SDS與Triton X-100對(duì)細(xì)胞膜通透作用研究

劉 霞 孔華庭 張繼超 諸 穎

1（中國(guó)科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所中國(guó)科學(xué)院微觀界面物理與探測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海201800）

2（中國(guó)科學(xué)院上海高等研究院基礎(chǔ)交叉研究中心張江實(shí)驗(yàn)室上海光源 上海201210）

3（中國(guó)科學(xué)院大學(xué) 北京100049）

生物實(shí)驗(yàn)中，表面活性劑［1］在免疫染色［2-4］或者組織透明化［5-7］中發(fā)揮著重要的作用。在免疫染色過(guò)程中，它能溶解細(xì)胞膜中的脂類物質(zhì)，提高細(xì)胞膜的通透性，促進(jìn)大分子物質(zhì)（單克隆抗體）快速滲透到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)與抗原結(jié)合，提高染色效率。最近開(kāi)發(fā)的CLARITY 組織透明化技術(shù)［8-9］，是在不顯著改變組織天然結(jié)構(gòu)的前提下，通過(guò)有效去除脂質(zhì)，將厚的組織或完整的器官轉(zhuǎn)化為光學(xué)透明的凝膠狀樣品，從而可以對(duì)整個(gè)組織或器官進(jìn)行光學(xué)成像。目前市面上的表面活性劑種類繁多，使用不同的表面活性劑將直接影響具體實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。因此，對(duì)實(shí)驗(yàn)中常用的表面活性劑的細(xì)胞膜通透性能進(jìn)行研究，篩選合適的表面活性劑和最佳處理時(shí)間具有重要的實(shí)驗(yàn)價(jià)值和實(shí)用意義。

十二烷基硫酸鈉（Sodium Dodecyl Sulfate，SDS）［10］和聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）［3］是實(shí)驗(yàn)室中常用的表面活性劑，能夠溶解脂質(zhì)雙分子層中的兩親性磷脂，從而增加細(xì)胞膜的通透性［9］，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)兩者在去脂的程度上有很大不同。本工作根據(jù)熒光染料對(duì)細(xì)胞膜的染色情況判斷細(xì)胞膜的通透程度，研究了SDS 與Triton X-100 在提高細(xì)胞膜通透作用方面的差異。如圖1 所示，在蛋白酶催化分子聚合［11］的實(shí)驗(yàn)中，SDS與Triton X-100增加了細(xì)胞膜通透性，促進(jìn)3，3'-二氨基聯(lián)苯胺（3，3'-Diaminobenzidine，DAB）進(jìn)入細(xì)胞并對(duì)線粒體進(jìn)行染色。本工作研究了兩者在具體染色實(shí)驗(yàn)中對(duì)蛋白酶活性和DAB 染色效果的影響。最后應(yīng)用合肥光源軟X射線納米顯微線站的全場(chǎng)透射成像技術(shù)研究了透膜前后細(xì)胞形態(tài)的變化。本工作有望為實(shí)驗(yàn)中選擇合適的表面活性劑提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

圖1 表面活性劑增加細(xì)胞膜通透性，促進(jìn)DAB進(jìn)入細(xì)胞并對(duì)線粒體進(jìn)行染色的示意圖Fig.1 The schematic diagram of surfactant increasing cell membrane permeability,facilitating DAB entry into cells and staining mitochondria

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 主要儀器

離心機(jī)（5702）：德國(guó)Eppendorf 公司；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（3423）：美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；超純水儀系統(tǒng)（Advantage A10）：美國(guó)Millipore公司；激光共聚焦熒光顯微鏡（Leica TCS sp8）：徠卡顯微系統(tǒng)（上海）貿(mào)易有限公司；合肥同步輻射光源（National Synchrotron Radiation Laboratory，NSRL）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

人宮頸癌細(xì)胞（Hela細(xì)胞）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。

SDS、多聚甲醛購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（上海）；Triton X-100、30%過(guò)氧化氫和DAB 購(gòu)自Sigma-Aldrich 上海貿(mào)易有限公司；DiO 細(xì)胞膜綠色熒光探針、10×磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline，PBS）、青霉素-鏈霉素溶液（100×）購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；胎牛血清（Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS）、Opti-MEM?減血清無(wú)酚紅培養(yǎng)基、MEM（Minimum Essential Medium）培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)GIBCO 公司；L-谷氨酰胺（L-Glu）、Lipofectamine?3000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；氮化硅窗口購(gòu)自加拿大Norcada公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將HeLa 細(xì)胞培養(yǎng)于MEM 培養(yǎng)基中，其中MEM培養(yǎng)基中加有10%熱滅活FBS，100 U·mL-1青霉素，100 μg·mL-1鏈霉素，4 mmol·L-1谷氨酰胺培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2恒溫恒濕細(xì)胞培養(yǎng)箱中。每?jī)商鞂?duì)細(xì)胞進(jìn)行一次傳代，保證細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)。

2.2 SDS 與Triton X-100 透膜效果比較及透膜條件優(yōu)化

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞，以105個(gè)·mL-1的密度接種500μL 于底部是玻璃的35 mm 共聚焦小皿中，培養(yǎng)8~10 h（過(guò)夜），待貼壁后棄去培養(yǎng)液，用1×PBS 洗滌細(xì)胞3 次。加入4%多聚甲醛室溫避光固定20 min，再用1×PBS洗滌細(xì)胞3次。分別用4%濃度的SDS 或0.25%的Triton X-100 處理細(xì)胞2 min、5 min、10 min、15 min，再用1×PBS 洗滌細(xì)胞3 次。最后用5 μmol·L-1的DiO 細(xì)胞膜染料處理細(xì)胞15 min，1×PBS 洗滌后用激光共聚焦對(duì)樣品進(jìn)行熒光成像，選取激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)501 nm。

2.3 表面活性劑對(duì)蛋白催化活性的影響

試管內(nèi)催化DAB 聚合反應(yīng)：對(duì)照組中0.5 mg·mL-1的DAB溶液中加入30%v/v的H2O2（終濃度為0.06%v/v），再加入5 mg·mL-1辣根過(guò)氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）蛋白（終濃度為0.05 mg·mL-1）。實(shí)驗(yàn)組組中其中一組HRP 蛋白先用0.25% Triton X-100 處理10 min，再加入的DAB和H2O2。另一組的HRP 蛋白則先用4% SDS 處理10 min，再加入DAB 和H2O2，保持各組中試劑終濃度相同，觀察試管內(nèi)溶液的變化情況。

細(xì)胞內(nèi)催化DAB 聚合反應(yīng)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞，以105個(gè)·mL-1的密度接種500μL于底部是玻璃的35 mm共聚焦小皿中，培養(yǎng)8~10 h（過(guò)夜），待貼壁后棄去培養(yǎng)液，用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染質(zhì)粒mito-APEX2，其中l(wèi)ipo 3000/p 3000/質(zhì)粒的v/v/w為0.75μL∶1μL∶500 ng，在培養(yǎng)箱中孵育24 h。一組用含Mg2+的預(yù)冷2%戊二醛固定細(xì)胞40 min，用預(yù)冷的1×PBS洗滌細(xì)胞3次，再用預(yù)冷的20 mmol·L-1的甘氨酸猝滅未反應(yīng)的戊二醛5 min，0.25%Triton X-100 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行透膜，再次用遇冷的1×PBS 清洗細(xì)胞，最后用0.5 mg·mL-1新鮮稀釋的DAB 和0.03%v/v的H2O2在預(yù)冷的1×PBS中染色1 min。另一組在甘氨酸反應(yīng)完，換用4%SDS 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行透膜處理后再進(jìn)行DAB 染色。最后分別對(duì)兩組細(xì)胞的DAB染色情況進(jìn)行共聚焦成像。

2.4 同步輻射X射線成像

選擇最佳的透膜條件對(duì)HeLa細(xì)胞進(jìn)行透膜，利用合肥光源BL07W 軟X 射線納米顯微成像線站對(duì)透膜前后的細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行軟X 射線全場(chǎng)透射成像。軟X射線全場(chǎng)透射成像技術(shù)［12-14］是一種原位無(wú)損的成像技術(shù)，能在天然狀態(tài)下對(duì)整個(gè)完整的含水細(xì)胞進(jìn)行成像，并提供樣本內(nèi)部結(jié)構(gòu)的信息，而無(wú)需任何染色、切片、脫水或包埋預(yù)處理［15-16］。合肥光源BL07W線站的光子能量范圍在260~800 eV之間，具有優(yōu)于30 nm 的高空間分辨能力。用SX-700 型單色器對(duì)多級(jí)扭擺磁體（Wiggler）出射的同步輻射光進(jìn)行單色化，經(jīng)橢球毛細(xì)管聚焦鏡聚焦，直接照射在樣品上。X射線穿過(guò)樣品后，通過(guò)物鏡波帶片放大，透射信號(hào)被CCD探測(cè)器接收，從而獲得樣品的二維成像圖。成像視場(chǎng)為9.4 μm，通過(guò)運(yùn)動(dòng)電機(jī)的二維移動(dòng)實(shí)現(xiàn)大樣品的馬賽克掃描和拼接，最終得到整個(gè)細(xì)胞的高分辨納米顯微圖像。細(xì)胞生長(zhǎng)在氮化硅窗上，透膜干燥后放入樣品室中，真空環(huán)境下進(jìn)行成像。成像條件：入射能量520 eV；成像步長(zhǎng)9.4 μm×9.4 μm；單幅圖像成像時(shí)間1 s；成像尺寸65.8 μm×56.4 μm；單像素點(diǎn)尺寸9.9 nm，成像分辨率優(yōu)于30 nm。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 SDS與Triton X-100透膜效果的比較

用DiO綠色熒光染料對(duì)不同處理?xiàng)l件的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞膜染色，根據(jù)熒光成像結(jié)果判斷不同表面活性劑的透膜效果。結(jié)果顯示：0.25%Triton X-100的透膜效果優(yōu)于4%SDS。如圖2（a）所示，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞后，在不使用透膜試劑時(shí)，DiO細(xì)胞膜染料成功標(biāo)記細(xì)胞膜，證明本實(shí)驗(yàn)選用的染料能特異性指示細(xì)胞膜。用4%SDS 處理細(xì)胞后，細(xì)胞膜上的熒光呈現(xiàn)斷續(xù)的點(diǎn)狀，且能隱約看到細(xì)胞的輪廓位置，表明4% SDS 透膜程度不徹底（圖2（b））。用共聚焦顯微鏡觀察0.25%Triton X-100 處理后的細(xì)胞，圖像中僅顯示幾個(gè)特別亮的熒光點(diǎn)，看不出細(xì)胞的基本輪廓（圖2（c），箭頭標(biāo)示細(xì)胞膜位置），實(shí)驗(yàn)表明，選用4%SDS 和0.25%Triton X-100 對(duì)細(xì)胞均具有透膜效果，但0.25%Triton X-100的透膜效果顯著優(yōu)于4%SDS。

圖2 不同處理?xiàng)l件下的細(xì)胞膜熒光成像結(jié)果(a)4%多聚甲醛處理，(b)4%多聚甲醛和4%SDS處理，(c)4%多聚甲醛和0.25%Triton X-100處理Fig.2 Fluorescence imaging results of cell membrane under different treatment conditions(a)4%paraformaldehyde treatment,(b)4%paraformaldehyde fixation and 4%SDS treatment,(c)4%paraformaldehyde and 0.25%Triton X-100 treatment

3.2 Triton X-100透膜條件的優(yōu)化

為進(jìn)一步優(yōu)化Triton X-100的最佳透膜條件，我們選擇不同的孵育時(shí)間（2 min、5 min、10 min、15 min），用0.25%Triton X-100 處理細(xì)胞，DiO 染料染色，通過(guò)共聚焦顯微鏡對(duì)細(xì)胞膜進(jìn)行熒光成像。如圖3所示，當(dāng)孵育時(shí)間小于10 min時(shí)，熒光成像圖中有很多明亮的點(diǎn)圍繞在細(xì)胞膜上，表明細(xì)胞透膜并未完全。當(dāng)與細(xì)胞共孵育10 min 時(shí)，圖像中明亮的點(diǎn)基本消失，表明已達(dá)到良好的透膜效果。繼續(xù)增加孵育時(shí)間，成像效果并未改善。結(jié)果顯示：0.25%Triton X-100 的最佳透膜條件為與細(xì)胞共孵育10 min。

圖3 不同透膜條件下，細(xì)胞的共聚焦顯微鏡熒光成像圖，Triton X-100孵育時(shí)間分別為2 min(a)、5 min(b)、10 min(c)、15 min(d)Fig.3 Confocal microscopy fluorescence images of cells under different membrane-permeable conditions.The incubation time of Triton X-100,2 min(a),5 min(b),10 min(c),15 min(d)

3.3 SDS 與Triton X-100 對(duì)蛋白催化活性的影響

本課題組發(fā)展了一種X 射線遺傳編碼探針，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)特定蛋白質(zhì)的內(nèi)源標(biāo)記和原位納米分辨成像［11,17］，我們利用這一探針驗(yàn)證Triton X-100和SDS 在具體實(shí)驗(yàn)中的透膜效果和差異，并在試管和細(xì)胞層面研究了Triton X-100 和SDS 對(duì)過(guò)氧化物酶催化活性的影響。

在試管層面，選擇常用的辣根過(guò)氧化物酶HRP催化DAB聚合并觀察溶液的變化，研究表面活性劑對(duì)蛋白催化活性的影響。如圖4（a）所示，在對(duì)照組中，HRP可以在H2O2存在的條件下催化DAB單體產(chǎn)生聚合物，加入H2O2后，試管內(nèi)馬上有明顯的顏色變化，顏色由淺粉色變成棕黑色，放置10 min后，有明顯的顆粒狀沉淀產(chǎn)生。Triton X-100 組具有相同的顏色變化和顆粒狀沉淀產(chǎn)生，而SDS 組僅有顏色變化，沒(méi)有顆粒狀沉淀產(chǎn)生。結(jié)果表明：Triton X-100沒(méi)有改變HRP的催化活性，并成功催化DAB單體聚合產(chǎn)生沉淀，而SDS會(huì)使HRP變性而失去了催化活性，無(wú)法催化DAB生成明顯的沉淀。

在細(xì)胞層面，用轉(zhuǎn)染的mito-APEX2質(zhì)粒特異性靶向線粒體表達(dá)過(guò)氧化物酶APEX2，使其在細(xì)胞內(nèi)催化DAB 聚合并標(biāo)記線粒體。如圖4（b）所示，用Triton X-100 透膜后的細(xì)胞，APEX2 活性很高，催化DAB在線粒體位置發(fā)生聚合反應(yīng)，細(xì)胞內(nèi)的線粒體被DAB成功標(biāo)記。而用SDS透膜后的細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)未見(jiàn)DAB 聚合物，APEX2 蛋白失活。結(jié)果表明：Triton X-100并不會(huì)改變細(xì)胞內(nèi)APEX2蛋白的催化活性，而用SDS 進(jìn)行細(xì)胞透膜時(shí)，會(huì)使蛋白發(fā)生變性失活，進(jìn)而影響催化活性。

圖4 使用SDS與Triton X-100做表面活性劑對(duì)蛋白酶催化活性的影響(a)試管中HRP催化DAB聚合情況，左：對(duì)照，中：Triton X-100，右：SDS，(b)細(xì)胞中的APEX2催化DAB在線粒體上特異性聚合后的成像圖，左：Triton X-100，右：SDSFig.4 SDS and Triton X-100 used as the surfactants on the catalytic activity of protease(a)HRP catalyzes DAB polymerization in tubes,left:control,middle:Triton X-100,right:SDS,(b)The images of APEX2-catalyzed DAB specific polymerization on mitochondria in cells,left:Triton X-100,right:SDS

3.4 同步輻射X射線成像

為了研究透膜前后的細(xì)胞形態(tài)是否發(fā)生變化，我們使用合肥光源的BL07W 軟X 射線納米顯微線站的全場(chǎng)透射成像技術(shù)對(duì)透膜前后的細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行高分辨成像。如圖5 所示，Triton X-100 透膜處理后，細(xì)胞形態(tài)依舊完好，并未發(fā)生明顯變化。結(jié)果表明：Triton X-100透膜不會(huì)影響細(xì)胞的整體形貌。

圖5 透膜前后細(xì)胞的同步X射線成像結(jié)果(a)用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，(b)用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，并用0.25%Triton X-100透膜Fig.5 Synchrotron-based X-ray imaging results of cells before and after transmembrane(a)4%paraformaldehyde treatment,(b)4%paraformaldehyde fixation and 0.25%Triton X-100 treatment

4 結(jié)語(yǔ)

本工作研究了SDS 和Triton X-100 對(duì)細(xì)胞膜通透性的影響。細(xì)胞膜染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：0.25%Triton X-100 的透膜效果優(yōu)于4% SDS，且0.25%Triton X-100 與細(xì)胞的最優(yōu)共孵育時(shí)間為10 min。利用過(guò)氧化物酶催化DAB聚合實(shí)驗(yàn)，在試管和細(xì)胞層面研究了Triton X-100 和SDS 對(duì)過(guò)氧化物酶催化活性的影響。結(jié)果顯示：SDS 會(huì)影響酶的催化活性進(jìn)而影響染色效果，而Triton X-100不會(huì)影響酶的催化活性，染色結(jié)果很好。同步輻射高分辨成像結(jié)果也表明，用Triton X-100進(jìn)行透膜不會(huì)顯著影響細(xì)胞的形態(tài)。這兩種表面活性劑透膜效果具有如此差別，內(nèi)在機(jī)制還需后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。本研究將為具體實(shí)驗(yàn)中選擇合適的表面活性劑提供理論和實(shí)驗(yàn)支持。

作者貢獻(xiàn)聲明劉霞：完成實(shí)驗(yàn)主體部分；劉霞、孔華庭：進(jìn)行同步X射線成像工作；劉霞、張繼超：撰寫文稿；張繼超：設(shè)計(jì)和指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)；諸穎：構(gòu)思文稿主體思路并全程指導(dǎo)文稿修改。