轉(zhuǎn)錄因子EB通過細胞自噬調(diào)節(jié)腫瘤進展的作用及機制

張夢婷，呂曉名，王嵐楓，陳志平

（1. 贛南醫(yī)學(xué)院2020級碩士研究生；2. 贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院；3. 贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科；4. 贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗科，江西 贛州 341000）

1 TFEB的分子生物學(xué)性質(zhì)

轉(zhuǎn)錄因子EB（Transcription factor EB，TFEB）是小眼畸形轉(zhuǎn)錄因子家族（Microphthalmia transcription factor E，MiT-TFE）成員之一，該家族還包括：小眼相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（Microphthalmia-associated transcription factor，MITF）、轉(zhuǎn)錄因子E3（Transcription factor E3，TFE3）和轉(zhuǎn)錄因子EC（Transcription factor EC，TFEC）。所有這些轉(zhuǎn)錄因子都具有高度相似的同源序列，由堿性螺旋-環(huán)-螺旋亮氨酸拉鏈（Basic helix-loop-helix leucine zipper，bHLHZIP）二聚序列、反激活區(qū)、DNA 結(jié)合域組成。所有的MiT-TFE 轉(zhuǎn)錄因子家族都含有與一個回文DNA 序列E-box結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，該DNA 序列位于其靶基因啟動子附近［1］。TFEB的基因定位于Chr 6p21. 1 區(qū)域，可轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生2 364 bp 長的mRNA，包括2 個非編碼外顯子和8 個編碼外顯子［2］。

TFEB 是溶酶體生物合成和自噬的主要調(diào)控因子，TFEB通過去磷酸化解除與14-3-3蛋白的結(jié)合作用，從而進入細胞核，轉(zhuǎn)錄下游靶基因后誘導(dǎo)自噬。自噬通常由大自噬（Macroautophagy，MA）、伴侶介導(dǎo)的自噬（Chaperone-mediated autophagy，CMA）和微自噬（Microautophagy，MIA）組成，自噬常被以下刺激激活：如代謝或環(huán)境應(yīng)激、營養(yǎng)剝奪、氧化應(yīng)激、缺氧和感染等［3］。自噬在腫瘤細胞中具有兩種作用：一方面它可通過阻礙慢性組織損傷，促進腫瘤蛋白底物、錯誤折疊的蛋白以及受損細胞器的清除，從而抑制腫瘤發(fā)生［4］；另一方面它又可通過增強自噬介導(dǎo)的細胞內(nèi)循環(huán)來加快腫瘤惡性進程［5］，也可通過增強腫瘤細胞自噬來增強腫瘤的惡性特征表達［6］。TFEB 介導(dǎo)的溶酶體到細胞核的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路由mTORC1、PKC、AKT、ERK2、MAP4K3/GLK、鈣調(diào)磷酸酶等進行調(diào)控［7］。TFEB 在線粒體功能障礙疾病如代謝綜合征、神經(jīng)退行性疾病、糖尿病、肥胖等疾病中發(fā)揮著重要作用，在大部分腫瘤中，mTORC1對TFEB核定位的調(diào)節(jié)占主導(dǎo)地位［8］。

2 TFEB核定位的激活誘導(dǎo)自噬

2. 1 mTORC1 介導(dǎo)的TFEB 磷酸化在營養(yǎng)充足的正常細胞中，溶酶體腔內(nèi)的氨基酸通過一種依賴于溶酶體v-ATPase的機制改變Rag的活化狀態(tài)［9］，溶酶體表面活化狀態(tài)的Rag GTPases（即GTP 結(jié)合的RagA/B 和GDP 結(jié)合的RagC/D）和mTORC1 復(fù)合體的Raptor 亞基相互結(jié)合，使mTORC1 被招募到溶酶體膜表面［10-11］，mTORC1 磷酸化TFEB 中的3 個特定的絲氨酸殘基S122、S211、S142，導(dǎo)致TFEB與14-3-3蛋白相互作用并保留在細胞質(zhì)中［12］。當(dāng)細胞處于饑餓或溶酶體應(yīng)激狀態(tài)時，Rag GTPases、mTORC1失活并被溶酶體膜釋放，TFEB 去磷酸化導(dǎo)致其與14-3-3 蛋白分離，從而使TFEB 進入細胞核內(nèi)。TFEB 進入細胞核后，與溶酶體基因啟動子區(qū)的CLEAR 元件結(jié)合，誘導(dǎo)下游的溶酶體基因表達，從而誘導(dǎo)溶酶體生物合成和自噬體-溶酶體融合［13-14］。作為TFEB 的上游調(diào)控因子，mTORC1 的調(diào)控機制有：⑴生長因子所誘導(dǎo)的Rheb 與GTP 的結(jié)合態(tài)，可以激活mTORC1，Rheb 是Ras 家族的一種小型GTPase；⑵可以被結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合體（Tuberous sclerosis complex，TSC）所抑制［15］。此外，DI MALTA C等［16］研究表明，TFEB 不僅是mTORC1 的底物，在饑餓條件下，TFEB 的核定位與RagD 表達顯著相關(guān)，RagD是TFEB 的直接轉(zhuǎn)錄靶點，TFEB 對RagD表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控影響了溶酶體對mTORC1 的招募。TFEB和mTORC1是一個反饋閉環(huán)的重要組成部分，mTORC1負(fù)調(diào)控TFEB，而TFEB反過來可通過RagC/D轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)正向調(diào)節(jié)mTORC1活性［17］。見圖1。

2. 2 AKT 促進TFEB 磷酸化AKT 對TFEB 磷酸化的機制：⑴AKT通過磷酸化TSC2激活mTORC1促進TFEB 磷酸化；⑵AKT 直接磷酸化TFEB 的Ser467位點使其留在胞質(zhì)內(nèi)（圖1）。TSC2的羧基末端結(jié)構(gòu)域作為Rheb 的GTPase 的激活蛋白，可促進Rheb-GTP 向Rheb-GDP 轉(zhuǎn)化。在與GTP 結(jié)合的形式中，Rheb 是mTORC1 的一個重要激活劑，因此，AKT 介導(dǎo)TSC2 磷酸化，可使Rheb-GDP 向Rheb-GTP 轉(zhuǎn)化，從而激活mTORC1，AKT 通過調(diào)控TSC-RhebmTORC1 回路，將生長因子信號與控制細胞生長代謝變化的主要信號節(jié)點連接起來，mTORC1 的激活可促進TFEB 磷酸化，促進多種合成代謝過程，如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核苷酸的合成，同時抑制自噬的分解代謝過程［18］。 mTORC1 的另一個上游調(diào)控因子ERK，其對TSC2/Rheb級聯(lián)作用與AKT平行，可以抑制TSC2，通過Ras-ERK 通路整合生長因子的信號，激活mTORC1。PALMIERI M 等［19］研究發(fā)現(xiàn)，AKT可不依賴mTORC1 而通過直接對TFEB 的Ser467 位點的磷酸化來負(fù)向調(diào)控TFEB 活性。一種不依賴于mTOR 的自噬誘導(dǎo)劑海藻糖，通過抑制AKT 來促進TFEB的核轉(zhuǎn)位，以增強自噬和細胞清除率。

圖1 AKT、mTORC1調(diào)控TFEB磷酸化的通路

2. 3 溶酶體Ca2+促進TFEB 核易位在饑餓或過度消耗的情況下，溶酶體Ca2+通過黏脂蛋白1（Mucolipin 1，MCOLN1）迅速釋放，形成毗鄰溶酶體的鈣微區(qū)，這種鈣的局部積累誘導(dǎo)激活了鈣調(diào)磷酸酶去磷酸化TFEB 的兩個關(guān)鍵絲氨酸亞基S211、S142，使TFEB 核積聚并激活轉(zhuǎn)錄靶基因，誘導(dǎo)溶酶體的發(fā)生和自噬（圖2）。MEDINA D L 等［20］基于TFEB 在饑餓期間胞漿-核內(nèi)穿梭的細胞試驗對磷酸酶siRNA 文庫進行了高通量篩選，發(fā)現(xiàn)抑制蛋白磷酸酶3 催化亞基B（PPP3CB）可以抑制TFEB 核易位；此外，鈣調(diào)磷酸酶的抑制劑環(huán)孢素A 以及FK506可使TFEB減少核易位。

圖2 溶酶體Ca2+促進TFEB核易位

2. 4 MAP4K3/GLK 磷酸化TFEBMAP4K3 通過對TFEB 氨基酸殘基Ser-3 磷酸化抑制TFEB 核轉(zhuǎn)位（圖3）。mTORC1 磷酸化S211 是TFEB 保留在細胞質(zhì)內(nèi)的關(guān)鍵機制，HSU C L 等［21］研究發(fā)現(xiàn)，MAP4K3對TFEB氨基酸殘基Ser-3磷酸化發(fā)生在mTORC1對TFEB 絲氨酸211 磷酸化之前，抑制氨基酸消耗介導(dǎo)TFEB 核轉(zhuǎn)位。 值得注意的是，MAP4K3 介導(dǎo)的TFEB 失活促進了mTOR 抑制的自噬通路，但TFEB失活不受mTOR信號的調(diào)控［22］。

圖3 調(diào)節(jié)TFEB磷酸化的非經(jīng)典通路

2. 5 PKCβ 磷酸化TFEBPKCβ 可以磷酸化TFEB 的S461 和/或S462、S466、S468，使其停留在胞質(zhì)，以保證溶酶體的生物合成（圖3）。FERRON M等［23］通過體外激酶檢測PKCβ 磷酸化了TFEB 的一個含有其保守C 末端基序（氨基酸293～475）的片段，但未磷酸化更多的N 末端基序（氨基酸88～219）片段，體外激酶檢驗確定TFEB 的S461 和/或S462、S466、S468 被PKCβ 體外磷酸化，從而保證了溶酶體的生物合成。

2. 6 ERK2 磷酸化TFEBERK2 屬于絲裂原活化蛋白激酶1 家族，可以磷酸化TFEB 的Ser142，導(dǎo)致TFEB 滯留胞質(zhì)［24］。當(dāng)細胞處于饑餓狀態(tài)，ERK2 與TFEB解離，使TFEB進入核內(nèi)定位，誘導(dǎo)自噬（圖3）。

3 TFEB在腫瘤中的作用

3. 1 腎癌（Renal cell carcinoma，RCC）腎細胞癌的發(fā)生以及其惡性程度主要受TFEB 表達的影響，研究表明，mTOR 通路的紊亂，導(dǎo)致TFEB在腎細胞癌中過表達。在ARGANI P 等［25］的研究中，8 例RCCs 成年患者全部顯示了高水平的TFEB擴增，并表現(xiàn)出了腫瘤更強的攻擊性。GUPTA S 等［26］研究一系列侵襲性RCCs 病例，在這些病例中6p21. 1 區(qū)域的基因組擴增，該區(qū)域基因組包括了TFEB、VEGFA CC、D3、ABCC10、PTK7等基因，TFEB基因擴增的腎癌與典型的乳頭狀、透明細胞和嫌色細胞腎細胞癌相比治療效果更差。mTOR 通路在許多人類腫瘤疾病中表達上調(diào)，是抑制腫瘤的潛在治療靶點，在透明細胞腎細胞癌中發(fā)現(xiàn)了mTOR通路紊亂。2007 年的一項大型試驗顯示，與雷帕霉素類似的坦西莫司提高了轉(zhuǎn)移性透明細胞RCC 患者生存率，更能證明mTOR通路紊亂可能與RCC的發(fā)病有關(guān)［27］。

3. 2 胰腺導(dǎo)管腺癌（Pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）PDAC 發(fā)病與大自噬有關(guān)，且處于不同階段自噬作用不同。在KLEIN K等［28］研究中，TFEB在45 例PDAC 患者中顯著表達。在PDAC 細胞基礎(chǔ)狀況下，TFEB有核轉(zhuǎn)錄，而在細胞缺乏營養(yǎng)狀況下，TFEB 核積累更大，但在TFEB沉默后，自噬仍然持續(xù)存在，這表明可能存在旁路信號。在PERERA R M 等［6］研究中，胰腺導(dǎo)管腺癌的發(fā)病機制與大自噬有關(guān)，用雷帕霉素抑制劑Torin1或絲裂原活化蛋白激酶抑制劑處理后，PDAC細胞系顯示出每個MiT/TFE 蛋白的組成性核易位，盡管PDAC 細胞顯示完整的mTORC1 信號，但它依舊存在MiT/TFE 的核易位。核易位誘導(dǎo)的大自噬對PDAC 的影響在不同的階段有所不同，在腫瘤起始時，自噬有助于維持基因組穩(wěn)定性并阻礙腫瘤的啟動；在晚期疾病中，自噬降解并回收細胞成分以滿足快速生長的代謝需要［29］。

3. 3 多發(fā)性骨髓瘤（Multiple myeloma，MM）MM 中TFEB 核易位水平增加，主要通過mTOR 以及AKT 信號通路下降、ERK2 的抑制來調(diào)節(jié)。一定水平的自噬對MM 細胞的穩(wěn)態(tài)起著重要的作用，研究人員通過應(yīng)用FK866 抑制了煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（NAMPT）后，mTOR 以及AKT 信號通路下降，導(dǎo)致TFEB 核易位增加，從而增加了自噬程度。還可通過ERK2的抑制來使TFEB 核易位，上調(diào)自噬水平，所涉及的下游具體基因仍在探索中［30］。

3. 4 肺癌（Lung cancers，LC）肺癌中p53基因抑制以及p53基因影響mTOR 信號調(diào)控TFEB 核定位。ZHANG Z L 等［31］研究發(fā)現(xiàn)，抑癌基因p53的缺失或抑制促進TFEB 從細胞質(zhì)向細胞核轉(zhuǎn)移，從而增加TFEB 介導(dǎo)的肺癌細胞溶酶體和自噬體的生物發(fā)生。此外，p53的重新表達可降低涉及自噬-溶酶體途徑（ALP）的TFEB靶向基因的表達水平，而敲除TFEB可消除p53對ALP基因表達的調(diào)控作用。并觀察到p53未直接與TFEB相互作用，推測在其實驗?zāi)Ｐ椭衟53可能通過影響mTOR 信號間接調(diào)控TFEB 核定位，故還需要對mTOR 信號通路中的因素做進一步研究，如raptor、Rag GTPases、mTOR本身是否被p53靶向［31］。

3. 5 結(jié)直腸癌（Colorectal cancer，CRC）CRC 中TFEB 通過增強Beclin1轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)細胞自噬，其與腫瘤的惡性程度有關(guān)；另推測TFEB 可能通過介導(dǎo)mTORC1下游效應(yīng)來增加CRC的發(fā)生風(fēng)險。ZENG C J等［32］分析了188 例CRC 患者的數(shù)據(jù)，以評估EIF3H、UTP23、SPSB2、TFEB和RPS21基因表達水平在腫瘤組織和正常組織中的差異，結(jié)果顯示，除TFEB外，其余4 個基因在腫瘤組織中的表達水平均高于正常組織，而TFEB 在腫瘤組織中的表達水平顯著低于正常組織。CRC 樣本中TFEB的轉(zhuǎn)錄與CRC 的不可控進展、深黏膜浸潤、淋巴轉(zhuǎn)移、侵襲性等臨床特征以及不良預(yù)后相關(guān)；在CRC 細胞系中敲除TFEB基因均可阻止細胞增殖。Beclin1的表達與TFEB呈正相關(guān)，TFEB沉默抑制了Beclin1的擴增，表明TFEB通過增強Beclin1轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)細胞自噬，TFEB可能通過介導(dǎo)mTORC1 通路的下游效應(yīng)，至少在一定程度上增加了CRC 風(fēng)險［32］。TFEB 是自噬-溶酶體途徑和能量代謝的主調(diào)控因子，自噬失調(diào)與癌癥的發(fā)生和進展有關(guān)。

3. 6 乳腺癌（Breast cancer，BC）BC 不良預(yù)后可能與TFEB 異常表達有關(guān)，腫瘤微環(huán)境中的酸性條件可增加TFEB 的核易位。GIATROMANOLAKI A等［33］評估了100 例T1 期BC 樣本中TFEB 和溶酶體標(biāo)記物的表達水平，發(fā)現(xiàn)1/4 的病例TFEB轉(zhuǎn)錄水平高。TFEB 表達與LAMP-2A、CTSD、LC3A、缺氧誘導(dǎo)因子2-α（HIF2-α）的表達呈正相關(guān)，與孕酮受體的表達呈負(fù)相關(guān)。TFEB 和CTSD 的表達與不良預(yù)后有關(guān)，TFEB 異常表達被認(rèn)為是一個獨立的預(yù)后因素。此外，微環(huán)境脅迫對BC 細胞系TFEB 動力學(xué)的影響表明，酸性條件能夠刺激TFEB 擴增及其核轉(zhuǎn)位。BC 的特征是血管生成增加和HIF2-α 的高表達，兩者均與術(shù)后不良預(yù)后有關(guān)［34］。

3. 7 其他腫瘤在黑色素瘤中，MiT/TFE基因上調(diào)觸發(fā)了RagD介導(dǎo)的mTORC1誘導(dǎo)，導(dǎo)致細胞過度增殖和腫瘤生長。因此，這種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機制使細胞適應(yīng)營養(yǎng)供應(yīng)，并支持癌癥細胞的能量需求代謝［35］。據(jù)報道，MiT-TFE家族轉(zhuǎn)錄因子的異常調(diào)控在多種腫瘤發(fā)生中起重要作用［36］，特別是這些轉(zhuǎn)錄因子的核轉(zhuǎn)位被證明可誘導(dǎo)不同靶基因的表達，這些靶基因是腫瘤發(fā)生發(fā)展機制中的重要一環(huán)［6］。

綜上所述，TFEB 的表達與各類腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展機制有著密切的聯(lián)系，與TFEB 表達相關(guān)的通路主要有mTORC1、AKT、ERK2 等。這些通路通過調(diào)控TFEB 的表達，在癌癥的預(yù)后、分期、分級以及治療等方面發(fā)揮作用（圖4）。

圖4 TFEB在腫瘤中的作用

4 TFEB作為藥物靶點在臨床中的應(yīng)用

4. 1 姜黃素激活TFEB 的轉(zhuǎn)錄姜黃素是從中草藥中提取的疏水多酚，ZHANG J B等［36］研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素治療可以提高人結(jié)腸癌HCT116 細胞和小鼠胚胎成纖維細胞（MEFs）的自噬通量，可以抑制雷帕霉素靶蛋白表達，還可以直接與TFEB結(jié)合，增加TFEB的轉(zhuǎn)錄活性。 進一步通過用姜黃素處理HCT116 細胞，發(fā)現(xiàn)姜黃素處理并沒有增加TFEB 蛋白水平，經(jīng)過免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)TFEB 進入了細胞核，且TFEB 與14-3-3 蛋白相互作用顯著降低，表明TFEB 磷酸化水平降低［36］。SONG J X 等［37］研究認(rèn)為，合成的姜黃素衍生物C1 是一種新的不依賴于mTOR 的TFEB 激活劑?；衔顲1 在N 端特異性結(jié)合TFEB，促進TFEB 核轉(zhuǎn)位而不抑制mTOR 活性。通過激活TFEB，化合物C1 增強了體外和體內(nèi)的自噬和溶酶體生物合成［37］。

4. 2 疏水性弱堿化療藥物對TFEB 的去磷酸化作用疏水性弱堿化療藥物包括西拉敏、拓替康、舒尼替尼和阿霉素等，這些化療藥物通過陽離子誘捕在溶酶體中高度積聚，由于疏水性弱堿性化療藥物可以誘導(dǎo)溶酶體堿化，而堿化又可以損傷溶酶體活性，溶酶體感知自身損傷或應(yīng)激，刺激溶酶體Ca2+離子的釋放和鈣調(diào)磷酸酶激活從而誘導(dǎo)TFEB 去磷酸化和核易位，誘發(fā)溶酶體生物發(fā)生和胞吐作用［38-39］。

4. 3 增強阿霉素抗腫瘤效果自然生成的雙聯(lián)苯類化合物（Marchantin M，Mar-M）抑制了在化療耐藥細胞中升高的衰老相關(guān)的分泌表型（Senescenceassociated secretory phenotype，SASP）成分，此成分被認(rèn)為促進細胞耐藥性。Mar-M 對TFEB 和核因子κB（NF-κB）的失活是其抑制SASP組分的重要原因，Mar-M 對SASP 的抑制作用在與阿霉素的聯(lián)合治療中發(fā)揮協(xié)同作用，降低毒性，提高抗腫瘤療效［40］。

5 小 結(jié)

TFEB 是自噬的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，通過對自噬的調(diào)節(jié)來維持細胞穩(wěn)態(tài)，從而廣泛參與各種生理病理過程。目前對多種調(diào)節(jié)TFEB 的核定位通路進行了研究，但其下游機制及靶基因尚不清楚還需進一步探索。TFEB在各種腫瘤疾病中都存在表達，其對腫瘤的發(fā)生發(fā)展有不同的作用，針對其在腫瘤中的表達機制，有調(diào)節(jié)其上游的信號通路的治療藥物，也有直接與TFEB 結(jié)合調(diào)控的藥物。TFEB作為腫瘤治療的潛在靶點，其研究在腫瘤治療發(fā)展中具有很好的前景。