隱球菌莢膜多糖抗原膠體金免疫層析法在隱球菌性腦膜炎診斷中的臨床應(yīng)用

廖一群，龔駿杰，鄒琴娓，盧洪飛，丁小麗

（1. 贛南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院檢驗科；2. 贛南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江西 贛州 341000）

新型隱球菌是隱球菌屬的主要菌種之一，屬于一種條件致病性真菌，廣泛存在于土壤及鴿糞中，隱球菌性腦膜炎是最常見的肺外感染［1-2］，臨床上無明顯的年齡、性別傾向性，長期使用激素、廣譜抗生素、免疫抑制劑等免疫功能缺陷或低下的患者易引起隱球菌感染。隱球菌性腦膜炎主要表現(xiàn)為頭痛、發(fā)熱、腦膜刺激癥、嘔吐等精神和神經(jīng)癥狀，很多病例因缺乏特異性特征而造成誤診［3］。長期以來，實驗室缺乏快速準確的方法診斷隱球菌性腦膜炎，因此尋求一種靈敏度和特異度均較高的實驗室診斷方法顯得尤為重要。本研究應(yīng)用隱球菌莢膜多糖抗原膠體金免疫層析法（Crypto-coccalantigen lateral flow immunoassay，CrAg-LFA）檢測隱球菌莢膜多糖抗原，并與傳統(tǒng)的真菌培養(yǎng)法和墨汁染色法進行比較，探討其診斷隱球菌性腦膜炎的臨床價值。

1 資料與方法

1. 1 臨床資料以2010年中國真菌學雜志發(fā)表的《中國隱球菌診治專家共識》［4］為標準，即根據(jù)病史、臨床癥狀、體征、實驗室檢查（病理檢查或病原學檢查）及抗真菌治療效果，收集2019 年9 月—2021 年10 月贛南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院27 例確診為隱球菌性腦膜炎患者的臨床資料，其中男11 例，女16 例，年齡32～84 歲。選取33 例同期經(jīng)臨床確診為細菌性腦膜炎、結(jié)核性腦膜炎或腦部腫瘤等非隱球菌性腦膜炎患者為對照組，其中男19 例，女14 例，年齡14～79歲。

1. 2 試劑和儀器隱球菌莢膜多糖抗原檢測試劑盒（美國Immy 公司）、印度墨汁（北京華越洋DM0103）、革蘭染色液（珠海貝索）、美國Bruker全自動快速生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)、美國BD BACTEC FX200系列全自動血培養(yǎng)儀、法國生物梅里埃VITEK-2 Compact全自動細菌鑒定儀及配套鑒定卡。

1. 3 方法

1. 3. 1 真菌培養(yǎng)法抽取3～5 mL 腦脊液接種至BD 真菌培養(yǎng)瓶，置于BACTEC FX200全自動血培養(yǎng)儀培養(yǎng)2～5 d，報警陽性標本立即轉(zhuǎn)種至沙保弱葡萄糖瓊脂（SDA）培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)，采用Bruker 質(zhì)譜儀或VITEK-2 Compact 全自動細菌鑒定儀進行菌種鑒定。

1. 3. 2 墨汁染色法根據(jù)墨汁染色操作標準，選用印度墨汁，將1 mL 以上腦脊液3 000 r·min-1離心10 min，棄去上清液，取沉渣與墨汁混勻后，加蓋玻片直接鏡檢。在黑色背景下，新型隱球菌可見到透亮的菌體和寬厚莢膜。

1. 3. 3 CrAg-LFA無菌操作收集腦脊液，嚴格按照隱球菌莢膜多糖抗原檢測試劑盒說明書進行操作，結(jié)果出現(xiàn)一條質(zhì)控線為陰性，質(zhì)控線與檢測線同時出現(xiàn)為陽性，只出現(xiàn)檢測線而無質(zhì)控線則檢測失敗，如圖1。

圖1 CrAg-LFA實驗方法

1. 4 觀察指標計算CrAg-LFA、真菌培養(yǎng)法、墨汁染色法檢測隱球菌的陽性率和陰性率，比較三種方法的靈敏度和特異度。

2 結(jié) 果

27 例隱球菌性腦膜炎患者腦脊液檢查結(jié)果：CrAg-LFA陽性26例，陽性率96. 30%；真菌培養(yǎng)法陽性19 例，陽性率70. 37%；墨汁染色法陽性10 例，陽性率37. 04%。對照組33例，真菌培養(yǎng)法和墨汁染色法結(jié)果均為陰性，特異度均為100. 00%，CrAg-LFA陽性1例，特異度為96. 97%，見表1。

3 討 論

新型隱球菌主要通過呼吸道進入人體，在肺部形成病灶后經(jīng)血液循環(huán)播散至腦及腦膜，從而引起腦膜炎［5］，是人類面臨的一種嚴重的深部真菌病。不少患者起初診斷為結(jié)核等感染性疾病，部分病例當肺癌或腦腫瘤治療［6-7］，因此常延誤該病診治［8］，病死率也較高。據(jù)報道［9］，2014 年全球新發(fā)隱球菌性腦膜炎病例超過22 萬例，死亡人數(shù)超過18 萬人，在北美，感染該病一年后的死亡率為10%～30%，低收入國家其死亡率為50%～100%。

目前，臨床實驗室診斷隱球菌性腦膜炎的方法主要有病理檢查、病原學檢查（墨汁染色和真菌培養(yǎng)）和免疫學方法?；鶎訉嶒炇胰栽谑褂媚旧?，該法不需特殊設(shè)備，操作簡便，但結(jié)果判斷受主觀因素影響較大；真菌培養(yǎng)法雖特異性高，但耗時長（3～5 d），且操作具有創(chuàng)傷性，不被大多數(shù)患者接受；CrAg-LFA 通過免疫層析技術(shù)檢測血清或腦脊液標本中的隱球菌莢膜多糖成分，是一種新型檢測方法，操作簡便，報告即時。

本研究結(jié)果顯示，墨汁染色法檢測的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別為37. 04%、100. 00%、100. 00%、66. 00%；真菌培養(yǎng)法檢測的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別為70. 37%、100. 00%、100. 00%、80. 49%，這兩種方法的特異度雖然很高，但靈敏度均遠低于國內(nèi)外文獻報道（86. 00%～96. 15%）［10-13］。CrAg-LFA 檢測的靈敏度和特異度均較高，分別為96. 30% 和96. 97%，與國內(nèi)外研究報道［10-13］較一致。在本研究的33例對照組樣本中，1 例CrAg-LFA 結(jié)果出現(xiàn)陽性，提示某些因素可導致交叉反應(yīng)。有研究表明［14-15］，系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕因子、毛孢子菌屬、結(jié)核桿菌均與新生隱球菌的莢膜多糖抗原存在交叉反應(yīng)，可引起假陽性，此例假陽性結(jié)果的患者診斷為類風濕關(guān)節(jié)炎，與研究報道一致。此外，由于死亡的隱球菌菌體仍可持續(xù)釋放莢膜多糖抗原，而機體清除此類抗原相對較慢，即使在有效治療數(shù)月后，患者體液多次真菌涂片及培養(yǎng)轉(zhuǎn)陰后，體液的抗原檢測仍可陽性，所以抗原檢測是否轉(zhuǎn)陰不能作為隱球菌病是否治愈的指標。

CrAg-LFA 是一種簡便快速的隱球菌性腦膜炎篩查方法，可提高疾病的早期診斷率，但應(yīng)注意可引起假陽性的因素，避免誤診。