BCR-ABL陰性的骨髓增殖性腫瘤中PD-1和PD-L1的表達研究

彭 芳，鐘 斌，張功亮，王 建，王 志

（1. 贛州市人民醫(yī)院病理科；2. 贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部；3. 贛州市兒童白血病腫瘤免疫治療藥物研發(fā)重點實驗室，江西 贛州 341000）

骨髓增生性疾?。∕yeloproliferative diseases，MPD）是分化相對成熟的一系或多系骨髓細胞持續(xù)克隆性增殖所致的一組腫瘤性疾病。BCR-ABL 陰性的MPD 主要包括真性紅細胞增多癥（Polycythemia vera，PV），原發(fā)性血小板增多癥（Essential thrombocythemia，ET），原發(fā)性骨髓纖維化（Primary myelofibrosis，PMF）等。 程序性死亡受體1（programmed death 1，PD-1）是一種重要的免疫抑制分子，為免疫球蛋白超家族［1］。其最初是從凋亡的小鼠T 細胞雜交瘤2B4. 11 克隆出來［2-3］。以PD-1 為靶點的免疫調(diào)節(jié)對抗腫瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病及器官移植存活等均有重要意義［4-6］。其配體PD-L1也可作為靶點，相應(yīng)的抗體也可起到相同的作用［5］。PD-1 和PD-L1 結(jié)合啟動T 細胞的程序性死亡，使腫瘤細胞獲得免疫逃逸［7］。血液系統(tǒng)腫瘤主要采取化療的治療方式，抗PD-1/抗PD-L1免疫治療是腫瘤新的治療模式，本研究主要分析30 例BCR-ABL 陰性的骨髓增殖性腫瘤的臨床資料、病理形態(tài)學(xué)特征及PD-1 和PD-L1 免疫組化表達情況。探討這些患者能否在抗PD-1/抗PD-L1免疫治療中獲益，從而提高生命質(zhì)量和帶瘤生存時間。

1 材料和方法

1. 1 一般資料收集2011 年8 月至2020 年8 月贛州市人民醫(yī)院骨髓涂片、病理活檢、流式細胞學(xué)和分子遺傳學(xué)等診斷為真性紅細胞增多癥5例（男性3例，女性2 例，中位年齡51 歲），原發(fā)性血小板增多癥10 例（男性6 例，女性4 例，中位年齡50 歲），原發(fā)性骨髓纖維化15 例（男性8 例，女性7 例，中位年齡52 歲），骨髓穿刺活檢部位均為髂后上棘，所有骨髓活檢病例均經(jīng)2名有經(jīng)驗的病理醫(yī)師復(fù)核確診?；仡櫡治龌颊叩呐R床資料和患者預(yù)后隨訪情況。

1. 2 實驗試劑一抗PD-1、PD-L1、Elivision 試劑盒、二抗試劑盒和DAB 試劑均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，并設(shè)陽性對照和陰性對照。

1. 3 免疫組織化學(xué)方法所有標本均經(jīng)4%中性甲醛固定，石蠟包埋，常規(guī)3 μm 切片，做HE 染色及免疫組織化學(xué)檢查。免疫組織化學(xué)采用EnVision兩步法，行高溫抗原修復(fù)，DAB顯色。

1. 4 結(jié)果判定結(jié)果由2 名高年資病理專科醫(yī)師進行雙盲獨立閱片，PD-1 細胞膜和/或細胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃至棕褐色為陽性表達，PD-L1 以細胞膜出現(xiàn)棕黃至棕褐色為陽性表達。選取3 個高倍鏡視野（×400）區(qū)域計數(shù)陽性細胞數(shù)占全部細胞的比例，以5%的細胞陽性為分界值［8］。

1. 5 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 19. 0 軟件進行分析，計數(shù)資料用例數(shù)（n）表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料用率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；等級變量相關(guān)性分析采用spearman 相關(guān)性分析。P＜0. 05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2. 1 檢驗學(xué)和病理學(xué)特點真性紅細胞增多癥：患者血常規(guī)表現(xiàn)血紅蛋白持續(xù)升高（男性＞18. 5 g·dL-1，女性＞16. 5 g·dL-1），部分病例血小板和白細胞升高；骨髓活檢顯示骨髓增生極度活躍，巨核細胞有特征性，巨核細胞增多，且形態(tài)多樣，有胞體大、分葉多的巨核細胞，也出現(xiàn)胞體小、分葉少的巨核細胞及正常形態(tài)的巨核細胞（圖1）。

圖1 真性紅細胞增多癥（HE×100）

原發(fā)性血小板增多癥：患者血常規(guī)表現(xiàn)血小板持續(xù)升高（＞1 000×109·L-1）；骨髓活檢增生程度較真性紅細胞增多癥低，顯示骨髓增生較活躍，巨核細胞數(shù)量增多，巨核細胞形態(tài)特征較明顯，常表現(xiàn)為胞體大、分葉多的巨核細胞，巨核細胞核常呈“鹿角樣”，粒紅比例大致正常，粒系各階段可見，以中幼及以下階段為主，嗜酸粒細胞散在分布，紅系各階段細胞可見，以中晚幼紅細胞為主，淋巴細胞、漿細胞散在分布（圖2）。

圖2 原發(fā)性血小板增多癥（HE×200）

原發(fā)性骨髓纖維化：患者血常規(guī)表現(xiàn)貧血和血小板明顯增高；骨髓活檢組織中纖維組織廣泛增生，粒紅比例增高，粒系各階段可見，以中幼及以下階段為主，嗜酸粒細胞增多，紅系各階段細胞可見，以中晚幼紅細胞為主，巨核細胞不少，可見胞體小、分葉少的巨核細胞；淋巴細胞、漿細胞散在分布。

2. 2 免疫組織化學(xué)特點PD-1 陽性率：真性紅細胞增多癥陽性率20. 0%，原發(fā)性血小板增多癥陽性率30. 0%，原發(fā)性骨髓纖維化陽性率20. 0%，總陽性率23. 3%；PD-L1 陽性率：真性紅細胞增多癥陽性率20. 0%，原發(fā)性血小板增多癥陽性率30. 0%，原發(fā)性骨髓纖維化陽性率33. 3%，總陽性率30. 0%（圖3、圖4、表1）。

圖3 真性紅細胞增多癥PD-1的表達（EnVision×200）

圖4 真性紅細胞增多癥PD-1的表達（EnVision×400）

表1 BCR-ABL陰性的骨髓增值性腫瘤中PD-1和PD-L1的表達/n（%）

2. 3 BCR-ABL 陰性的骨髓增殖性腫瘤中PD-1 和PD-L1 表達與臨床特征關(guān)系不同年齡和不同性別骨髓組織中PD-l 和PD-L1 的表達水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0. 05）。高危組骨髓組織中PD-l 和PD-L1 表達水平高于低危和中危組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0. 05）（表2）。

表2 不同臨床特征在BCR-ABL 陰性的骨髓增殖性腫瘤中PD-1和PD-L1表達情況/n（%）

3 討 論

PD-1 通過調(diào)節(jié)T 細胞活性，激活抗原特異性T細胞凋亡并抑制調(diào)節(jié)性T細胞凋亡。程序性細胞死亡配體1（PD-L1）是一種跨膜蛋白，被認為是免疫反應(yīng)的共同抑制因子，它可與PD-1結(jié)合以減少PD-1陽性細胞的增殖，抑制其細胞因子分泌并誘導(dǎo)細胞凋亡［9-10］。PD-1/PD-L1 軸在腫瘤的進展中起著至關(guān)重要的作用，它可通過改變免疫監(jiān)視狀態(tài)治療腫瘤。PD-1/PD-L1 抑制劑是一些難治性腫瘤治療的突破。然而，生物標志物反映腫瘤免疫微環(huán)境和腫瘤細胞內(nèi)在特征，如PD-L1表達、細胞密度腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）、腫瘤突變負荷和錯配修復(fù)（MMR）缺陷已被證實與抗PD-1/抗PD-L1治療效果相關(guān)［11-12］。

本研究選取30 例初發(fā)BCR-ABL 陰性的骨髓增殖性腫瘤患者，進行骨髓活檢組織中PD-1 和PD-L1檢測，PD-1陽性率為23. 3%，PD-L1陽性率為30. 0%。根據(jù)文獻報道健康對照者PD-1 和PD-L1 陽性率約6% 和5%［8-13］，本研究結(jié)果顯示，PD-1 和PD-L1 陽性表達率明顯高于健康對照患者，BCR-ABL 陰性的骨髓增殖性腫瘤患者存在PD-1 和PDL-1 的過度表達。但低于文獻報道的PD-1 和PDL-1 陽性率約50% 和55%［13］。主要原因有：⑴文獻報道的檢查方法較敏感，通過血液標本檢測相對于病理活檢標本經(jīng)過福爾馬林固定、脫鈣和烘烤制片后，抗體被破壞得較少。下一步將考慮用未經(jīng)過福爾馬林固定的骨髓標本做免疫組化檢查；⑵本研究病例的數(shù)量較少，下一步研究將擴大病例數(shù)，并添加治療組和健康對照組，將資料進一步完善。

通過對BCR-ABL 陰性的骨髓增殖性腫瘤患者的臨床特征研究發(fā)現(xiàn)，PD-1 和PD-L1 的表達和患者的臨床危險程度分組呈正相關(guān)，提示PD-1 和PD-L1高表達的患者危險程度越高，與PD-1 和PD-L1 在其他腫瘤，如膀胱癌、肺癌等研究結(jié)果相似［8］；患者的年齡、性別與PD-1 和PD-L1 表達情況差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明PD-1 和PD-L1 陽性表達與患者年齡、性別等方面無明顯相關(guān)性，與其他一些研究結(jié)果相似［9-10］。

4 結(jié) 論

本研究提示，PD-1和PD-L1在BCR-ABL陰性的骨髓增殖性腫瘤患者中呈高表達，本研究結(jié)果為進一步揭示BCR-ABL 陰性的骨髓增殖性腫瘤的臨床發(fā)病機制提供了基礎(chǔ)。