察
由圖2可知,這四種化合物在僅提取一次的情況下,測得值均在80 μg/kg左右,不能提取完全,提取2次以上的測得值明顯高于僅提取一次的測得值,且隨著提取次數(shù)的增加,測得值無明顯提升,考慮到操作的簡便性、經(jīng)濟(jì)性以及環(huán)保等因素,試驗(yàn)選擇提取2次。
圖2 不同提取次數(shù)的考察
由圖3~圖4可知:4種甜味劑在負(fù)模式下均有響應(yīng),甘草酸在正模式下沒有響應(yīng);甜菊糖苷和甜菊雙糖苷在正模式下以加鈉峰的形式出現(xiàn)。由圖5~圖6可知:甜菊糖苷在負(fù)模式下同時(shí)出現(xiàn)803.5和641.4兩個(gè)分子離子峰,嚴(yán)重干擾甜菊雙糖苷的分子離子峰,這與朱靜雯等[11]研究結(jié)果相同。為避免干擾,甜菊糖苷、甜菊雙糖苷選取正模式的監(jiān)測模式;甘草酸、甘草次酸選擇負(fù)模式的監(jiān)測模式。
圖3 4種物質(zhì)負(fù)模式下的一級(jí)質(zhì)譜圖
圖4 4種物質(zhì)正模式下的一級(jí)質(zhì)譜圖
圖5 甜菊糖苷負(fù)模式下的一級(jí)質(zhì)譜圖
圖6 甜菊糖苷負(fù)模式下的一級(jí)質(zhì)譜圖
由表4可知,甜菊糖苷、甜菊雙糖苷、甘草酸、甘草次酸在50,200和400 μg/kg回收率依次在90.5%~94.9%,87.7%~94.6%,86.9%~97.3%和87.1%~96.5%之間,滿足試驗(yàn)要求。
表4 不同濃度下4種甜味劑回收率結(jié)果
由表5可知,4種甜味劑用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差SRSD表示,SRSD<5%。表明此方法的精密度良好,符合要求。
表5 4種甜味劑精密度結(jié)果(n=6)
試驗(yàn)建立了同時(shí)測定醬油中甜菊糖苷、甜菊雙糖苷、甘草酸、甘草次酸的LC-MSMS法,優(yōu)化了試驗(yàn)的提取溶劑及次數(shù),考察了方法的線性方程、監(jiān)測模式、專屬性、檢出限、定量限、方法回收率以及精密度。該方法的監(jiān)測模式為甜菊糖苷、甜菊雙糖苷正模式;甘草酸、甘草次酸為負(fù)模式。該方法具有操作簡單、定性能力強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn),解決了現(xiàn)有液相方法定性能力不強(qiáng)、甜菊糖苷和甜菊雙糖苷因無法完全分開導(dǎo)致的定量不準(zhǔn)確的問題。