新一代診斷技術(shù)：CRISPR 系統(tǒng)及其在分子診斷中的應(yīng)用

孫秀蘭， 付旭冉， 鮑 琦， 孫嘉笛

（江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

分子診斷是通過核酸識(shí)別和基因編輯對(duì)遺傳物質(zhì)的變化做出診斷的技術(shù)[1]，在生物醫(yī)藥、環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品安全防控等領(lǐng)域起著至關(guān)重要的作用[2]。 目前，最常用的技術(shù)主要有兩大類，第一類是以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）為代表的核酸檢測(cè)技術(shù)，其常作為分子診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，具有高靈敏度和可靠性，但對(duì)設(shè)備條件要求高且具有環(huán)境依賴性， 基于PCR 方法建立的恒溫?cái)U(kuò)增、基因測(cè)序、生物芯片等技術(shù)也得到了廣泛應(yīng)用，但這些方法依舊存在技術(shù)復(fù)雜、成本高、特異性差等問題。 酶 聯(lián) 免 疫 吸 附 測(cè) 定 （enzyme -linked immunosorbent assay，ELISA） 因其快速和高特異性的優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)成為了蛋白質(zhì)和小分子廣泛應(yīng)用的診斷工具，然而，樣品前處理的復(fù)雜性以及較低的靈敏度限制了其在現(xiàn)場(chǎng)快速精準(zhǔn)檢測(cè)中的應(yīng)用。

世 界 衛(wèi) 生 組 織 （World Health Organization，WHO）發(fā)布了理想診斷產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)ASSURED[3]，即為可負(fù)擔(dān)（affordable）、靈敏（sentitive）、特異（specific）、用 戶 友 好（user-friendly）、快 速 而 可 靠（rapid and reliable）、免設(shè)備（equipment-free）且可交付給最終用戶（deliverable to end users）[4]。CRISPR/Cas 系統(tǒng)由于優(yōu)異的生物傳感性能逐漸成為下一代診斷技術(shù)的焦點(diǎn)，有望成為開發(fā)理想診斷產(chǎn)品的方法。 基于CRISPR/Cas 系統(tǒng)的特異性結(jié)合活性和高效反式切割能力，將其與電化學(xué)、熒光傳感技術(shù)相結(jié)合，已經(jīng)成功實(shí)現(xiàn)了各種靶標(biāo)分子的高特異、 高靈敏檢測(cè)，檢測(cè)對(duì)象也已經(jīng)從最初的核酸擴(kuò)展到金屬離子、蛋白質(zhì)、細(xì)菌、小分子等，說明了CRISPR/Cas 系統(tǒng)在檢測(cè)領(lǐng)域具有通用性。 本文中作者重點(diǎn)介紹了兩類CRISPR/Cas 系統(tǒng)的特征和機(jī)制， 并總結(jié)了基于CRISPR/Cas 系統(tǒng)的各種新型生物傳感器，列舉了針對(duì)核酸靶標(biāo)及蛋白質(zhì)、生物小分子等非核酸靶標(biāo)構(gòu)建的CRISPR/Cas 新型生物傳感器， 最后對(duì)該領(lǐng)域的發(fā)展提出了一些未來展望，以期為進(jìn)一步開發(fā)新型分子診斷技術(shù)提供參考。

1 基因編輯及CRISPR/Cas 系統(tǒng)概述

基因編輯是分子診斷技術(shù)的基礎(chǔ)，目前基因編輯主要有三大利器：鋅指核酸酶（zinc-finger nuclease，ZFN）、 轉(zhuǎn) 錄 激 活 樣 效 應(yīng) 因 子 核 酸 酶（transcription activator-like effector nuclease，TALEN）和成簇規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）與其蛋白質(zhì)（CRISPR associated，Cas）共同組成的CRISPR/Cas 系統(tǒng)[5]。 ZFN 是人工修飾的核酸酶，通常由兩部分組成，一部分是能夠?qū)崿F(xiàn)特異性識(shí)別鋅指（zinc-finger，ZF）的DNA 結(jié)合域，一般包含3 個(gè)ZF 重復(fù)結(jié)構(gòu)， 每個(gè)ZF 能識(shí)別3 個(gè)堿基；另一部分是包含非特異性限制性核酸內(nèi)切酶的DNA切割區(qū)域，對(duì)DNA 進(jìn)行特異性切割，形成雙鏈斷裂區(qū)，以非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）的方式使目的基因失活，或借助同源重組（homologous recombination，HR）方式黏合斷裂的DNA，從而修復(fù)DNA。 其主要應(yīng)用于科研和醫(yī)療領(lǐng)域， 如治療杜氏肌營養(yǎng)不良癥和21 三體綜合征等遺傳疾病[6]。

TALEN 最初來源于黃單胞菌， 完整的TALEN由包含定位信號(hào)的N 結(jié)構(gòu)域、 可識(shí)別特定靶DNA的TALE 重復(fù)序列以及FoKI 核酸內(nèi)切酶組成。天然TALEN 元件識(shí)別的序列長度為17~18 bp[7]，主要是通過將TALEN 靶向并結(jié)合DNA 位點(diǎn)， 在FoKI 核酸內(nèi)切酶的作用下實(shí)現(xiàn)對(duì)特定點(diǎn)位的剪切。 TALEN技術(shù)目前已在全球范圍內(nèi)廣泛用于靶向基因編輯，在醫(yī)療和動(dòng)植物育種領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用前景。

上述兩種酶的作用機(jī)制都是通過對(duì)雙鏈DNA（double stranded DNA，dsDNA）進(jìn)行識(shí)別和切割， 激活細(xì)胞的非同源末端修復(fù)或者同源重組修復(fù)，依賴于DNA 序列與蛋白質(zhì)的特異性結(jié)合，而這一步驟非常的費(fèi)時(shí)且煩瑣， 具有很強(qiáng)的設(shè)備依賴性。 CRISPR/Cas 系統(tǒng)通過特異性向?qū)NA（guide RNA，gRNA）指導(dǎo)核酸內(nèi)切酶結(jié)合靶點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)更簡單高效的基因編輯。 不同種類的酶對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)類型不同，包括dsDNA、單鏈DNA（single stranded DNA，ssDNA）和RNA 等。與其他兩種基因編輯系統(tǒng)相比，CRISPR/Cas 系統(tǒng)具有顯著優(yōu)勢(shì)[8]：1）載體構(gòu)建簡單且靶向效率高，只需要構(gòu)建一個(gè)具有幾十個(gè)堿基的CRISPR sgRNA 即可與DNA 序列進(jìn)行匹配，從而介導(dǎo)Cas 效應(yīng)子對(duì)DNA 序列進(jìn)行切割；2）CRISPR/Cas 系統(tǒng)可編輯的位點(diǎn)分布頻率較高，易選擇合適的位點(diǎn)進(jìn)行基因編輯；3）CRISPR/Cas 系統(tǒng)可同時(shí)對(duì)基因組進(jìn)行多位點(diǎn)編輯。

簡而言之，TALEN 和ZFN 雖然精確度高和可控性強(qiáng)， 但CRISPR/Cas 系統(tǒng)因操作簡單和功能強(qiáng)大，在分子診斷及生物傳感領(lǐng)域，尤其是現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)（point-of-care testing，POCT）領(lǐng)域有著更為巨 大的潛力，三者的對(duì)比見表1[9]。

表1 3種常見基因編輯技術(shù)的特點(diǎn)及比較Table 1 Characteristics and comparison of three common gene editing technologies

2 CRISPR 系統(tǒng)的分類及特點(diǎn)

CRISPR/Cas 系統(tǒng)依據(jù)Cas 效應(yīng)子的不同可以分為6 大類和32 個(gè)亞型。 1 類CRISPR 系統(tǒng)主要通過多個(gè)蛋白質(zhì)協(xié)同作用來激活切割活性， 包括Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型，效率較低且操作復(fù)雜，研究和應(yīng)用較少；2 類CRISPR 系統(tǒng)的Cas 效應(yīng)蛋白通常只有一個(gè)蛋白質(zhì)，包括Ⅱ型、Ⅴ型和Ⅵ型[10]。 2 類CRISPR系統(tǒng)作用機(jī)制主要包括3 個(gè)階段：第一個(gè)階段是識(shí)別可變間隔區(qū)，當(dāng)識(shí)別到外來物質(zhì)時(shí)，前間區(qū)序列鄰近基序（protospacer adjacent motif，PAM）識(shí)別外源DNA 片段并整合到宿主CRISPR 基因的兩個(gè)重復(fù)序列之間，作為間隔序列[11]；第二階段是Cas 酶結(jié)合gRNA 形成二元復(fù)合物， 從而將gRNA 中的CRISPR 引導(dǎo)至DNA 分子上的前間隔序列；第三階段是gRNA 與前間隔序列配對(duì)形成Cas-gRNAPAM 三元復(fù)合物[12]，特異性識(shí)別外源核酸片段，Cas酶被激活， 順式切割外源核酸片段。 由于2 類CRISPR 系統(tǒng)只需要一個(gè)效應(yīng)蛋白就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)靶核酸位點(diǎn)的切割，操作簡單、靶向精確，逐漸成為分子診斷領(lǐng)域的熱點(diǎn)， 已發(fā)現(xiàn)的2 類CRISPR 系統(tǒng)效應(yīng)蛋白Cas9、Cas12、Cas13 和Cas14 都有了廣泛應(yīng)用，且具有不同特點(diǎn)，其主要區(qū)別見表2。

表2 2 類CRISPR 系統(tǒng)中主要Cas 效應(yīng)蛋白比較Table 2 Comparison of major Cas effector proteins in class 2 CRISPR system

2.1 Cas9

Cas9 是一種雙gRNA 的II 型Cas 效應(yīng)子，其gRNA 包含一個(gè)crRNA 和一個(gè)tracrRNA。 crRNA 的3′端與tracrRNA 配對(duì)，crRNA 的5′端是游離的靶標(biāo)序列[13]。 當(dāng)外源dsDNA 片段進(jìn)入時(shí)，Cas9 結(jié)合tracrRNA 形成復(fù)合體，然后將crRNA 引導(dǎo)至其與靶標(biāo)序列的前間隔序列結(jié)合，而這個(gè)結(jié)合取決于前間隔序列和PAM。 與其他II 型CRISPR 系統(tǒng)不同。Cas9 中有兩部分起識(shí)別作用的結(jié)構(gòu)域， 分別是HNH 結(jié)構(gòu)域和RuvC 結(jié)構(gòu)域[14]。以含有PAM 序列的dsDNA 作為催化底物，在gRNA 的指導(dǎo)下，以PAM位點(diǎn)介導(dǎo)， 使得Cas9 的HNH 結(jié)構(gòu)域和RuvC 結(jié)構(gòu)域分別切割靶標(biāo)鏈和非靶標(biāo)鏈 （與靶標(biāo)鏈互補(bǔ)的鏈），從而對(duì)目的基因進(jìn)行編輯[1，15]。

2.2 Cas12

Cas12 和Cas9 結(jié) 構(gòu) 和 功 能 相 似，Cas9 和Cas12b 的gRNA 包 括crRNA 和tracrRNA[16]，而Cas12a 的gRNA 只包括crRNA， 且只包含RuvC 單個(gè)核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域。Cas12a 在crRNA 介導(dǎo)下特異性識(shí)別靶DNA 序列， 結(jié)合后觸發(fā)Cas12a 的構(gòu)象變化， 導(dǎo)致RuvC 的活性位點(diǎn)暴露， 特異性識(shí)別靶標(biāo)dsDNA， 激活其特異性順式切割活性和非特異性反式切割活性[17]，形成黏性末端并非特異性反式切割 任意ssDNA[18]。 Cas12 中完整的crRNA 長度一般為42~44 nt[16]，一般包含19 nt 的重復(fù)序列和23~25 nt 的間隔區(qū)，其中第19 個(gè)U 堿基是嚴(yán)格保守的[15]。

2.3 Cas13a

與2 類中的其他Cas 效應(yīng)子相比，Cas13a 對(duì)單鏈RNA（single stranded RNA，ssRNA）具有順式和反式切割活性[19]。 Cas13a 含有兩個(gè)HEPN 結(jié)構(gòu)域，在crRNA 的引導(dǎo)下，特異性切割帶有互補(bǔ)間隔序列的ssRNA。 當(dāng)Cas13a 結(jié)合到ssRNA 靶標(biāo)后，Cas13a 蛋白被激活并轉(zhuǎn)化為非特異性內(nèi)切酶，對(duì)附近的非靶標(biāo)ssRNA 具有反式切割活性。Cas13a 的前間隔序列一般為20 nt[20]，一般沒有特定的切割位點(diǎn)，但顯示出對(duì)U 堿基的切割偏好。

2.4 Cas14

相較于其他典型的2 類蛋白，Cas14 效應(yīng)子相對(duì)分子質(zhì)量較小， 只有大約400~700 個(gè)氨基酸，包含一個(gè)與Cas12a 類似的RuvC 區(qū)域[21]，通過與crRNA 和tracrRNA 結(jié)合切割靶標(biāo)DNA。 在體外檢測(cè)中，Cas14 只能識(shí)別和切割ssDNA，但其核酸內(nèi)切酶活性的激發(fā)不需要依賴于PAM 序列[22]，此外，Cas14在與靶序列結(jié)合后也可非特異切割任意ssDNA。

Cas 效應(yīng)子可以特異性結(jié)合靶核酸， 以20~30 nt 的gRNA 為“向?qū)д摺?。而PAM 序列識(shí)別是Cas 效應(yīng)子檢測(cè)dsDNA 目標(biāo)的先決條件[19，23-24]，與gRNA互補(bǔ)的ssDNA 也可以被Cas12a 切割， 并且以不依賴于PAM 序列的方式激活Cas12a 的反式切割活性[12]。對(duì)于ssRNA 檢測(cè)，則需要一個(gè)3′PFS（非G，相當(dāng)于PAM 序 列）來 激 活Cas13a 的 切 割 活 性[13，25]。 對(duì) 于Cas9、dCas9 和Cas12 來說，gRNA 和靶標(biāo)核酸的復(fù)合物對(duì)PAM 序列附近的10 個(gè)堿基對(duì)非常敏感[19，24，26-27]，而Cas13a 則對(duì)中心堿基對(duì)敏感[13，28]。 當(dāng)堿基對(duì)錯(cuò)配發(fā)生在中心堿基（即為敏感區(qū)域）時(shí)，Cas 效應(yīng)子的切割效率會(huì)顯著降低，從而可以用于進(jìn)行單堿基錯(cuò)配檢測(cè)。

3 CRISPR 傳感技術(shù)在分子診斷中的應(yīng)用

在分子診斷方面，Cas 效應(yīng)子的切割活性（包括順式切割和反式切割） 引起了廣泛關(guān)注與研究，尤其是Cas 效應(yīng)子的反式切割活性[12，29-31]。報(bào)告分子被Cas 效應(yīng)子切割后， 檢測(cè)體系將發(fā)生顯著的信號(hào)變化（如電化學(xué)或者光學(xué)信號(hào)）。 基于此，CRISPR/Cas系統(tǒng)成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)包括核酸靶標(biāo)和非核酸靶標(biāo)在內(nèi)的多種生物分子的檢測(cè)。 各種基于CRISPR/Cas生物傳感系統(tǒng)的總結(jié)如圖1 所示。

圖1 基于CRISPR/Cas 的生物傳感系統(tǒng)示意圖Fig. 1 Schematic representation of CRISPR/Cas-based systems for biosensing

3.1 脫氧核糖核酸檢測(cè)

單核苷酸多態(tài)性 （single nucleotide polymorphism，SNP） 與全基因組關(guān)聯(lián)鑒定的復(fù)雜性狀和疾病相關(guān)，是人類基因組中最常見的變異之一[32]。 Li 等建立了基于LbCas12a 的低成本高效檢測(cè)系統(tǒng)，被稱為一種單小時(shí)低成本多用途高效體系（an onehour low-cost multipurpose highly efficient system，HOLMES）用于檢測(cè)人類SNP。 該體系通過PCR 擴(kuò)增靶DNA，并通過設(shè)計(jì)的引物引入PAM 序列，得到的dsDNA 產(chǎn)物會(huì)與Cas12a-crRNA 組裝形成三元復(fù)合物， 切割標(biāo)記有熒光基團(tuán)和猝滅劑的ssDNA 探針，從而導(dǎo)致熒光基團(tuán)與猝滅劑分離，并產(chǎn)生顯著增加的熒光信號(hào)。 HOLMES 可以快速精準(zhǔn)地檢測(cè)人類SNP，并高特異性區(qū)分純合和雜合基因型[18]。 Li等為了簡化操作程序，還構(gòu)建了基于AsCas12b 的HOLMESv2 系統(tǒng)， 實(shí)現(xiàn)了對(duì)SNP 和DNA 甲基化的一步核酸檢測(cè)[20]。

人乳頭瘤病毒 （human papillomavirus，HPV）是一種dsDNA 病毒， 與多種惡性腫瘤和癌癥有關(guān)[33]。70%的宮頸癌由HPV16 和HPV 18 引起[34]。 目前市售DNA 試劑盒不能有效地識(shí)別所有致癌的人乳頭瘤病毒類型。 Chen 等建立了基于Cas12a 的DNA 內(nèi)切酶靶向CRISPR 反式切割報(bào)告方法（DNA endonuclease -targeted CRISPR transreporter，DETECTR），該方法以LbCas12a 為效應(yīng)蛋白，采用RPA 等溫?cái)U(kuò)增構(gòu)建了通用型檢測(cè)平臺(tái)。RPA 的優(yōu)勢(shì)在于可在37 ℃的條件下快速進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增， 減少了對(duì)設(shè)備的依賴性。 該檢測(cè)平臺(tái)可以準(zhǔn)確地區(qū)分HPV16 和HPV18，靈敏度可以達(dá)到amol/L 級(jí)別。 此外該平臺(tái)還可以用于檢測(cè)環(huán)境DNA，可成功區(qū)分出Salmo salar和Salmo trutta線粒體基因重組質(zhì)粒，基因組檢測(cè)的靈敏度為1×10-5ng/μL[12]。 Harrington 等基于Cas14 相關(guān)特性，構(gòu)建了Cas14-DETECTR。 因Cas14 靶向ssDNA，為擴(kuò)增產(chǎn)生ssDNA，在擴(kuò)增時(shí)，將一條引物進(jìn)行硫代磷酸酯修飾， 擴(kuò)增完成后，未被硫代磷酸酯修飾的鏈會(huì)被T7 核酸酶降解， 只保留ssDNA 靶序列[30]。 Cas14 具有更高的特異性和更低的脫靶率， 且可以識(shí)別沒有PAM 序列的外源DNA，被廣泛應(yīng)用于SNP 檢測(cè)，例如，目前Cas14 已被成功用于眼球顏色相關(guān)基因HERC2的SNP 檢測(cè)[35]。

非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）是一種大型有包膜的dsDNA 病毒[36]，會(huì)導(dǎo)致非洲豬瘟?。ˋfrican swine fever，ASF）。 ASF 是一種嚴(yán)重的出血性急性傳染病， 在家豬和野豬中死亡率接近100%。 Wang 等開發(fā)了一種CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的側(cè)向流動(dòng)核酸測(cè)定法 （CRISPR/Cas9-mediated lateral flow nucleic acid assay，CASLFA）檢測(cè)ASFV。 通過重新設(shè)計(jì)sgRNA 并引入額外的莖環(huán)，以實(shí)現(xiàn)金納米粒子（gold nanoparticles，AuNPs）-DNA 探針的結(jié)合。靶DNA 在PCR 或RPA 擴(kuò)增過程中首先被生物素化并與Cas9-sgRNA 二元復(fù)合物預(yù)孵育。 當(dāng)檢測(cè)液添加到橫向流動(dòng)試紙條后， 所得產(chǎn)物與AuNPs-DNA 探針雜交，在結(jié)合墊上形成生物素化的擴(kuò)增子Cas9-sgRNA-AuNPs-DNA 復(fù)合物，該復(fù)合物被預(yù)先包被的鏈霉親和素捕獲。當(dāng)有ASFV 存在時(shí)，金納米粒子便會(huì)在檢測(cè)線上聚集，該方法在40 min 內(nèi)可以完成檢測(cè)， 檢出限為4 copies/mL， 與PCR 檢測(cè)ASFV 的準(zhǔn)確度相當(dāng)， 說明CRISPR/Cas9 在現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)中具有極強(qiáng)的潛力[37]。 為了進(jìn)一步提高靈敏度，Wang 等研究了一種CRISPR/Cas12a 橫向流動(dòng)檢測(cè)方案。擴(kuò)增的ASFV 激活Cas12a 以切割標(biāo)有地高辛和生物素的ssDNA 報(bào)告基因。 地高辛標(biāo)記的ssDNA 可以與樣品墊上的AuNPs-地高辛抗體復(fù)合物結(jié)合， 總檢測(cè)時(shí)間為60 min， 可檢測(cè)低至0.4 copies/mL 的靶DNA[38]。Fu 等將基于Cas12a、RPA 和熒光團(tuán)猝滅劑（FQ）標(biāo)記的ssDNA 相結(jié)合，用于快速可視化檢測(cè)AFSV?；贑as12a 設(shè)計(jì)的5種crRNAs均顯示出顯著熒光強(qiáng)度的特異性。 在20 min 內(nèi)，2 copies DNA 的初始濃度下，在實(shí)驗(yàn)組和陰性組之間產(chǎn)生顯著差異，該方法具有較高靈敏度且反應(yīng)時(shí)間短[39]。

食品安全問題與人們身體健康息息相關(guān)，為有效防控食品安全風(fēng)險(xiǎn)，開發(fā)特異、靈敏、快速的食源性致病菌、轉(zhuǎn)基因作物和肉類摻假的核酸檢測(cè)技術(shù)勢(shì)在必行。Liu 等利用Cas12a 的非特異性ssDNA 切割特性，結(jié)合RPA 設(shè)計(jì)了一種食品安全通用檢測(cè)平臺(tái)，稱為RPA-Cas12a-FS[40]。CaMV35S啟動(dòng)子廣泛用于轉(zhuǎn)基因作物，如轉(zhuǎn)基因玉米、轉(zhuǎn)基因大豆[41]。 目前消費(fèi)者對(duì)轉(zhuǎn)基因生物的接受度仍然很低，一些國家已經(jīng)強(qiáng)制要求商家在轉(zhuǎn)基因成分上標(biāo)注閾值[42]。Wu 等通過Cas12a 系統(tǒng)和設(shè)計(jì)的反應(yīng)容器，建立了一種超快速和方便的可視化檢測(cè)CaMV35S啟動(dòng)子的方法[43]。 通過LAMP 和PCR 分別與Cas12a 結(jié)合，在大豆粉中可檢測(cè)到低至0.05%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的轉(zhuǎn)基因含量，該方法設(shè)計(jì)的反應(yīng)容器有可能成為基于儀器的超高靈敏度方法的補(bǔ)充，并為現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)提供新的解決方案[43]。

食源性致病菌引起食源性疾病，對(duì)人們的身體健康造成了極大威脅。 Zhang 等基于Cas12a 系統(tǒng)，建立了一種新穎、 特異和可視化的核酸檢測(cè)方法，在蝦樣品中對(duì)副溶血性弧菌的檢出限為1.02×102copies/μL[44]。大腸桿菌可能導(dǎo)致出血性結(jié)腸炎、血性腹瀉和腎衰竭等[45]，也可以感染水、果汁、牛奶、水果和蔬菜[46]。 Sun 等研究了一種Cas9 觸發(fā)的兩步等溫?cái)U(kuò)增方法，用于檢測(cè)大腸桿菌O157：H7。 該方法使用金屬有機(jī)框架UiO66 作為熒光猝滅劑， 在目標(biāo)dsDNA 存在的情況下，Cas9-sgRNA 復(fù)合物被激活，在dsDNA 的非靶標(biāo)鏈上引入兩個(gè)DNA 斷裂， 觸發(fā)新鏈的合成和延伸， 然后通過RCA 反應(yīng)產(chǎn)生包含靶標(biāo)的長ssDNA 與DNA 探針雜交， 從而恢復(fù)熒光信號(hào)，該方法能夠以高特異性檢測(cè)40 CFU/mL 的大腸桿菌O157：H7[47]。 全球抗生素耐藥性以及食品和環(huán)境污染的發(fā)生率持續(xù)增加，特別是由病毒和多重耐藥細(xì)菌引起的感染。 多重耐藥金黃色葡萄球菌（multidrug-resistantStaphylococcus aureus，MRSA）是最重要的多重耐藥病原體之一，對(duì)多種抗生素耐藥。 MRSA 感染導(dǎo)致嚴(yán)重發(fā)病率和死亡率的風(fēng)險(xiǎn)極高[48]。 Guk 等構(gòu)建了一種簡便、靈敏和快速的方法，稱為CRISPR 介導(dǎo)的DNA 熒光原位雜交（FISH），用于檢測(cè)MRSA。 該方法中將dCas9-sgRNA 復(fù)合物用作識(shí)別元件，SYBR Green I 用作dsDNA 染色的報(bào)告分子，sgRNA 的易編程性使得dCas9-sgRNA 能夠選擇性地與MRSA 基因結(jié)合，該方法能夠檢測(cè)低至10 CFU/mL 的MRSA 裂解物[49]。Curti 等應(yīng)用Cas12a來識(shí)別與碳青霉烯類耐藥基因相對(duì)應(yīng)的靶序列，如blaKPC、blaNDM和blaOXA。 通過無標(biāo)記阻抗分析，檢測(cè)時(shí)間縮短至60 min 以內(nèi)，且結(jié)果與qPCR 的結(jié)果相當(dāng)，并通過便攜式試紙條進(jìn)行了驗(yàn)證[50]。

3.2 核糖核酸檢測(cè)

Cas13a 在相應(yīng)的crRNA 的引導(dǎo)下，可特異性識(shí)別RNA，因此多通過Cas13 構(gòu)建生物傳感系統(tǒng)以實(shí)現(xiàn)核糖核酸的檢測(cè)。有研究者利用Cas13a 的反式切割活性， 構(gòu)建了一種基于Cas13a 的生物傳感平臺(tái)，稱為特異性高靈敏度酶報(bào)告系統(tǒng) （specific highsensitivity enzymatic reporter unlocking，SHERLOCK）。通過逆轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶擴(kuò)增（reverse transcription recombinase polymerase amplification，RT-RPA）技術(shù)擴(kuò)增RNA 或RPA 擴(kuò)增dsDNA， 再經(jīng)過T7 轉(zhuǎn)錄生成RNA 產(chǎn)物，用于激活Cas13a 以產(chǎn)生熒光信號(hào)[51]。SHERLOCK 能夠在患者血清或尿液樣本中檢測(cè)到寨卡病毒和登革熱病毒，并區(qū)分不同地區(qū)的寨卡病毒。 第1 代SHERLOCK 存在一定的局限性，無法達(dá)到便攜、多重檢測(cè)和高靈敏度的性能要求[52]。為了解決這些問題， 張鋒所在團(tuán)隊(duì)再次構(gòu)建了SHERLOCKversion2 系統(tǒng)（SHERLOCKv2）[35]，利用不同的Cas 酶表現(xiàn)出不同程度的“偏愛”切割特性，同時(shí)將多種不同特異性熒光探針引入檢測(cè)系統(tǒng)，進(jìn)行多種核酸檢測(cè)，可在1 份樣本中同時(shí)檢測(cè)多種病毒[52]。SHERLOCKv2 還利用側(cè)流層析方法實(shí)現(xiàn)了快速檢測(cè)，當(dāng)Cas13a 切割RNA 熒光探針時(shí)，探針兩端連接的6-羧基熒光素（6-carboxyfluorescein，F(xiàn)AM）與生物素分別結(jié)合到試紙條的不同區(qū)域， 在2 h 內(nèi)即可將結(jié)果直觀地展現(xiàn)在試紙條上，擺脫了檢測(cè)體系對(duì)熒光讀數(shù)儀器的依賴，該方法可通過凍干試劑在室溫使用，從而實(shí)現(xiàn)了現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)。

微小RNA（microRNAs，miRNA）是具有18~24個(gè)核苷酸的小的非編碼RNA[53]，其對(duì)于基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)是必需的[54]。 miRNA 被發(fā)現(xiàn)各種疾病的發(fā)生和發(fā)展與其異常表達(dá)水平密切相關(guān)，被廣泛作為診斷的生物標(biāo)志物[55]。 對(duì)于miRNA 檢測(cè)，最常見的策略是基于Cas13 的生物傳感系統(tǒng)。Shan 等利用CRISPR/LbuCas13a 的高特異性和簡單性直接檢測(cè)miRNA，這種一步法在30 min 內(nèi)實(shí)現(xiàn)了使檢測(cè)限低至4.5 amol/L，線性范圍為10 amol/L~100 fmol/L[56]。更重要的是，單核苷酸的變化，甚至是目標(biāo)miRNA末端的變化， 都可以通過合理改變crRNA 進(jìn)行鑒別。此外，這種基于Cas13a-crRNA 的信號(hào)放大策略的實(shí)際應(yīng)用能力通過在復(fù)雜生物樣品中的miRNA定量檢測(cè)得到了證明，其具有良好的可靠性、敏感性和方便快捷等特點(diǎn)， 有望在與miRNA 相關(guān)疾病的早期診斷中發(fā)揮巨大的潛力。 Wang 等利用Cas9開發(fā)了一種用于miRNA 檢測(cè)的滾環(huán)DNA 擴(kuò)增（RCA）-CRISPR-split-HRP（RCH）方法。 靶miRNA可解開啞鈴探針以進(jìn)行RCA 反應(yīng)， 從而產(chǎn)生重復(fù)的反義序列和規(guī)則的莖環(huán)結(jié)構(gòu)， 其融合的split-HRP-dCas9 復(fù)合物將通過sgRNA 裝配在RCA 產(chǎn)物上。 因此，split-HRP 催化3′3′5′5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）進(jìn)行氧化以產(chǎn)生顏色變化，該方法可以達(dá)到fmol/L 水平的檢測(cè)靈敏度和單堿基水平的特異性[57]。 同Cas9 相似，Cas12a 生物傳感系統(tǒng)也需要將miRNA 轉(zhuǎn)化為DNA 底物再進(jìn)行檢測(cè)。Wang 等構(gòu)建了一種新的生物傳感系統(tǒng)，稱為Cas12a 自供電和滾環(huán)轉(zhuǎn)錄（rolling circle transcription，RCT）-釋放實(shí)時(shí)crRNA 募集系統(tǒng)（Cas12a-SCR）。 miRNA 作為引物，沿著掛鎖探針啟動(dòng)RCT，不斷產(chǎn)生具有pre-crRNA重復(fù)的ssRNA。 這些pre-crRNA 與Cas12a 形成Cas12a-crRNA 復(fù)合物， 能以amol/L 水平的靈敏度檢測(cè)miRNA-21。Cas12a-SCR 中的pre-crRNA 是實(shí)時(shí)循環(huán)生成的，不再需要Cas12a-crRNA 的預(yù)組裝，顯著提高了miRNA 檢測(cè)的信噪比[58]。

2019 新型冠狀病毒（2019-nCoV）可在人與人之間廣泛傳播[59-60]，導(dǎo)致新型冠狀病毒肺炎的疫情難以控制，研究人員針對(duì)該病毒的快速檢測(cè)方法展開了研究[61]。 Ding 等利用Cas12a 結(jié)合RT-RPA 擴(kuò)增來檢測(cè)2019-nCoV（SARS-CoV-2），可在20 min內(nèi)得到單拷貝的靈敏度[62]。為了實(shí)現(xiàn)一步到位、簡單、快速地對(duì)2019 新型冠狀病毒現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，美國食品藥品監(jiān)督管理局 （Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）設(shè)計(jì)并授權(quán)了一種稱為“一鍋法SHERLOCK”（SHERLOCK testing in one pot，STOP） 來 檢 測(cè)2019-nCoV，該方法簡稱STOPCovid。 STOPCovid 將LAMP 和 AapCas12b 酶 結(jié) 合， 使 得 兩 步 法SHERLOCK 轉(zhuǎn)化為一步法， 通過LAMP 擴(kuò)增的2019-nCoV 的RNA，激活A(yù)apCas12b 以切割LAMP生物素標(biāo)記的ssDNA 報(bào)告分子。 STOPCovid 在70 min 和40 min 內(nèi)分別實(shí)現(xiàn)比色讀數(shù)和熒光讀數(shù)。STOPCovid 通過鼻咽拭子取樣， 具有97%的準(zhǔn)確性和100%的特異性[63]。 為了進(jìn)一步簡化RNA 提取，Joung 等使用磁珠進(jìn)行目標(biāo)富集， 在15 min 內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的濃縮，對(duì)2019-nCoV（SARS-CoV-2）檢出限為33 copies/mL[64]。

埃博拉病毒（Ebola virus，EBOV）是一種ssRNA病毒，屬于絲狀病毒科[65]，可引起致死率很高的埃博拉病毒病（Ebola virus disease，EVD）[66]，早期診斷和治療對(duì)于控制EBOV 至關(guān)重要。 有研究者利用可編程CRISPR 系統(tǒng)， 并應(yīng)用聚丙烯酰胺-DNA 水凝膠設(shè)計(jì)微流體紙基分析裝置（μPAD），該裝置包括具有拓?fù)渑帕杏H水區(qū)域的多層結(jié)構(gòu)，特定dsDNA 的存在可激活Cas12a 以切割第二層中的ssDNA 交聯(lián)劑，從而抑制水凝膠的形成。 當(dāng)緩沖液流經(jīng)整個(gè)裝置，在染料存在的情況下可以實(shí)現(xiàn)可視化檢測(cè)。 同時(shí)，通過比色長度測(cè)量，5 min 即可定量檢測(cè)病毒的濃度，檢出限低至11 amol/L[67]。 此外，該體系使用的無線識(shí)別模塊被整合到μPAD 中進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，可實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)的即時(shí)反饋， 基于CRISPR/Cas 的μPAD在便攜性、靈敏度和低成本方面表現(xiàn)出優(yōu)異的性能。

3.3 蛋白質(zhì)檢測(cè)

CRISPR/Cas 系統(tǒng)也用于檢測(cè)非核酸目標(biāo)，如蛋白質(zhì)、酶、金屬離子和小分子物質(zhì)等。 通常CRISPR/Cas 系統(tǒng)被用作信號(hào)放大器， 因?yàn)榉呛怂岬陌袠?biāo)分子不能被直接識(shí)別，通常需要摻入識(shí)別元件，如功能性核酸（脫氧核酶和適體）、抗體和細(xì)菌變構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子。

Dai 等利用蛋白質(zhì)適配體的優(yōu)異識(shí)別能力，構(gòu)建了一種基于CRISPR/Cas12a 的電化學(xué)生物傳感器（E-CRISPR）。 蛋白質(zhì)（TGF-β1）適配體復(fù)合物的形成可以阻止Cas12a 切割ssDNA 報(bào)告基因， 從而導(dǎo)致電流強(qiáng)度迅速降低，獲得報(bào)告信號(hào)，檢測(cè)限低至0.2 nmol/L[68]。 此外，該測(cè)定方法可用于人間充質(zhì)干細(xì)胞軟骨分化過程中的TGF-β1 的檢測(cè)， 無須復(fù)雜的樣品預(yù)處理。Chen 等開發(fā)了一種CRISPR/Cas13a的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 （Cas13a signal amplification linked immunosorbent assay，CELISA）方法，采用雙抗體來捕獲蛋白質(zhì)。 輸出熒光信號(hào)可以通過T7 RNA 聚合酶轉(zhuǎn)錄和CRISPR/Cas13a 反式切割活性進(jìn)行雙倍放大，對(duì)白細(xì)胞介素6（interleukin，IL-6）和血管內(nèi)皮生長因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF） 的檢測(cè)限分別為2.29 fmol/L 和0.81 fmol/L，檢測(cè)靈敏度是傳統(tǒng)ELISA 試劑盒的100 倍[69]。Du 等設(shè)計(jì)了一個(gè)基于CRISPR/Cas 生物傳感系統(tǒng)的啞鈴形尿嘧啶-DNA 糖基化酶 （uracil-DNA glycosylase，UDG）作用底物（eSUDG）。 啞鈴形尿嘧啶-DNA 糖基化酶在莖部含有一個(gè)尿嘧啶堿基，UDG 可以特異性地去除尿嘧啶堿基以產(chǎn)生無嘧啶位點(diǎn)，該位點(diǎn)可以被Endo.IV 核酸酶進(jìn)一步切割，這會(huì)產(chǎn)生帶有3′OH 末端的游離ssDNA。隨后，在脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminal transferase，TdT）的介導(dǎo)下聚合以形成長的PolyT 序列。 由于Cas12a 的crRNA本身具有Poly（A）序列，因此Cas12a 效應(yīng)子可以被激活并對(duì)ssDNA 探針進(jìn)行切割，從而產(chǎn)生熒光信號(hào)[70]。所提出的生物傳感器實(shí)現(xiàn)了UDG 和Dam MTase 兩種酶活性的檢測(cè)， 檢測(cè)限分別為5×10-6U/mL 和1×10-4U/mL[70-71]。

3.4 小分子物質(zhì)檢測(cè)

開發(fā)特異性、簡單且可推廣的小分子檢測(cè)方法對(duì)于生物應(yīng)用具有很強(qiáng)的吸引力， 包括環(huán)境監(jiān)測(cè)、醫(yī)學(xué)診斷和法醫(yī)甄別[72-74]。 然而，光譜和質(zhì)譜技術(shù)等“金標(biāo)準(zhǔn)”分析過程耗時(shí)，且依賴大型儀器[75]。 Liang等報(bào)道了一種CRISPR/Cas12a 和細(xì)菌變構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子（allosteric transcription factor，aTF）介導(dǎo)的小分子檢測(cè)器，稱為CaT-SMelor。 該系統(tǒng)需要與dsDNA 探針和Cas12a-crRNA 介導(dǎo)的熒光報(bào)告基因結(jié)合的固定化aTF。 當(dāng)存在靶標(biāo)分子的情況下，aTF 通過改變其構(gòu)象以將dsDNA 從aTF 結(jié)合結(jié)構(gòu)域解離， 之后dsDNA 與Cas12a 的結(jié)合可以激活Cas12a 非特異性切割ssDNA 報(bào)告基因，從而產(chǎn)生恢復(fù)的熒光[72]。 該系統(tǒng)的檢測(cè)時(shí)間只需要25 min， 且檢測(cè)限可達(dá)到0.25 nmol/L，滿足實(shí)際樣品（166.4~546.7 mmol/L）尿酸分析的要求[76-77]。

對(duì)于非核酸物質(zhì)的檢測(cè)通常需要利用特殊的適體將非核酸信號(hào)轉(zhuǎn)化為核酸信號(hào)。Abnous 等基于AuNPs、CRISPR/Cas12a 和RCA 催化活性開發(fā)的比色適體傳感器， 將RCA、CRISPR/Cas12a 和AuNPs組合使得在黃曲霉毒素M1（AFM1）存在時(shí)形成大的DNA 結(jié)構(gòu)， 作為顯色劑的4-硝基苯酚無法進(jìn)入AuNPs 表面；而當(dāng)AFM1不存在時(shí)，4-硝基苯酚可自由到達(dá)AuNPs 表面， 此時(shí)的AuNPs 表面僅保留非常短的寡核苷酸， 通過4-硝基苯酚對(duì)AuNPs 表面的結(jié)構(gòu)和光譜的影響，可靈敏地識(shí)別加標(biāo)牛奶樣品中的AFM1[78]。 Mao 等構(gòu)建了一種上轉(zhuǎn)換納米粒子（up conversion nanoparticles，UCNP）探針來檢測(cè)赭曲霉毒素A （OTA）。 基于OTA 適體構(gòu)建毒素的dsDNA 探針， 當(dāng)存在OTA 時(shí)，OTA 適體與OTA 競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合并釋放激活鏈（OTA 適體互補(bǔ)鏈），激活鏈被CRISPR/Cas12a 復(fù)合物識(shí)別并激活Cas12a 反式切割ssDNA 的活性。 結(jié)果表明，OTA 濃度與激活鏈和熒光值成正比并用于檢測(cè)玉米粉中的OTA[79]。Wu等通過將CRISPR/Cas14a 系統(tǒng)與二維卟啉金屬有機(jī)框架納米片 （2D porphyrin metal -organic framework，pMOFs）相結(jié)合，研究了一種新型多功能的Cas14-pMOFs 熒光傳感器用于檢測(cè)飲用水和自來水中的微囊藻毒素-LR，在3.5 h 內(nèi)可達(dá)到19 pg/mL的檢測(cè)靈敏度[80]。

4 展 望

作為基因編輯工具的固有特性，CRISPR 靶向識(shí)別活性已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了廣泛應(yīng)用，包括生物傳感分析和成像分析等，Cas 效應(yīng)子的反式切割活性為超靈敏和便攜式核酸檢測(cè)提供了有效的信號(hào)輸出系統(tǒng)。CRISPR 檢測(cè)方案有幾個(gè)共同的特征，如快速、恒溫和便捷， 幾乎所有的CRISPR 系統(tǒng)都可以在短時(shí)間內(nèi)（如幾分鐘）在溫和的條件下完成反應(yīng)，這是基于CRISPR 的核酸檢測(cè)工具最突出的優(yōu)勢(shì)。 總之，從表3 中可以看出， 基于結(jié)合活性和切割活性，CRISPR/Cas 系統(tǒng)已經(jīng)成為多種目標(biāo)檢測(cè)的通用工具， 包括核酸、蛋白質(zhì)、金屬離子、細(xì)菌和小分子。 CRISPR/Cas 技術(shù)簡單，具有特異性，靈敏度高，可結(jié)合多種技術(shù)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)檢測(cè)，其性能等同于或優(yōu)于傳統(tǒng)檢測(cè)方法。雖然已經(jīng)取得了顯著的進(jìn)步，但CRISPR 診斷工具仍然面臨一些挑戰(zhàn)。 目前存在問題及解決措施如下所示：

表3 基于CRISPR/Cas 的生物傳感平臺(tái)概述Table 3 Overview of CRISPR/Cas-based biosensing platforms

1）脫靶效應(yīng) 在CRISPR/Cas 系統(tǒng)中，脫靶效應(yīng)一直受到關(guān)注。 在檢測(cè)過程中，需要仔細(xì)考慮脫靶效應(yīng)可能導(dǎo)致假陰性或假陽性結(jié)果。 多種因素影響脫靶效應(yīng)， 如Cas 效應(yīng)子本身對(duì)錯(cuò)配的容忍度、crRNA 與Cas 效應(yīng)子的結(jié)合沒有發(fā)生在 “敏感區(qū)域”、設(shè)計(jì)的向?qū)NA 序列具有兼容性[81]和靶核酸序列與向?qū)NA 序列之間的堿基錯(cuò)配程度[82]等。對(duì)于Cas 效應(yīng)子， 不同Cas 效應(yīng)子的結(jié)構(gòu)特征和來源對(duì)脫靶效應(yīng)有顯著影響。 靶標(biāo)和gRNA 序列之間的堿基錯(cuò)配也是產(chǎn)生脫靶效應(yīng)的主要原因，完全或部分互補(bǔ)的核酸序列導(dǎo)致了脫靶的可能性，特別是當(dāng)非種子區(qū)域中存在錯(cuò)配的堿基對(duì)時(shí)，致使一些非靶標(biāo)序列可能激活Cas 效應(yīng)子，產(chǎn)生背景信號(hào)，并導(dǎo)致CRISPR/Cas 生物傳感系統(tǒng)的整體靈敏度相對(duì)較低[76，83]。 目前也有一些措施用于減少脫靶效應(yīng)，如通過人工突變構(gòu)建了高保真Cas9 效應(yīng)子[84]、使用Cas9鎳酶和成對(duì)的向?qū)NA 來最大化降低脫靶效應(yīng)[85]。此外， 新發(fā)現(xiàn)的Cas 效應(yīng)子也可以提高靶向活性，如Cas12b[86]、Cas13d[87]。機(jī)器學(xué)習(xí)在脫靶預(yù)測(cè)和優(yōu)化向?qū)NA 設(shè)計(jì)方面等具有較大的潛力[88-91]。 通過對(duì)CRISPR 數(shù)據(jù)庫的不斷學(xué)習(xí)和訓(xùn)練， 脫靶效應(yīng)將得到精確預(yù)測(cè)，該方法可廣泛應(yīng)用于CRISPR/Cas 系統(tǒng)。

2）檢測(cè)目標(biāo)物的有限性 為了準(zhǔn)確識(shí)別靶序列，大多數(shù)Cas 效應(yīng)子，如Cas9、Cas12a 和Cas13a，需要包含短序列基序（PAM 或PFS）的靶標(biāo)[25]。 雖然這一要求可以顯著增加CRISPR/Cas 系統(tǒng)的特異性，但也限制了靶標(biāo)區(qū)域的選擇。 此外，不同類型和來源的Cas 效應(yīng)子具有各自的短序列基序（如LbCas12a的5′TTTN 和SpCas9 的3′NGG）， 這意味著一個(gè)特定的靶序列只能被一個(gè)Cas 效應(yīng)子識(shí)別，并降低了CRISPR/Cas 系統(tǒng)的靈活性。 因此，當(dāng)CRISPR/Cas 系統(tǒng)直接檢測(cè)目標(biāo)序列時(shí)，可選擇的目標(biāo)序列可能很少，尤其是檢測(cè)短序列或區(qū)分單核苷酸多態(tài)性。 此外，為了實(shí)現(xiàn)非核酸的檢測(cè)，一些功能核酸通常被用來將非核酸信號(hào)轉(zhuǎn)換成核酸信號(hào)。 但是，對(duì)短序列基序的要求可能需要在一定程度上改變功能核酸的結(jié)構(gòu)，并進(jìn)一步影響它們的特異性或檢測(cè)靈敏度。 減少對(duì)短序列的依賴性同時(shí)保證其特異性，或許是擴(kuò)大檢測(cè)范圍的重點(diǎn)。 最近有研究者構(gòu)建了一個(gè)名為SpG 的近似無須PAM 的SpCas9 變體，能夠靶向具有非G 的PAM[92]。 隨著對(duì)Cas 效應(yīng)子結(jié)構(gòu)的不斷研究，更多的Cas 效應(yīng)子將滿足對(duì)短序列的檢測(cè)需求，擴(kuò)大應(yīng)用范圍。

3）多靶點(diǎn)檢測(cè) 雖然通過CRISPR/Cas 系統(tǒng)已經(jīng)成功開發(fā)了許多用于各種目標(biāo)物的檢測(cè)方法，但從單個(gè)樣品中同時(shí)檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)物仍然難以實(shí)現(xiàn)[93-94]。 原因主要?dú)w因于一旦Cas 效應(yīng)子和gRNA的復(fù)合物被靶標(biāo)激活，Cas 效應(yīng)子就表現(xiàn)出非特異性反式切割活性， 所以依靠CRISPR/Cas 系統(tǒng)本身進(jìn)行多重檢測(cè)可能不是一個(gè)好的選擇。 相反，通過物理分離將Cas 效應(yīng)子、gRNA 或它們的混合物分離到不同的區(qū)域來進(jìn)行檢測(cè)應(yīng)該是更好的解決方案[95]。 但是，仍有許多工作需要考慮，包括設(shè)計(jì)合適的分離結(jié)構(gòu)（如二氧化硅/玻璃微陣列或硝酸纖維素膜）， 建立便攜式讀出技術(shù) （如比色讀數(shù)或熒光讀數(shù)）等。

4）便攜式檢測(cè)平臺(tái)的設(shè)計(jì) 為了使CRISPR/Cas 系統(tǒng)更有吸引力， 更廣泛地應(yīng)用于不同目標(biāo)物的檢測(cè)， 特別是在資源有限的地區(qū)， 利用CRISPR/Cas 系統(tǒng)建立一些簡單、低成本、方便的檢測(cè)平臺(tái)是非常重要的。 在最近的新型冠狀病毒肺炎疫情中，基于CRISPR 的2019 新型冠狀病毒檢測(cè)方法已被廣泛研究，并因其高靈敏度和特異性而在控制新型冠狀病毒肺炎疫情方面發(fā)揮了重要作用[64，96-97]，但這些檢測(cè)方法主要限于實(shí)驗(yàn)室使用。 對(duì)于通常使用的基于熒光的CRISPR 傳感系統(tǒng)， 構(gòu)建具有高效的光信號(hào)收集的小型熒光探測(cè)器對(duì)于便攜式信號(hào)讀取非常有必要。 目前已有研究者設(shè)計(jì)了一個(gè)口袋大小的熒光檢測(cè)器用于讀取熒光信號(hào)變化[98]。 在處理大規(guī)模檢測(cè)時(shí)，樣本之間可能的交叉污染仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。 在這種情況下，將CRISPR 檢測(cè)與工程、微電子和小型化相結(jié)合可能會(huì)提高檢測(cè)通量和自動(dòng)化程度。 微流控平臺(tái)可以在幾平方厘米的系統(tǒng)上集成大型測(cè)試實(shí)驗(yàn)室的所有功能，包括處理樣品、轉(zhuǎn)移溶液、混合試劑、加熱等。 未來的工作可能需要專注于建立基于CRISPR 的便攜式微流控檢測(cè)平臺(tái)，攜帶所有必要的試劑，整個(gè)操作過程可以自動(dòng)或半自動(dòng)完成。 此外，便攜式檢測(cè)平臺(tái)中的CRISPR/Cas 系統(tǒng)試劑可以凍干或脫水，便于運(yùn)輸和儲(chǔ)存[31]，據(jù)報(bào)道， 脫水的Cas12a 比Cas12a 溶液具有更好的熱穩(wěn)定性[99]。樣本處理對(duì)于目標(biāo)檢測(cè)也非常重要，在未來發(fā)展中，將CRISPR 檢測(cè)與工程、材料和人工智能相結(jié)合的多學(xué)科聯(lián)合將使CRISPR/Cas 系統(tǒng)更加強(qiáng)大。

5）可穿戴設(shè)備的研究與應(yīng)用 將CRISPR 診斷和檢測(cè)系統(tǒng)集成到可穿戴設(shè)備中，可以無創(chuàng)監(jiān)測(cè)生理狀況、疾病狀態(tài)，檢測(cè)可能接觸到的病原體或毒素。CRISPR/Cas 系統(tǒng)與水凝膠耦合構(gòu)建刺激響應(yīng)材料，可以將生物信息轉(zhuǎn)化為材料性質(zhì)的變化[67]，為智能生物傳感器的發(fā)展提供了一條途徑。 此外，最近有研究者研制了一種帶有凍干CRISPR 傳感器的面罩[100]，是一種可以實(shí)現(xiàn)耐儲(chǔ)存、基因可編程和高靈敏度的可穿戴生物傳感器，將這些生物傳感器集成到與無線網(wǎng)絡(luò)兼容的服裝中，并使用定制的智能手機(jī)應(yīng)用程序提供實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)。

目前，盡管仍有一些挑戰(zhàn)需要克服，但隨著對(duì)每個(gè)CRISPR/Cas 系統(tǒng)機(jī)制的不斷了解和更多Cas效應(yīng)子的發(fā)現(xiàn)，CRISPR/Cas 系統(tǒng)將以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)在未來的各種目標(biāo)檢測(cè)中變得更加完善。