調(diào)控miR-152對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠模型骨生物力學(xué)、骨重建平衡及骨組織Hedgehog信號(hào)通路的影響

王建武，李曉妮，趙 強(qiáng)，李文高，賈承明

(陜西省中醫(yī)醫(yī)院骨傷一科，陜西 西安 710004)

隨著全球人口老齡化社會(huì)加劇，骨質(zhì)疏松癥發(fā)生群體日趨龐大，所帶來(lái)的并發(fā)癥如骨痛、骨折等問(wèn)題愈發(fā)明顯[1]，因此明確骨質(zhì)疏松的發(fā)生病理機(jī)制，可為骨質(zhì)疏松的治療、預(yù)防提供參考依據(jù)。骨代謝紊亂、低骨礦物密度是骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的主要原因。有研究[2-3]表明，微小RNA(microRNA，miRNA)在骨代謝發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中占據(jù)著重要作用。miRNA是一種內(nèi)源性調(diào)節(jié)RNA，可有效調(diào)控基因表達(dá)及成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞活性，改善骨的發(fā)育功能及穩(wěn)態(tài)[4]。Hedgehog-Gli信號(hào)通路是由Hedgehog信號(hào)蛋白、Ptched、Gli蛋白、Smoothened 特異性受體、下游靶基因組成，通過(guò)調(diào)控成骨細(xì)胞的增殖、分化及活性過(guò)程，從而促進(jìn)骨穩(wěn)態(tài)[5-6]。因此本研究分析調(diào)控miR-152對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠模型骨生物力學(xué)、骨重建平衡及骨組織Hedgehog信號(hào)通路的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 32只SD大鼠(南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，SPF級(jí)，雌性，8～12周齡，平均(10.15±0.41)周；體重150～230 g,平均(182.58±8.63)g。飼養(yǎng)環(huán)境：每籠2只，溫度20～24 ℃，空氣濕度50%～60%，12 h交替光照，自由進(jìn)食、飲水，飼養(yǎng)1周。

1.2 試劑與儀器 含各種氨基酸和葡萄糖的培養(yǎng)基(DMEM，上海恒斐生物科技有限公司)，胎牛血清(FBS，Hyclone公司)，維甲酸(上海嶸崴達(dá)實(shí)業(yè)有限公司)， Ⅰ型原膠原N端前肽(PINP)、人Ⅰ型膠原C端肽(CTX-Ⅰ)、核心結(jié)合因子α1(CBF-α1)酶聯(lián)試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司)，多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices)，miRNA提取試劑盒(上海澤葉生物科技有限公司)，膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因1蛋白(GLI1)抗體、兔抗人蛋白音猬因子(SHH)抗體、骨保護(hù)蛋白(OPG)抗體、 骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP-2)抗體、小鼠多克隆抗體(RUNX2)、小鼠單克隆抗體(RANKL)(武漢菲恩生物科技有限公司)，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Forma 3110，Thermo Fisher Scientific)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 模型制備：除正常對(duì)照組(8只大鼠)之外，其他大鼠采用維甲酸灌胃，90 mg/(kg·d)，灌胃期間正常飲食、飲水、活動(dòng)，連續(xù)灌胃14 d后分為模型組、過(guò)表達(dá)組、沉默組，各8只。模型建立成功后，構(gòu)建miR-152慢病毒載體，采用Gen Bank 查找序列獲取脂蛋白脂酶(LPL)基因序列，建立過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒、沉默轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，測(cè)定慢病毒滴度(1×109TU/ml)。過(guò)表達(dá)組注射miR-152 過(guò)表達(dá)慢病毒懸液10 μl，沉默組注射miR-152 沉默慢病毒懸液10 μl，2周后處死大鼠。

1.3.2 血清樣本檢測(cè)：處死大鼠前，留取靜脈血，分離血清，測(cè)定血清骨代謝指標(biāo)：血鈣、堿性磷酸酶(ALP)、磷、CBF-α1、PINP、CTX-Ⅰ水平。

1.3.3 病理組織學(xué)檢查：大鼠處死后，留取股骨組織，固定24 h，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片、HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察股骨組織病理變化。

1.3.4 骨密度值、骨礦物質(zhì)含量測(cè)定：處死大鼠后，分離右側(cè)股骨，剔除筋膜、肌肉，采用X線骨密度儀(美國(guó)GE公司)測(cè)股骨骨密度值。將左側(cè)股骨、第四腰椎椎體進(jìn)行礦化，使用比色法測(cè)定骨礦物質(zhì)含量。

1.3.5 骨生物學(xué)力學(xué)檢查： 將右側(cè)股骨置于生物力學(xué)儀，支點(diǎn)跨距為18 mm，中點(diǎn)為加壓點(diǎn)，加載速度為2 mm/min，記錄股骨折斷時(shí)的最大力量(最大荷載)、抵抗彎曲變形能力(剛度)。

1.3.6 骨組織Hedgehog信號(hào)通路相關(guān)蛋白及骨重建平衡指標(biāo)檢測(cè)：采用Western blot法測(cè)定膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因 1蛋白(GLI-1)、蛋白音猬因子(SHH)、骨保護(hù)蛋白(OPG)、BPM-2的表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 病理組織學(xué) 見(jiàn)圖1。對(duì)照組大鼠股骨骨髓腔小，骨小梁形態(tài)、結(jié)構(gòu)完整、清晰，數(shù)量多、粗壯。模型組骨髓腔增大、骨小梁斷裂，骨膜內(nèi)存在骨原細(xì)胞；過(guò)表達(dá)組骨髓腔增加，骨小梁形態(tài)、結(jié)構(gòu)破壞，骨小梁斷裂；沉默組骨髓腔緊密縮小，骨外膜有骨膜細(xì)胞。

A：對(duì)照組；B：模型組；C：過(guò)表達(dá)組；D：沉默組

2.2 四組大鼠血鈣、血磷、ALP含量比較 見(jiàn)表1。與對(duì)照組相比，建立骨質(zhì)疏松模型后大鼠血鈣、ALP水平明顯下降，血磷明顯升高(均P<0.05)，其中沉默組ALP表達(dá)高于模型組、過(guò)表達(dá)組，血鈣、血磷低于模型組、過(guò)表達(dá)組(均P<0.05)。

表1 四組大鼠血鈣、血磷、ALP含量比較

2.3 四組大鼠股骨密度值及骨礦物質(zhì)含量比較 見(jiàn)表2。與對(duì)照組比較，建立骨質(zhì)疏松模型后大鼠股骨密度值、骨礦物質(zhì)含量均明顯降低，其中沉默組股骨密度值、骨礦物質(zhì)含量高于模型組、過(guò)表達(dá)組(均P<0.05)。

表2 四組大鼠股骨密度值及骨礦物質(zhì)含量比較

2.4 四組大鼠骨代謝指標(biāo)比較 見(jiàn)表3。與對(duì)照組比較，建立骨質(zhì)疏松模型后大鼠CBF-α1、PINP、CTX-Ⅰ表達(dá)明顯下降，但沉默組骨代謝指標(biāo)高于模型組、過(guò)表達(dá)組(均P<0.05)。

表3 四組大鼠骨代謝指標(biāo)比較(μg/L)

2.5 四組大鼠骨生物力學(xué)與骨重建平衡指標(biāo)比較 見(jiàn)表4。與對(duì)照組比較，建立骨質(zhì)疏松模型后大鼠最大荷載、剛度、OPG、BPM-2表達(dá)均明顯下降，其中沉默組最大荷載、剛度、OPG、BPM-2表達(dá)高于模型組、過(guò)表達(dá)組(均P<0.05)。

表4 四組大鼠骨生物力學(xué)與骨重建平衡指標(biāo)比較

2.6 四組大鼠Hedgehog信號(hào)通路蛋白表達(dá)比較 見(jiàn)表5。與對(duì)照組比較，建立骨質(zhì)疏松模型后大鼠SHH、GLI-1表達(dá)明顯下降，但沉默組SHH、GLI-1表達(dá)高于模型組、過(guò)表達(dá)組(P<0.05)。

表5 四組大鼠Hedgehog信號(hào)通路蛋白表達(dá)比較

3 討 論

骨質(zhì)疏松癥是臨床常見(jiàn)的代謝性骨病，以低骨量、骨組織微結(jié)構(gòu)破壞為主要病理特征，是導(dǎo)致個(gè)體骨質(zhì)脆性增加、患者骨折的主要原因[7]。由于因骨質(zhì)疏松而發(fā)生骨折人數(shù)越來(lái)越多，因此對(duì)骨質(zhì)疏松的預(yù)防及治療刻不容緩，明確疾病發(fā)生機(jī)制是臨床研究熱點(diǎn)。有學(xué)者基于炎性相關(guān)因子調(diào)節(jié)通路TRAF6/NF-κB p65/NFATc1探討瑞香素治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制[8]。韓鵬勃等[9]應(yīng)用中醫(yī)藥通過(guò)正向調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路，提高骨密度、改善骨組織形態(tài)。信號(hào)通路的研究是認(rèn)識(shí)及治療骨質(zhì)疏松的一個(gè)切入點(diǎn)。

miRNA是一種單鏈小分子RNA，由22個(gè)核苷酸組成，具有促進(jìn)mRNA降解、抑制mRNA翻譯的作用[10]。有研究[11]表明，骨質(zhì)疏松多伴有多種miRNA表達(dá)失衡問(wèn)題，通過(guò)調(diào)控骨代謝，發(fā)揮促進(jìn)或抑制骨質(zhì)疏松的發(fā)生、進(jìn)展的作用。miR-152是miRNA家族主要成員，已證實(shí)在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、凋亡及免疫反應(yīng)等多種生理病理過(guò)程起到重要作用[12-13]。

本組研究發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松模型組大鼠骨髓腔增大、骨小梁斷裂，骨膜內(nèi)存在骨原細(xì)胞；但miR-152過(guò)表達(dá)組骨髓腔增加，骨小梁形態(tài)、結(jié)構(gòu)不完整，骨小梁斷裂；而沉默組骨髓腔緊密縮小，骨外膜有骨膜細(xì)胞。結(jié)果表明，骨質(zhì)疏松大鼠骨骼解剖結(jié)構(gòu)破壞明顯，研究顯示，骨質(zhì)疏松大鼠血鈣、ALP表達(dá)明顯下降，血磷明顯升高，其中沉默組ALP表達(dá)高于模型組、過(guò)表達(dá)組，血鈣、血磷低于模型組、過(guò)表達(dá)組。結(jié)果表明在沉默miR-152表達(dá)后，可相應(yīng)改善骨代謝異常。本組研究還顯示，沉默miR-152表達(dá)后，大鼠骨密度、骨礦物質(zhì)明顯增加，以此能抑制骨質(zhì)疏松進(jìn)展，可作為以后治療骨質(zhì)疏松的新途徑。

當(dāng)發(fā)生骨質(zhì)疏松后，患者普遍出現(xiàn)骨重建失衡、骨生物力學(xué)下降現(xiàn)象。其中骨重建平衡有維持骨骼形成、重塑骨骼周期特性、維持骨量及骨質(zhì)的作用[14]。骨生物力學(xué)表明了骨骼抵抗外力的最大力量、抵抗彎曲變形能力，當(dāng)骨生物力學(xué)下降，說(shuō)明對(duì)抗能力下降，極易出現(xiàn)骨折現(xiàn)象[15-17]。本組研究，骨質(zhì)疏松大鼠骨重建失衡明顯，且骨生物力學(xué)下降，但沉默miR-152表達(dá)后，骨重建失衡有所改善，骨生物力學(xué)有所提高。分析其具體機(jī)制：Hedgehog信號(hào)通路基因高度保守，可正向調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞，并能調(diào)控成骨細(xì)胞的增殖、分化及活性，以此維持骨穩(wěn)態(tài)[18-19]；同時(shí)Hedgehog-Gli蛋白通過(guò)調(diào)控骨保護(hù)素表達(dá)，間接抑制破骨細(xì)胞的形成。本研究顯示，骨質(zhì)疏松大鼠SHH、GLI-1表達(dá)明顯下降，但沉默組SHH、GLI-1表達(dá)高于模型組、過(guò)表達(dá)組。結(jié)果表明，骨質(zhì)疏松大鼠存在Hedgehog信號(hào)蛋白活性抑制情況，但沉默miR-152后，使Hedgehog信號(hào)通路被激活，增加骨量、促進(jìn)骨形成、改善骨代謝、誘導(dǎo)骨重建，故能增加骨生物力學(xué)水平、改善骨重建失衡問(wèn)題[20]。

綜上所述，骨質(zhì)疏松大鼠存在骨生物力學(xué)下降、骨重建失衡問(wèn)題，通過(guò)沉默miR-152表達(dá)，可調(diào)控骨組織Hedgehog信號(hào)通路，激活Hedgehog信號(hào)相關(guān)蛋白，起到改善骨重建平衡、增加骨生物力學(xué)的作用。但人類基因組中有多達(dá)1000多種miRNA，由于miRNA之間也會(huì)相互調(diào)節(jié)，導(dǎo)致整個(gè)調(diào)節(jié)過(guò)程異常復(fù)雜[21]，有繼續(xù)深入研究的必要。