柚皮素抑制創(chuàng)傷性顱腦損傷后炎性反應(yīng)機(jī)制研究

任 彬，袁 福

(空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院急診科,陜西 西安 710038)

創(chuàng)傷性顱腦損傷(Traumatic brain injury,TBI)是一種兼具高致死率和致殘率的常見(jiàn)創(chuàng)傷性神經(jīng)類疾病，患者多伴認(rèn)知障礙、偏癱等不同程度后遺癥導(dǎo)致其預(yù)后情況較差，給患者及其家庭帶來(lái)沉重的精神壓力和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1-3]。TBI分為由機(jī)械外力導(dǎo)致的原發(fā)性顱腦損傷和由炎性反應(yīng)、細(xì)胞死亡以及凋亡、氧化應(yīng)激、Ca2+-Fe3+穩(wěn)態(tài)受損等一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)引發(fā)的繼發(fā)性顱腦損傷[4-5]。大量研究[6-7]證實(shí)，過(guò)度的炎性反應(yīng)是TBI后繼發(fā)性損傷的重要機(jī)制之一。腦損傷后，早期的小膠質(zhì)細(xì)胞活化在炎性反應(yīng)中起重要作用，其分泌抗炎癥因子修復(fù)重建神經(jīng)組織；然而隨著病情的發(fā)展，炎癥因子過(guò)度地表達(dá)使細(xì)胞膜破裂、細(xì)胞毒性物質(zhì)釋放，進(jìn)一步引發(fā)腦水腫、膠質(zhì)增生、血腦屏障受損等連鎖反應(yīng)，最終導(dǎo)致神經(jīng)功能損傷或缺失[8-9]。因此，抑制損傷后過(guò)度炎性反應(yīng)可能是改善TBI預(yù)后情況的重要研究方向。柚皮素(Naringenin,NGN)一種柚皮甙中的甙元單體，廣泛存在柑橘香科和于蕓類植物中的黃酮類化合物[10]。NGN有抗菌、抗氧化、抗腫瘤、清除自由基等作用，具有很大的藥用價(jià)值[11]。研究發(fā)現(xiàn)NGN可通過(guò)降低白細(xì)胞介素(Interleukin,IL)-1β、IL-6等促炎癥因子的表達(dá)參與抑制機(jī)體炎癥，并且已有研究表明其在缺血性腦卒中具有降低腦水腫、改善神經(jīng)功能的作用[12]。然而，目前關(guān)于NGN在TBI中的作用尚缺乏足夠的研究證據(jù)。因此，本研究旨在探討NGN在TBI后機(jī)體炎性反應(yīng)中的是否發(fā)揮作用及其相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 雄性成年SPF級(jí)C57小鼠，體重20～25 g，在溫度20～25 ℃、自由進(jìn)食、自然光照、無(wú)病原體的環(huán)境下進(jìn)行1～2周適應(yīng)性飼養(yǎng)。純化的NGN提取物以及NGN溶劑。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 50只小鼠隨機(jī)均分為五組：假手術(shù)組(Sham組)、TBI組及NGN干預(yù)低劑量組、中劑量組和高劑量組。NGN低劑量組、NGN中劑量組和NGN高劑量組分別注射NGN 10、20、30 mg/kg，每天同時(shí)間點(diǎn)給藥1次，共7 d，Sham組和TBI組小鼠注射等量柚皮素溶劑。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 TBI模型制備：腹腔注射4%水合氯醛麻醉小鼠，進(jìn)行消毒、備皮，將其頭部定位于立體定向儀上，在中線旁1.5 mm和人字縫上1.5 mm交界處做一直徑為3 mm的骨窗，用腦皮質(zhì)撞擊儀進(jìn)行打擊，設(shè)置相關(guān)參數(shù)：打擊深度2 mm，速度5 m/s。打擊后封閉骨窗、縫合皮膚。Sham組只開(kāi)窗不打擊，其余操作無(wú)異。打擊后1 h NGN給藥組腹腔內(nèi)注射藥物，Sham組和TBI組同時(shí)間注射等量柚皮素溶劑，此后在相同時(shí)間注射直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.3.2 神經(jīng)功能缺損(mNSS)評(píng)分：在損傷后第1、3、7天根據(jù)mNSS評(píng)分表從意識(shí)、水平凝視功能、前后肢肌力等方面評(píng)分，得分越高功能缺失越嚴(yán)重，最低0分，最高18分。

1.3.3 ELISA檢測(cè)炎癥因子含量：分別于傷后第7天取創(chuàng)傷灶附近腦組織制備腦組織勻漿，以4000 r/min高速離心15 min，分離上清液，然后按照ELISA試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，檢測(cè)勻漿中IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF-α)三種炎癥因子的含量。檢測(cè)3次取平均值。

1.3.4 神經(jīng)細(xì)胞凋亡率檢測(cè)：損傷7 d后，小鼠灌注取腦，30%蔗糖浸泡沉底，然后用Themo切片機(jī)冰凍切片，切片厚度16 μm。使用商用試劑盒碧云天生產(chǎn)的一步法TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒，選用固定液4%多聚甲醛處理40 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗10 min，共2～3次，加入含0.5% Triton X-100的PBS液打孔10 min，根據(jù)說(shuō)明書(shū)配置檢測(cè)液，避光37 ℃水浴1 h，PBS充分清洗后，加入Hoechst孵育15 min，封片后觀察，拍照后計(jì)算TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞的百分比=(TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量/Hoechst陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量)×100%。

1.3.5 免疫熒光檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)：損傷7 d后，灌注取腦，然后用Themo切片機(jī)制作厚度為16 μm的冰凍切片。取實(shí)驗(yàn)用冰凍切片常規(guī)過(guò)夜，4%多聚甲醛固定切片15 min，PBS充分漂洗，在切片上滴加0.3% Triton X-100溶液和Iba1一抗(封閉血清稀釋)混合后，4 ℃過(guò)夜。PBS漂洗5 min共3次，與相應(yīng)二抗以及Hoechst混合，室溫孵育2 h，封片，觀察期間注意避光。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠TBI后不同時(shí)間mNSS評(píng)分比較 見(jiàn)圖1。損傷后第1、3、7 天，TBI組小鼠mNSS評(píng)分明顯高于Sham組，說(shuō)明Sham組小鼠的神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能受損明顯；NGN給藥組評(píng)分較TBI組明顯降低但仍高于Sham組(均P<0.05)，說(shuō)明NGN可以改善TBI小鼠的神經(jīng)功能。

注：與Sham組比較，*P<0.01,**P<0.001 ；與 TBI組比較，#P<0.01,##P<0.001

2.2 各組小鼠TBI后第7 天腦組織內(nèi)炎癥因子含量比較 見(jiàn)圖2。小鼠TBI后第7天，ELISA法檢測(cè)腦組織炎癥因子含量顯示，與Sham組比較，TBI組小鼠腦組織中TNF-α、IL-6、IL-1β的表達(dá)水平均有明顯升高(均P<0.05)；與TBI組比較，NGN低、中、高劑量組小鼠組織中TNF-α、IL-6、IL-1β濃度顯著下調(diào)，并且炎癥因子表達(dá)程度的下降趨勢(shì)呈明顯的劑量依賴性(均P<0.05)。

注：與Sham組比較，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 ；與TBI組比較，#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001

2.3 各組小鼠TBI后第7天腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡率比較 見(jiàn)圖3。在TBI建模7 d后，應(yīng)用Tunel法評(píng)估各組小鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示，相比于Sham組，TBI組小鼠中傷后腦組織神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡率顯著上調(diào)(P<0.05)；對(duì)比TBI組，NGN給藥組小鼠神經(jīng)元凋亡率顯著下降，并且呈現(xiàn)出劑量依賴性(均P<0.05)。

注：與Sham組比較，*P<0.05,***P<0.001；與TBI組比較，##P<0.01

2.4 各組小鼠TBI后第7 天腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞活化情況比較 見(jiàn)圖4。在TBI建模7 d后，檢測(cè)小鼠腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞活化情況。與Sham組相比，TBI組小鼠損傷區(qū)周圍出現(xiàn)大量活化的Iba1陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞，出現(xiàn)明顯的胞體較大且增厚、突起變短的特征；而在給藥組中，胞體較TBI組變小，突起變長(zhǎng)，即說(shuō)明NGN干預(yù)明顯抑制了Iba1陽(yáng)性細(xì)胞的活化。

圖4 各組小鼠TBI后第7天腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞活化情況比較

3 討 論

在本研究中發(fā)現(xiàn)，NGN可以抑制受損后腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度活化，降低TBI小鼠腦組織內(nèi)炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α的表達(dá)，進(jìn)而抑制損傷后腦組織內(nèi)過(guò)度炎性反應(yīng)，減少細(xì)胞凋亡壞死，改善神經(jīng)功能?，F(xiàn)有研究證實(shí)，炎性反應(yīng)是繼發(fā)性損傷核心機(jī)制，原發(fā)性顱腦損傷發(fā)生后，患側(cè)組織內(nèi)迅速激活炎性反應(yīng)，上調(diào)炎性因子，加劇神經(jīng)元的凋亡、壞死以及血腦屏障的破壞，從而加重神經(jīng)功能損傷[13]。因此，我們認(rèn)為柚皮素可以調(diào)控炎癥因子的表達(dá)，抑制過(guò)度炎性反應(yīng)的發(fā)生，從而達(dá)到修復(fù)重建神經(jīng)組織、改善TBI預(yù)后情況的目的。

NGN是一種黃酮類化合物，臨床實(shí)踐中常被用于治療動(dòng)脈硬化和冠心病以及降血脂[14-15]。研究表明，NGN可以上調(diào)乙醛還原酶、乙醛脫氫酶活性，增加高密度脂蛋白膽固醇與總膽固醇的比例，降低甘油三酯含量，促進(jìn)膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)、抑制高密度脂蛋白向極低密度脂蛋白或低密度脂蛋白轉(zhuǎn)化，從而降低動(dòng)脈硬化指數(shù)，治療冠心病[10]；有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，一定劑量的NGN可顯著下調(diào)血清膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、血漿高密度脂蛋白膽固醇、甘油三酯，同時(shí)在一定程度上提高血清高密度脂蛋白膽固醇的含量，最終達(dá)到降血脂作用[16]。另有研究顯示，蛋白激酶C(Protein kinase C，PKC)-δ是一種炎癥調(diào)節(jié)因子，可以調(diào)節(jié)促炎基因的表達(dá)以及趨化因子的釋放，而NGN可通過(guò)抑制PKC-δ的表達(dá)減輕大鼠腦出血后炎癥損傷[17]。鑒于此，我們推測(cè)NGN能否在TBI后繼發(fā)性炎性反應(yīng)中發(fā)揮作用，尤其是其是否可抑制TBI后過(guò)度的炎性反應(yīng)，進(jìn)而減輕繼發(fā)性腦損傷，改善患者預(yù)后發(fā)揮作用。但NGN在TBI的炎性反應(yīng)中的作用機(jī)制仍缺乏研究報(bào)道，因此本研究針對(duì)于此設(shè)計(jì)相關(guān)實(shí)驗(yàn)并嘗試解釋其作用機(jī)制。

炎性反應(yīng)是誘發(fā)繼發(fā)性腦損傷的重要機(jī)制之一，已有研究證實(shí)：腦組織損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生極化，其極化狀態(tài)可分為經(jīng)典激活表型(M1型)和交替激活表型(M2型)兩種表型[18]。而在損傷早期，小膠質(zhì)細(xì)胞首先極化為M2型小膠質(zhì)細(xì)胞，其可分泌IL-10等抗炎性因子，同時(shí)上調(diào)神經(jīng)保護(hù)因子含量，修復(fù)損傷組織[19]。隨病情發(fā)展，TBI中后期M2型小膠質(zhì)細(xì)胞向M1型小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，分泌大量M1型相關(guān)細(xì)胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α，過(guò)度IL-6促炎性因子抑制IL-10等抗炎癥因子表達(dá)誘發(fā)炎性反應(yīng)，導(dǎo)致繼發(fā)性腦損傷或致使其加重[20]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在TBI小鼠模型中L-6、IL-1β、TNF-α表達(dá)明顯上調(diào)，NGN給藥組中，受損組織的炎癥因子的含量明顯下降，且下降程度與劑量呈正相關(guān)，說(shuō)明NGN干預(yù)可以下調(diào)組織中的多種重要炎癥因子的表達(dá)，進(jìn)而起到抑制TBI后繼發(fā)性炎癥損傷的作用。既然NGN干預(yù)可以下調(diào)炎癥因子的表達(dá)，我們推測(cè)是否跟小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量以及活化狀態(tài)有關(guān)。因此，我們接下來(lái)檢測(cè)了TBI后腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞的活化情況。鏡下觀察結(jié)果證實(shí)，損傷處周圍組織中出現(xiàn)大量活化的小膠質(zhì)細(xì)胞，胞體較Sham組增大且增厚，突起較短，證明了小膠質(zhì)細(xì)胞參與了TBI后的繼發(fā)性損傷；而NGN干預(yù)后，小膠質(zhì)細(xì)胞的活化狀態(tài)受到了顯著抑制，其胞體變小，突起變長(zhǎng)，證實(shí)NGN可有效地抑制小膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度活化。接下來(lái)，我們認(rèn)為NGN可以有效地抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)度活化下調(diào)因子的表達(dá)，那是否可以降低細(xì)胞的凋亡。細(xì)胞凋亡率檢測(cè)結(jié)果證實(shí)，NGN可以抑制受損腦組織周圍細(xì)胞的凋亡，緩解繼發(fā)性腦損傷，最終改善小鼠的神經(jīng)功能，這從mNSS評(píng)分結(jié)果可以得出，NGN給藥組評(píng)分較TBI組明顯降低且治療效果與給藥劑量有關(guān)。

綜上所述，NGN可以通過(guò)抑制炎癥因子分泌，減輕TBI后過(guò)度炎性反應(yīng)，降低損傷后細(xì)胞凋亡率，進(jìn)而對(duì)TBI小鼠起到神經(jīng)保護(hù)的作用，其機(jī)制可能與NGN的干預(yù)能夠抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化有關(guān)，但其具體調(diào)節(jié)機(jī)制將是我們下一階段的研究重點(diǎn)。