4種周年輪作模式對(duì)耕作層土壤微生物的影響

張河慶，吳 婕，韓 帥，席亞東，李躍建，梁根云

（1四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西南作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610066；2四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所/蔬菜種質(zhì)與品種創(chuàng)新四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610066）

0 引言

土壤微生物與植物密切相關(guān)，有些微生物能夠幫助植物獲取營(yíng)養(yǎng)，阻止病原菌侵染寄主、提高植物抗逆能力和免疫力[1]；同樣，植物也影響土壤微生物，植物根系接受和識(shí)別土壤微生物發(fā)出的化學(xué)信號(hào)，然后以分泌物形式作出反應(yīng)，進(jìn)而影響土壤微生物[2]。因此，研究不同輪作模式下土壤微生物的變化對(duì)蔬菜可持續(xù)生產(chǎn)具有重要意義。

土壤微生物對(duì)植物有益的方面主要包括以下4種：（1）幫助植物吸收養(yǎng)分，如王孝林等[3]研究表明，秈稻根際特異微生物群體能夠提高土壤中有機(jī)氮的利用率，促進(jìn)水稻生長(zhǎng)，叢枝菌根真菌能夠促進(jìn)植物對(duì)土壤中磷元素的吸收[4]。（2）促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育，研究表明有益微生物可產(chǎn)生吲哚乙酸、赤霉素、玉米素等物質(zhì)促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育[5]。（3）提高植物抗逆能力。土壤微生物能夠提高植物的抗旱性、耐熱性、耐鹽性等方面能力，如根際細(xì)菌中產(chǎn)生的ACC脫氨酶能夠幫助植物應(yīng)對(duì)鹽脅迫，根際微生物協(xié)助煙草應(yīng)對(duì)干旱等[5-7]。（4）增強(qiáng)植物免疫力，阻止病原菌浸染，土壤微生物通過抑制病原菌來增強(qiáng)植物的抗病性和適應(yīng)性，這是土壤微生物增強(qiáng)植物免疫力的一種重要機(jī)制[8-9]。通常具有抑病能力的土壤微生物群落能夠產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，豐富的拮抗細(xì)菌能夠通過競(jìng)爭(zhēng)和抑制作用減少病原真菌，如細(xì)菌次級(jí)代謝產(chǎn)物DAPG（2,4-二乙基間苯三酚）和PRN（吡咯素）是已知有效抑制土壤病原真菌的抗菌物質(zhì)[10]。

有很多種因素能夠引起土壤微生物變化，進(jìn)而影響土壤病原菌；其中一種重要的因素是植物，不同植物從土壤中吸收和分泌的物質(zhì)不同，改變了根際的化學(xué)、物理或生物特征進(jìn)而影響病原菌種群[1]。因此可以通過選擇植物來管理土壤微生物，輪作能夠增加作物多樣性，提高土壤微生物群落的多樣性，改善土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，是這種理論在田間應(yīng)用的一種具體管理措施[11]。輪作導(dǎo)致作物增產(chǎn)的機(jī)制在很大程度上還是未知的?？赡艿囊环N機(jī)制是增加作物多樣性減少了土壤病原菌數(shù)量。如Bennett等[1]研究表明，非寄主作物輪作時(shí)，病原菌豐富下降，這種變化可能跟作物多樣性促進(jìn)植物—病原菌—抑制微生物之間的關(guān)系相關(guān)。

不同輪作模式對(duì)土壤微生物群落影響的研究還比較少，筆者結(jié)合四川生產(chǎn)實(shí)際設(shè)計(jì)了4種輪作模式，開展長(zhǎng)期輪作試驗(yàn)，研究不同作物輪作模式對(duì)土壤微生物多樣性的影響，以期為生產(chǎn)中制定輪作模式提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 輪作試驗(yàn)田間設(shè)計(jì)

試驗(yàn)田塊位于四川省成都市新都區(qū)泰興鎮(zhèn)四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)園區(qū)，土質(zhì)為壤土；2011年夏季種水稻，冬季種植紅薯；從2012年開始選取了茄果類（番茄）、禾本科（水稻）、菊科（萵筍）、豆類（四季豆）、蔥蒜類（大蒜）等不同種類作物與黃瓜輪作，輪作模式如下：水旱輪作模式(SH)：黃瓜—水稻—萵筍；蔬菜輪作LD模式(LD)：黃瓜—番茄—萵筍；嫁接模式(JJ)：嫁接黃瓜—嫁接番茄—萵筍；蔬菜連輪LZ模式(LZ)：黃瓜—四季豆—大蒜。每個(gè)模式設(shè)4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)小區(qū)面積為50 m2，每個(gè)小區(qū)四周用水泥墻間隔，避免小區(qū)間的相互影響。各輪作模式間的施肥、灌水等田間管理水平均一致。

1.2 土壤樣品采集與黃瓜枯萎病調(diào)查

于黃瓜收獲時(shí)調(diào)查黃瓜枯萎病的發(fā)病率，并采取耕作層(0～20 cm)土壤，每小區(qū)5點(diǎn)取樣法采樣，每小區(qū)土樣用孔徑2 mm篩過篩，充分混合后分裝，用液氮速凍后送實(shí)驗(yàn)室-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 土壤DNA提取及測(cè)序分析

1.3.1 DNA抽提與PCR擴(kuò)增 根據(jù)E.Z.N.A.?soil試劑盒(Omega Bio-tek,Norcross,GA,U.S.)說明書進(jìn)行土壤總DNA提取，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量；細(xì)菌用引物338F：ACTCCTACGG GAGGCAGCA 和 806R：GGACTACHVGGGT WTCTAAT對(duì)16S rDNA的V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；真菌用引物ITS1F：CTTGGTCATTTAGA GGAAGTAA和ITS2：GCTGCGTTCTTC ATCGATGC對(duì)ITS1區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.3.2 高通量測(cè)序 2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物后，利用 AxyPrep DNA GelExtraction Kit(Axygen Biosciences,Union City,CA,USA)進(jìn)行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測(cè)。利用Quanti Fluor?-ST(Promega,USA)進(jìn)行檢測(cè)定量。根據(jù)Illumina MiSeq平臺(tái)(Illumina,San Diego,USA)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建文庫，細(xì)菌為PE 2*300文庫，真菌為PE2*250文庫。用Illumina公司的Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序（百邁克生物科技有限公司）。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理 原始測(cè)序序列使用Trimmomatic軟件質(zhì)控，使用FLASH軟件進(jìn)行拼接，采用UPARSE軟件(version 7.1 http://drive5.com/uparse/)，根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行OTU(operational taxonomicunit)聚類；應(yīng)用UCHIME軟件剔除嵌合體。利用RDP classifier(http://rdp.cme.msu.edu/)對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類注釋，比對(duì)Silva數(shù)據(jù)庫(SSU123)，設(shè)置比對(duì)閾值為70%。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010和SPSS 16.0軟件對(duì)微生物相對(duì)豐度進(jìn)行計(jì)算分析和統(tǒng)計(jì)分析，測(cè)序數(shù)據(jù)在百邁克生物科技有限公司提供的BMKCloud生物云計(jì)算平臺(tái)進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同輪作模式對(duì)黃瓜枯萎病的影響

由圖1可知，LD輪作模式下黃瓜枯萎病的發(fā)病率(19.87±6.96%)顯著高于其他3種輪作模式的。嫁接模式下黃瓜枯萎病發(fā)病率最低為1.7±1.7%。

圖1 不同栽培模式下黃瓜枯萎病的發(fā)生率

2.2 土壤微生物群落Alpha多樣性分析

由表1可知，SH輪作模式與LD模式相比，顯著提高了土壤細(xì)菌群落的豐富度和多樣性，4種模式間細(xì)菌群落豐富度指數(shù)呈現(xiàn)SH＞LZ＞JJ＞LD的趨勢(shì)，多樣性指數(shù)呈現(xiàn)SH＞JJ＞LZ＞LD的趨勢(shì)。4種模式間土壤真菌群落的豐富度無顯著差異，但呈現(xiàn)SH＞LZ＞LD＞JJ的趨勢(shì)；SH模式土壤真菌群落的多樣性顯著高于JJ和LZ的，而與LD模式的沒有顯著差異。JJ模式、LZ模式和LD模式間細(xì)菌和真菌群落豐富度和多樣性均無顯著差異。

表1 土壤微生物群落Alpha多樣性分析結(jié)果

2.3 樣品間差異分析（柱坐標(biāo)分析Principal Coordinate Analysis,PCoA）

為了比較不同輪作模式間土壤樣品中OTU組成差異，進(jìn)行了PCoA分析。由圖2可知，不同輪作模式顯著影響土壤微生物群落，用土壤真菌群落表示（R=0.844，P=0.001；圖 2A），用土壤細(xì)菌群落表示（R=0.792，P=0.001；圖2B）。輪作模式間，在真菌群落方面LD模式與JJ模式的樣品距離較近，集中在第二象限，SH模式的樣品集中在第一象限，LZ模式的樣品大多在第四象限。在細(xì)菌群落方面，JJ模式的樣品較分散，但總體與LD模式的樣品距離較近，大多分布在第一象限，SH模式的樣品則集中分布在第二象限，LZ模式的樣品大多分布在第三象限。

圖2 土壤微生物群落PCoA分析圖

2.4 土壤微生物群落結(jié)構(gòu)差異分析

由圖3A可知，不同輪作模式下的土壤真菌組成結(jié)構(gòu)不同。LD模式的土壤真菌群落以青霉菌屬(Penicillium)、枝孢菌屬(Cladosporium)和木霉菌屬(Trichoderma)為主，相對(duì)豐度為22.67%；SH模式的土壤真菌群落以被孢霉屬(Mortierella)、青霉菌屬(Penicillium)和木霉菌屬(Trichoderma)為主，相對(duì)豐度為30.59%；LZ以被孢霉屬(Mortierella)、青霉菌屬(Penicillium)和黑孢霉屬(Nigrospora)為主，相對(duì)豐度為 30.56% ；JJ以 青 霉 菌 屬(Penicillium)、Plectosphaerella和枝孢菌屬(Cladosporium)為主，相對(duì)豐度為39.09%。

圖3 土壤微生物在屬水平上的柱狀圖

由圖3B可知，不同輪作模式下的土壤細(xì)菌組成結(jié)構(gòu)不同。LD模式以Mizugakiibacter、o_Xanthomonadales、f_Acidobacteriaceae、Rhodanobacter為主，相對(duì)豐度為30.60% ；JJ 模 式 以 O_Xanthomonadales、Mizugakiibacter、f_Acidobacteriaceae、Rhodanobacter為主，相對(duì)豐度為26.81%；LZ模式以o_Xanthomonadales、f_Acidobacteriaceae、p_Acidobacteria、Mizugakiibacter為主，相對(duì)豐度為32.22%；SH模式以f_Acidobacteriaceae、o_Xanthomonadales、Mizugakiibacter、Sphingomonas、Rhodanobacter為主，相對(duì)豐度為24.97%。

2.5 土壤微生物組間物種豐富度差異顯著性分析

通過高通量測(cè)序拼接獲得各樣本基因序列數(shù)據(jù)，并與NCBI數(shù)據(jù)庫比對(duì)，共獲得133個(gè)屬的真菌，其中各輪作模式中最大平均相對(duì)豐度大于0.1%的真菌有66個(gè)屬。經(jīng)方差分析，JJ模式有1個(gè)屬真菌的相對(duì)豐度顯著低于其他3個(gè)模式的；LD和LZ模式分別有4個(gè)屬真菌的相對(duì)豐度顯著高于其他3個(gè)模式的；SH模式有7個(gè)屬真菌的相對(duì)豐度顯著高于其他3個(gè)模式的（表2）。

表2 輪作模式間有顯著差異的真菌屬

通過高通量測(cè)序拼接獲得各樣本基因序列數(shù)據(jù)，并與NCBI數(shù)據(jù)庫比對(duì)，共獲得373個(gè)屬的細(xì)菌，其中各輪作模式中最大平均相對(duì)豐度大于0.1%的細(xì)菌有158個(gè)屬。經(jīng)方差分析，JJ模式有1個(gè)屬細(xì)菌的相對(duì)豐度顯著低于其他3個(gè)模式的；LD和LZ模式分別有7個(gè)屬細(xì)菌的相對(duì)豐度顯著高于其他3個(gè)模式的；SH模式有36個(gè)屬細(xì)菌的相對(duì)豐度顯著高于其他3個(gè)模式的（表3）。

表3 輪作模式間有顯著差異的細(xì)菌屬

2.6 黃瓜枯萎病相關(guān)微生物相對(duì)分度差異分析

試驗(yàn)結(jié)果表明，黃瓜枯萎病病原菌鐮刀菌屬Fusarium在4種輪作模式無顯著差異。黃瓜枯萎病常見拮抗菌方面，SH模式的鏈霉菌屬Streptomyces相對(duì)豐度顯著高于LD和JJ模式的；LD模式的木霉菌屬Trichoderma相對(duì)豐度顯著高于其他3個(gè)模式的；而芽孢桿菌屬Bacillus的相對(duì)豐度在4個(gè)模式間無顯著差異。

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，4種輪作模式間土壤微生物群落的多樣性發(fā)生了顯著變化，SH與其他3種模式相比顯著提高了土壤微生物群落Alpha多樣性指數(shù)，說明黃瓜、水稻、萵筍輪作模式更利于提高土壤微生物群落多樣性和豐富度。這研究結(jié)果與其他報(bào)道一致，水旱輪作促進(jìn)了土壤微生物的多樣性，改變了土壤微生物群落的結(jié)果[12-13]。

圖4 黃瓜枯萎病相關(guān)微生物相對(duì)豐度

通過土壤微生物群落結(jié)構(gòu)分析和PCoA分析（圖2），可將4種輪作模式劃分為3個(gè)不同組，LD與JJ模式無論是屬水平微生物群落構(gòu)成還是PCoA分析結(jié)果均可以劃分為同一組，而SH和LZ模式間樣本的微生物群落構(gòu)成和PCoA分析結(jié)果均差異較大可分為兩組，這種劃分結(jié)果可能與輪作作物有關(guān)，LD與JJ模式輪作作物均為黃瓜、番茄、萵筍，雖然JJ模式為嫁接黃瓜和番茄，但是砧木與接穗為同科作物，輪作作物相近；而SH模式輪作作物為黃瓜、水稻、萵筍與LD模式相比改變了1種輪作作物，LZ模式輪作作物為黃瓜、四季豆、大蒜與LD模式相比改變了2種輪作作物。說明改變輪作作物能夠改變土壤微生物群落構(gòu)成，有研究表明植物根系分泌物促進(jìn)土壤微生物群落的形成[14-15]。黃瓜根系分泌物香豆酸、香草酸改變黃瓜根際細(xì)菌群落，影響假單胞菌和芽孢桿菌群落[16-17]；番茄根際中芽孢桿菌能優(yōu)先利用番茄根系分泌物蔗糖、麥芽糖、谷氨酸和蘋果酸作為碳源[18]；水稻根分泌物調(diào)控施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)的 pilK、metE、rpoN和fdhE等基因表達(dá)，影響施氏假單胞菌在水稻根系的定植[19]；豆類根系分泌物類黃酮能夠刺激慢生根瘤菌的定植，獨(dú)腳金內(nèi)酯能夠促進(jìn)叢枝真菌與根系建立共生關(guān)系[20]。

通過土壤微生物組間物種豐富度差異顯著性分析（表2、3）可知，SH模式有7個(gè)屬的真菌和36個(gè)屬的細(xì)菌顯著高于其他3種輪作模式的。其中Chitinophaga、芽單胞菌屬Gemmatimonas、硝化螺菌屬Nitrospira、鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas等能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高植物免疫能力[21-23]；Phycicoccus、Iamia、Patulibacter、Gaiella等屬于防線菌類，能夠產(chǎn)生抗生素幫助植物抵抗病原菌侵染[24-25]；LD模式中有4個(gè)屬的真菌和7個(gè)屬的細(xì)菌相對(duì)豐度顯著高于其他3個(gè)模式的，其中相對(duì)豐度最高的Mizugakiibacter屬與西瓜枯萎病的發(fā)病率呈正相關(guān)[26]，這與LD輪作模式下黃瓜枯萎病發(fā)病率率最高相一致（圖1）；LZ模式中有4個(gè)屬的真菌和7個(gè)屬的細(xì)菌相對(duì)豐度顯著高于其他3個(gè)模式的，其中慢生根瘤菌Bradyrhizobium是豆類共生固氮菌，能夠減少大豆猝死病，是一種潛在的生防制劑[27]，這可能與輪作作物四季豆有關(guān)；Granulicella為嗜酸性細(xì)菌[28]可能預(yù)示著LZ輪作后降低了土壤的pH。JJ模式輪作后僅有Methylobacterium屬的細(xì)菌相對(duì)豐度顯著高于其他3個(gè)輪作模式的，Methylobacterium為兼性甲基營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，對(duì)馬鈴薯晚疫病有抑制作用[29]。

4種輪作模式間黃瓜枯萎病病原菌相對(duì)豐度無顯著差異，但他們呈現(xiàn)的趨勢(shì)與黃枯萎發(fā)病率一致（圖1、4）。SH模式與LD模式相比降低了黃瓜枯萎并發(fā)病率和病原菌相對(duì)豐度，顯著提高了鏈霉菌相對(duì)豐度；這與Ping Fuhou等[13]研究結(jié)果一致，水旱輪作模式比旱地蔬菜輪作模式相比降低了黃瓜病害的發(fā)病率。LZ模式與LD模式相比也降低了黃瓜枯萎病發(fā)病率和病原菌相對(duì)豐度，但LZ模式中大蒜連續(xù)種植10年會(huì)出現(xiàn)連作障礙，導(dǎo)致土壤微生態(tài)結(jié)構(gòu)失衡[30]。JJ模式為嫁接模式，嫁接是解決黃瓜枯萎病的最有些措施，嫁接與非嫁接雖然沒有顯著提高土壤微生物多樣性，但降低了土壤中病原菌的相對(duì)豐度，這可能是嫁接減少黃瓜枯萎病發(fā)病率的原因之一。

4 討論

本研究結(jié)果表明，不同周年輪作模式能夠顯著影響耕作層土壤微生物群落的構(gòu)成和多樣性，改變輪作作物能夠改變耕作層土壤微生物群落。水旱輪作模式優(yōu)于蔬菜輪作模式，能夠降低黃瓜枯萎病發(fā)病率，顯著提高土壤細(xì)菌群落的多樣性，增加有益菌群的相對(duì)豐度。在土壤微生物層面揭示了水旱輪作有助于黃瓜生產(chǎn)的潛在機(jī)理，為生產(chǎn)中制定輪作模式提供了理論依據(jù)。