炭基肥與有機肥替代部分化肥對青紫泥水稻土微生物豐度及酶活性的影響

任 依，姜培坤，魯長根，邵建均，周雪娥，陳俊輝

（1.浙江農林大學 環(huán)境與資源學院，浙江 杭州 311300；2.浙江省農業(yè)農村生態(tài)與能源總站，浙江 杭州 310000；3.桐鄉(xiāng)市農業(yè)農村局，浙江 嘉興 314500）

稻田土壤是保障國家稻米供給的重要支撐[1]。稻田土壤微生物及相關胞外酶是有機質分解和養(yǎng)分循環(huán)的主要驅動力，可靈敏指示土壤質量和健康狀況，并對促進水稻Oryza sativa生長具有重要作用[2]。施肥是提高稻田土壤質量、保障水稻產量的主要方式，且與作物養(yǎng)分利用率、農田面源污染和微生物介導的溫室氣體排放存在密切聯(lián)系[3-4]。因此，研究施用不同類型肥料對土壤養(yǎng)分、微生物數(shù)量、酶活性的影響及其驅動的生物化學過程，對了解土壤質量變化及保障國家糧食安全和改善農業(yè)環(huán)境具有重要的意義。大量研究證明：盡管化肥能夠有效提高水稻產量，但長期過量施用化肥也會導致土壤酸化、作物養(yǎng)分利用率低，造成較為嚴重的環(huán)境污染和肥料浪費[5]。周曉陽等[6]研究發(fā)現(xiàn)：化肥的過量施用是導致水旱輪作下稻田土壤酸化和面源污染的重要原因。ZENG等[7]研究發(fā)現(xiàn)：長期過量施用氮肥不僅引起土壤結構和質量下降，而且進一步惡化了土壤微環(huán)境，降低了微生物多樣性，抑制了微生物活性和功能，進而阻礙了微生物介導的養(yǎng)分循環(huán)過程。因此，有必要尋求有效合理的施肥方法，減少面源污染，提高土壤肥力和微生物活性與功能，促進稻田土壤健康發(fā)展。

增施有機肥與有機肥替代部分化肥是減少化肥用量、改善土壤質量、維持養(yǎng)分平衡和降低環(huán)境污染的重要途徑之一[8]。溫延臣等[9]研究發(fā)現(xiàn)：有機肥替代部分化肥能協(xié)調有機無機養(yǎng)分平衡供應，保證作物產量。在氮磷鉀養(yǎng)分投入量相當?shù)那闆r下，有機肥替代化肥能夠提升土壤微生物量碳氮、水溶性碳氮的含量及其比例，提高水稻產量[10]。李小萌等[11]研究發(fā)現(xiàn)：施用有機肥可以改善土壤結構，增加土壤孔隙度，促進土壤微生物的生長和繁殖。炭基肥是利用物理或化學方法將生物質炭與氮、磷、鉀等養(yǎng)分通過一定比例混合而成的新型肥料，融合了生物質炭與肥料各自的優(yōu)點，因具備吸附能力強、養(yǎng)分釋放緩慢、肥效持久等特點而受到廣泛關注[12]。李春陽[13]研究發(fā)現(xiàn)：適量施用炭基肥能夠提升稻田土壤速效養(yǎng)分含量，增加土壤微生物數(shù)量。炭基肥與有機肥替代部分化肥對水稻產量的促進作用可能與有機物料分解促進養(yǎng)分緩慢釋放、提高微生物豐度和酶活性有密切關系。常棟等[14]研究表明：炭基肥能直接為微生物生長提供所需的養(yǎng)分，同時其豐富的孔隙結構可以為微生物的棲息提供良好的環(huán)境。然而，潘全良等[15]研究表明：炭基肥對土壤蔗糖酶與土壤過氧化氫酶活性有抑制作用?？梢?，炭基肥對作物生長和土壤微生物的影響與炭基肥種類、制備原料和組分比例、施用量和方式密切相關，其影響還存在不確定性。目前國內針對炭基肥土壤改良研究集中在作物產量、品質、土壤養(yǎng)分等方面[14-15]，其如何影響土壤微生物數(shù)量和酶活性尚缺乏系統(tǒng)研究。

基于此，本研究以杭嘉湖平原青紫泥水稻土為供試土壤，利用田間試驗，在等量氮、磷、鉀養(yǎng)分施用條件下，比較了炭基肥、有機肥替代部分化肥和常規(guī)化肥對土壤養(yǎng)分、微生物群落豐度以及土壤酶活性的影響，探討了土壤酶活性變化的主要影響因素，以期為炭基肥及有機肥替代化肥合理應用和培肥稻田土壤提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣地概況

樣地位于浙江省桐鄉(xiāng)市屠甸鎮(zhèn)(30°32′N，120°24′E)。該區(qū)域屬于杭嘉湖平原，屬亞熱帶季風氣候，年平均氣溫為16.5 ℃。供試土壤為青紫泥水稻土，土壤基本化學性質如下：pH 6.22、總碳14.50 g·kg-1、全氮 1.17 g·kg-1、全磷 0.56 g·kg-1、有效磷 4.90 mg·kg-1、速效鉀 119.00 mg·kg-1。

1.2 試驗設計

采用田間試驗，設置4個處理：對照(不施肥，ck)、常規(guī)施肥(CF)、炭基肥(BF)與有機肥替代50%化肥(OF)處理。后3者處理合計氮磷鉀養(yǎng)分投入一致，其中：氮肥270 kg·hm-2(以氮計)，磷肥75 kg·hm-2(以五氧化二磷計)，鉀肥150 kg·hm-2(以氧化鉀計)。以BF處理氮磷鉀養(yǎng)分投入為標準，CF和OF投入后養(yǎng)分不足部分用尿素、鈣鎂磷肥、氯化鉀補充，保證各處理之間氮、磷、鉀施入量相等。采用隨機區(qū)組設計，各處理小區(qū)面積8 m×4 m，重復3次。小區(qū)間用水泥埂隔開，保證各小區(qū)不串灌。CF和OF處理分2次施肥，50%作為基肥，50%作為追肥。各處理具體施肥方案如下：CF處理將配方肥 按 750.0 kg·hm-2、鈣鎂 磷 肥 125.0 kg·hm-2作為 基 肥施 入，將 尿 素 290.3 kg·hm-2、氯 化鉀 24.2 kg·hm-2作為追肥施入；OF 處理將菜籽餅 (含全氮 50.00 g·kg-1, 全磷 1.09 g·kg-1，0.83 g·kg-1)按2 700.0 kg·hm-2、鈣鎂磷肥 62.5 kg·hm-2作為基肥施入，將尿素 290.3 kg·hm-2、氯化鉀 196.2 kg·hm-2作為追肥施入。BF處理中炭基肥(18-5-10，含15 %玉米秸稈炭)委托南京勤豐秸稈科技有限公司制備，作為基肥按1 500.0 kg·hm-2一次性施入。供試水稻品種為浙優(yōu)18，2019年6月14日施基肥，6月16日移栽，6月27日追肥，11月4日收獲。肥料均勻撒施，各小區(qū)田間管理措施均與當?shù)匾恢隆?/p>

1.3 土壤采集與化學性質分析

于水稻收獲時在每個小區(qū)按“S”形采樣法，隨機采集10個表層(0～20 cm)土壤樣品，形成混合樣。土壤樣品過2 mm篩剔除石礫植物根系及殘體，混勻分為3份；一部分放置于4 ℃冰箱儲存，用以測定土壤微生物生物量及土壤酶活性，一部分放置于-70 ℃冰箱儲存，用于土壤總DNA提取，剩余樣品于室溫風干后用于土壤基礎化學性質測定。

土壤化學性質參考魯如坤[16]方法測定。土壤pH值采用pH計按土水質量比1.0∶2.5測定；土壤總碳和全氮采用元素分析儀(Vario EL Ⅲ，Elementar，德國)測定；有效磷采取0.5 mol·L碳酸氫鈉浸提，鉬銻抗比色法測定；速效鉀采取醋酸銨浸提，火焰光度計測定。銨態(tài)氮(NH4+-N)和硝態(tài)氮(NO3--N)采用2 mol·L-1氯化鉀浸提，流動分析儀測定。溶解性有機碳(DOC)、溶解性氮(DN)采用去離子水浸提，總有機碳分析儀(日本島津公司)測定。溶解性有機氮(DON)為溶解性氮與銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量的差值。土壤微生物生物量碳(MBC)和氮(MBN)采用氯仿熏蒸提取法，總有機碳分析儀(日本島津公司)測定。

1.4 土壤 DNA 提取和熒光定量 PCR

稱取0.35 g冷凍干燥后的土壤樣品，采用土壤DNA提取試劑盒(DNeasy PowerSoil? Kit，QIAGEN，美國)，按說明書進行土壤DNA提取。提取后的DNA用超微量紫外分光光度計(NanoDrop One，Thermo，美國)測定其濃度和純度，保存于-20 ℃。本研究分別用引物對338F和518R[17]、NS1F和FungR[18]、344F和517R[19]對細菌16S rRNA基因、真菌18S rRNA基因和古菌16S rRNA基因豐度進行定量分析。反應體系如下：2×SYBR Premix Ex Taq 10 μL(TaKaRa，日本)，10.0 μmol·L-1上游和下游引物各0.5 μL，模板DNA 1.0 μL，無菌雙蒸水8.0 μL。質粒及標準曲線的制作參照吳濤等[20]進行。標準曲線及樣品測定3次重復，設置空白，反應在熒光定量PCR儀(CFX96TMReal-Time System，Bio-Rad，美國)上進行。

1.5 土壤酶活性測定

利用微孔板熒光法[20]測定α-葡萄糖苷酶(AG)、β-葡萄糖苷酶(BG)、纖維二糖水解酶(CB)、木聚糖苷酶(XYL)、亮氨酸氨基肽酶(LAP)、N-乙?；?β-D氨基葡萄糖苷酶(NAG)和酸性磷酸酶(PHOS)等7種參與土壤碳氮磷循環(huán)相關的酶活性。以4-羥甲基-7-香豆素(MUB)和7-氨基-4-甲基香豆素(MUC)熒光標記的底物作為酶活性反應底物，通過MUB和MUC熒光強度的變化反映酶活性。土壤熒光酶活性測定參考吳濤等[20]的方法，用多功能酶標儀(Synergy? H1，Biotek，美國)在熒光激發(fā)光 365 nm和檢測光波長 450 nm 下測定，酶活性單位為 nmol·g-1·h-1。由于不同類型土壤酶活性差異較大，難以綜合反映土壤總體酶活性，本研究采用酶的幾何平均值表示單個樣品總體的土壤酶活性。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)利用SPSS 26.0統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和鄧肯法(Duncan)多重比較檢驗不同處理間的差異顯著性(P＜0.05)。相關性分析采用皮爾遜(Pearson)相關分析法進行雙尾檢驗確定顯著性。冗余分析(RDA)用于檢驗土壤環(huán)境因子對土壤酶活性變化的顯著性，單因素置換多元方差分析(one-way PERMANOVA)(999次置換檢驗)用于分析施肥處理對土壤酶活性影響的顯著性(P＜0.05)。

2 結果與分析

2.1 不同施肥處理對土壤化學性質的影響

由表1可見：與ck相比，在水稻收獲期各施肥處理對土壤pH、總碳、全氮、有效磷、速效鉀和硝態(tài)氮均無影響，但顯著影響了土壤銨態(tài)氮質量分數(shù)(P＜0.05)；與CF處理相比，BF處理顯著提高了土壤總碳質量分數(shù)(P＜0.05)，提高幅度為20.2%；3種施肥處理均提高了土壤銨態(tài)氮質量分數(shù)，其中CF、BF和OF處理提高幅度分別為84.1%、83.4%和150.7%。

表1 不同施肥處理對土壤化學性質的影響Table 1 Effects of different fertilization treatments on soil chemical properties

2.2 不同施肥對土壤可溶性有機碳、氮與微生物豐度的影響

由表2所見：BF和OF處理對易氧化態(tài)碳(ROC)無影響，但顯著提高了溶解性有機碳質量分數(shù)(P＜0.05)，且OF處理提高幅度高于BF處理；僅OF處理顯著提高了溶解性有機氮(DON)和微生物生物量碳(MBC)質量分數(shù)(P＜0.05)，提高幅度分別達136.6%和164.0%。由表3可見：與ck相比，僅OF處理顯著提高了細菌和真菌豐度及真菌/細菌比(P＜0.05)，提高幅度為34.9%，98.3%和50.0%；CF和BF處理對細菌和古菌豐度無影響，但CF處理顯著降低了真菌豐度(P＜0.05)。

表2 不同施肥處理對土壤溶解性有機碳(DOC)、溶解性有機氮(DON)、微生物生物量碳(MBC)和微生物生物量氮(MBN)質量分數(shù)的影響Table 2 Effects of different fertilization treatments on soil dissolved organic C and N, microbial biomass C and N contents

表3 不同施肥處理對土壤細菌、真菌、古菌基因豐度的影響Table 3 Effects of different fertilization treatments on the gene abundances of bacteria, fungi and archaeal

2.3 不同施肥下土壤酶活性變化及其影響因素

由圖1可知：與ck相比，BF和OF處理均提高了土壤α-葡萄糖苷酶(AG)、纖維二糖苷酶(CB)、β-N-乙酰氨基葡萄糖酶(NAG)和酸性磷酸酶(PHOS)的活性，其中OF處理下4種酶活性分別較ck增加了136.7%、100.0%、177.2%和199.3%，BF處理下4種酶活性分別比ck增加111.6%、76.7%、109.4%和97.3%，而CF處理對其無顯著影響。相比ck，3種施肥處理對β-葡萄糖苷酶(BG)、木聚糖苷酶(XYL)、亮氨酸氨基肽酶(LAP)活性均無影響。相比CF，BF處理具有更低的BG和XYL活性。OF處理下酶活性幾何平均值(GMEA)顯著高于ck和CF處理(P＜0.05)。單因素置換多元方差分析表明(圖2)：施肥處理顯著改變了土壤酶活性(P＜0.05)。冗余分析表明：BF和OF處理下土壤酶活性與ck和CF在第1軸上具有明顯分異。銨態(tài)氮(NH4+-N)、溶解性有機碳(DOC)、溶解性有機氮(DON)及真菌18S rRNA豐度與纖維二糖苷酶(CB)、β-N-乙酰氨基葡萄糖酶(NAG)、酸性磷酸酶(PHOS)和酶活性幾何平均值(GMEA)正相關，是顯著影響土壤酶活性的環(huán)境因子；而其他性質對土壤酶活性變化影響較小。

圖1 不同施肥處理對土壤酶活性的影響Figure 1 Effects of different fertilization treatments on soil enzyme activities

圖2 土壤化學性質和微生物量變化約束下土壤酶活性的冗余分析Figure 2 Redundancy analysis of soil enzyme activities constrained by changes in soil chemical properties and microbial abundance

3 討論

3.1 炭基肥與有機肥替代部分化肥對土壤化學性質的影響

有機肥單獨施用或配施一定量化肥可以顯著提高稻田土壤pH，增加土壤有機質和礦質養(yǎng)分含量，從而提高稻田土壤肥力[21]。然而，炭基肥施用對土壤pH及土壤有機質和養(yǎng)分含量的影響結果并非一致[13-14]。李春陽[13]研究發(fā)現(xiàn)：適量施用炭基肥能夠提高稻田土壤pH以及速效養(yǎng)分含量。楊天昱[22]研究表明：施用炭基肥使遼寧典型稻田土壤有機碳、堿解氮、速效鉀含量分別提高了37.55%～41.48%、12.45%～13.55%、12.35%～12.90%。李昌娟等[23]研究表明：施用1.48～3.70 t·hm-2炭基肥5個月后，酸化茶園土壤pH以及銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、速效磷等養(yǎng)分含量顯著提高，且隨炭基肥施用量的增加而增大。相反，常棟等[14]研究表明：不同用量炭基肥使土壤礦質氮含量降低了30%～49%。本研究中，常規(guī)化肥、炭基肥與有機肥替代部分化肥處理均未顯著影響土壤pH、總碳、全氮、有效磷和速效鉀質量分數(shù)，結果與多數(shù)報道不一致。這可能與不同肥料的施用量、施肥時間和受試土壤性質等有關。本研究采用菜籽餅替代50%化肥用量，施用量相對偏低，且因菜籽餅相對易分解，可能對水稻收獲期土壤有機質、全氮等總養(yǎng)分質量分數(shù)影響不大。本研究中炭基肥用量以及其中生物質炭的比例相比李昌娟等[23]的研究結果較低，且只施用1次，可能也無法引起土壤有機碳、氮磷鉀養(yǎng)分總量發(fā)生顯著變化。溶解性有機質作為微生物養(yǎng)分重要來源，在土壤養(yǎng)分供應方面起著重要作用，相比土壤總有機碳和全氮可以更加靈敏反映土壤質量的內在變化[15]。本研究發(fā)現(xiàn)：施用有機肥和炭基肥顯著提高了土壤水溶性有機碳和銨態(tài)氮質量分數(shù)，與石麗紅等[24]的研究結果較為一致。這可能是因為有機肥和炭基肥具有速效和緩效養(yǎng)分，能夠促進植物快速生長，導致更多的有機殘余物經分解后以可溶性組分進入土壤。包建平等[25]研究表明：秸稈等有機物料施用可顯著提高紅壤活性碳組分含量，這是因為秸稈等有機物料分解釋放的淀粉、半纖維素和多糖等物質是土壤溶解性有機質和礦質氮的主要來源。

3.2 炭基肥與有機肥替代部分化肥對土壤微生物豐度和酶活性的影響

本研究發(fā)現(xiàn)：僅有機肥替代部分化肥處理顯著提高了稻田土壤微生物生物量碳、細菌和真菌的基因豐度，而炭基肥和化肥施用對其影響較小。已有研究表明：長期施用化肥可顯著降低土壤微生物生物量，抑制土壤微生物和酶活性，而有機肥替代化肥可以改善土壤環(huán)境，增加土壤溶解性有機碳和氮源，從而促進微生物生長和繁殖，加快土壤養(yǎng)分周轉速率[26-27]。本研究中菜籽餅營養(yǎng)豐富，碳氮比合適，在水稻收獲期仍具有較高的水溶性有機碳和銨態(tài)氮質量分數(shù)，可能刺激了土壤微生物生長。盡管生物質炭在改善土壤結構、持水性、增加土壤養(yǎng)分含量、提高微生物豐度等方面已被廣泛認可[28-29]，但炭基肥對土壤結構和微生物豐度的影響相對微弱[30]。陳坤等[30]通過田間定位試驗研究表明：豬廄肥以及生物炭均能顯著提高土壤微生物磷脂脂肪酸含量和細菌豐度，但炭基肥對其影響較小。相反，陳懿等[31]研究發(fā)現(xiàn)：炭基肥增加了植煙土壤細菌、放線菌和真菌數(shù)量。炭基肥對土壤微生物的影響可能與炭基肥類型(如有機物料含量)、養(yǎng)分釋放狀況和水熱協(xié)調能力等差異有關。本研究表明：炭基肥對細菌和真菌豐度并未產生顯著促進作用，可能是單次炭基肥施用難以給微生物提供較多的底物來改善土壤環(huán)境。

本研究中，相比對照和化肥，炭基肥及有機肥替代化肥處理顯著提高了土壤α-葡萄糖苷酶(AG)、纖維二糖水解酶(CB)、N-乙?；?β-D氨基葡萄糖苷酶(NAG)和酸性磷酸酶(PHOS)活性，且有機肥提高幅度更大，而對其他酶活性無影響。這一結果表明炭基肥和有機肥部分替代化肥均有利于促進土壤碳、氮、磷轉化相關酶活性，可潛在促進土壤有機質分解。有機肥施用對土壤碳、氮、磷轉化相關水解酶活性的促進作用已有廣泛報道，這與有機肥含有較高的易分解有機質，有利于促進微生物生長，進而促進微生物胞外酶的產生和酶促反應活性有關[26,32]。包建平等[25]研究表明：秸稈等有機物料增加了土壤可溶性有機碳源和氮源，促進了β-葡萄糖苷酶(BG)和CB及微生物對葡萄糖、天冬氨酸和丁香酸的利用速率。炭基肥施用對土壤酶活性的影響報道相對較少，且結果存在不一致性。如潘全良等[15]發(fā)現(xiàn)：炭基肥對土壤蔗糖酶與土壤過氧化氫酶活性有抑制作用，而對土壤脲酶活性無明顯影響；而陳懿等[31]研究顯示：施用炭基肥可以提高土壤脲酶和過氧化氫酶活性，其中過氧化氫酶活性增幅達10.6%。以上這些迥異的報道可能與炭基肥中的生物質炭材料、本身養(yǎng)分釋放特征以及土壤的養(yǎng)分有效性均有一定關系。本研究中施用炭基肥提高了AG、CB、NAG和PHOS活性，可能與炭基肥施用提高了土壤可溶性有機碳和銨態(tài)氮有關。冗余分析證實：銨態(tài)氮、溶解性有機碳和氮及真菌豐度與CB、NAG、PHOS正相關，是顯著影響土壤酶活性的環(huán)境因子。也有相關研究表明：炭基肥含有的生物質炭可能通過吸附酶促反應的底物，促進酶促反應活性，抑制或阻礙酶促反應結合位點，進而抑制酶活性[33]。酶生態(tài)化學計量學理論認為：微生物氮、磷養(yǎng)分限制條件可進一步促進NAG和PHOS等胞外酶活性[29]。因此，在相同養(yǎng)分投入下，有機肥和炭基肥促進植物養(yǎng)分吸收也可能加劇了微生物的養(yǎng)分限制，從而促進了氮磷獲取酶活性。與化肥的快速養(yǎng)分供給特點不同，有機肥和炭基肥一方面通過自身所含養(yǎng)分的緩慢分解與釋放提高了土壤可溶性有機質，另一方面通過提高土壤碳、氮、磷轉化酶活性促進養(yǎng)分周轉，從而加速稻田土壤養(yǎng)分循環(huán)。然而，有機肥和炭基肥對土壤酶活性的影響方式可能存在差異：有機肥主要通過自身的大量可降解性碳氮組分提高微生物量，從而提高相關水解酶活性；炭基肥本身易分解組分含量低，并不能顯著提高土壤微生物量，但可通過自身孔隙結構和養(yǎng)分緩釋性能調控土壤酶活性。

4 結論

在等量氮、磷、鉀養(yǎng)分投入下，炭基肥與有機肥替代部分化肥較常規(guī)施肥處理對土壤總碳、全氮、有效磷和速效鉀質量分數(shù)無顯著影響，但均提高了土壤α-葡萄糖苷酶、纖維二糖苷酶、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶和酸性磷酸酶活性，且后者提高幅度更大。有機肥替代部分化肥較常規(guī)施肥顯著提高了土壤微生物生物量碳質量分數(shù)、細菌和真菌豐度，而炭基肥對其無影響。因此，有機肥替代部分化肥和炭基肥處理均可提高土壤碳、氮、磷轉化酶活性，促進稻田養(yǎng)分周轉。