洪 甲,胥愛輝,龐 婷,楊 洋,江 點
(1.西安國際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院產(chǎn)科,陜西 西安 710100;2.西安醫(yī)學(xué)院,陜西 西安 710021;3.西安航天總醫(yī)院婦科,陜西 西安 710100)
復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(Recurrent spontaneous abortion,RSA)定義為與同一性伴侶發(fā)生3次及3次以上的,妊娠小于28周的妊娠丟失者,其中絕大多數(shù)常見于妊娠早期[1]。在育齡期人群中,RSA發(fā)生率可達(dá)3%[2],尤其伴隨著RSA發(fā)生次數(shù)的增多,該類型患者獲得成功妊娠的概率嚴(yán)重下降[3],造成患者及其家庭巨大身心和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。但是RSA病因至今尚未明確,涉及解剖學(xué)、遺傳因素、內(nèi)分泌異常、免疫原因、感染等諸多方面[4];近年來RSA不同病因?qū)W領(lǐng)域的機(jī)制性研究取得了一定進(jìn)展,其中妊娠建立伊始多因素導(dǎo)致的母胎界面異常為主要病理生理學(xué)基礎(chǔ)[5]。具備正常功能的滋養(yǎng)細(xì)胞以及良好的蛻膜狀態(tài)是保證成功妊娠的關(guān)鍵,Notch信號通路能夠通過參與細(xì)胞功能調(diào)節(jié),與滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤、胎盤血管形成、胚胎著床等多種妊娠生理過程直接相關(guān)[6]。Notch信號通路高度保守,其作為跨膜蛋白,主要通過其受體、配體相互作用,精準(zhǔn)地傳遞相關(guān)信號,從而在調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、 凋亡方面發(fā)揮重要生理作用。其中,在哺乳動物種類中,Notch信號通路相關(guān)受體被發(fā)現(xiàn)有4種基因型,分別是Notch1、Notch2、Notch3、Notch4;而相關(guān)配體有5種,即DLL1、DLL3、DLL4、Jagged1、Jagged2,它們均為跨膜蛋白,并能與Notch受體結(jié)合。當(dāng)受體與配體結(jié)合后,Notch通路被激活并通過經(jīng)典與非經(jīng)典兩種途徑發(fā)揮其生理調(diào)控作用,目前已被證實與子癇前期等病理妊娠發(fā)生密切相關(guān)[6],但具體方式尚不明確。然而,Notch信號通路是否也與RSA發(fā)生發(fā)展相關(guān),并且其初步參與RSA發(fā)病的方式如何,為本研究探討的內(nèi)容。
1.1 一般資料 按照相關(guān)指南的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7],選取行人工流產(chǎn)術(shù)的RSA患者15例為RSA組,該組患者均為≥3次自然流產(chǎn)者,平均年齡(25.17±7.22)歲,妊娠時間(9.85±2.02)周,夫妻雙方無染色體異常,絨毛組織染色體檢測結(jié)果正常。另選取同期正常早孕要求終止妊娠的患者15例作為正常組,該組患者均為初次妊娠,平均年齡(24.83±6.78)歲,妊娠時間(8.22±2.31)周。兩組患者體重指數(shù)≤25 kg/m2,均無妊娠感染、代謝、循環(huán)、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病,均無門診手術(shù)前特殊藥物使用史。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員同意并批準(zhǔn),所有患者均簽署知情同意書。
1.2 研究方法
1.2.1 研究標(biāo)本收集:于人工流產(chǎn)術(shù)后分別收集患者的絨毛及蛻膜組織,0.9%氯化鈉溶液漂洗干凈后迅速置于液氮中,隨后分管標(biāo)記、凍存于超低溫冰箱中待檢,所有標(biāo)本均經(jīng)過無RNA酶化處理。
1.2.2 Notch信號通路相關(guān)受體及配體mRNA表達(dá)水平檢測:使用RNA提取試劑Trizol(購自上海碧云天生物公司)提取兩組絨毛及蛻膜組織中總RNA;紫外分光光度計檢測RNA含量后,使用反轉(zhuǎn)錄試劑Prime Script RT Reagent kit(購自日本Takara公司)合成cDNA;按照qRT-PCR試劑盒說明(購自日本Takara公司)步驟進(jìn)行實驗;PCR反應(yīng)條件為95 ℃、10 min,95 ℃、15 s,57 ℃、60 s,95 ℃、15 s,39個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參,進(jìn)行PCR反應(yīng)。檢測兩組絨毛及蛻膜組織中Notch1、Notch2、Notch3、Notch4及DLL1、DLL3、DLL4、Jagged1、Jagged2在mRNA水平的表達(dá)情況。每組實驗重復(fù)3次。具體引物序列見表1。
表1 目的基因引物序列
1.2.3 Notch信號通路相關(guān)受體及配體蛋白表達(dá)水平檢測:使用RIPA裂解液(購自上海碧云天生物公司)提取兩組絨毛及蛻膜組織中總蛋白;按照BCA試劑盒(購自上海碧云天生物公司)說明書步驟檢測蛋白濃度。隨后進(jìn)行Western blot實驗,配膠完成后,上樣電泳;電轉(zhuǎn)儀將目的條帶轉(zhuǎn)至PVDF膜上(購自美國Millipore公司),完成室溫封閉后,加一抗(Notch1、Notch2、Notch3、Notch4及DLL1、DLL3、DLL4、Jagged1、Jagged2單克隆抗體分別購自英國Abcam公司和武漢博士德生物工程有限公司)至PVDF膜孵育(抗體濃度:Notch1 1∶2500、Notch2 1∶3000、Notch3 1∶2500、Notch4 1∶2000、DLL1 1∶2000、DLL3 1∶3000、DLL4 1∶2500、Jagged1 1∶2500、Jagged2 1∶2000、內(nèi)參β-actin 1∶500);第2天PVDF膜加HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(抗體濃度1∶30000,購自上海碧云天生物公司)常溫孵育;孵育完成后,加ECL底物液(購自美國Millipore公司)并按照試劑盒說明完成化學(xué)發(fā)光過程;最后使用Invitorgen iBright FL1500 凝膠多功能成像系統(tǒng)分析膠片灰度值。每組實驗重復(fù)3次。
2.1 兩組絨毛及蛻膜組織中Notch信號通路相關(guān)受體及配體mRNA表達(dá)水平比較 qRT-PCR結(jié)果顯示,與正常組相比,RSA組絨毛組織中Notch1、Notch2、Notch4、DLL4、Jagged1、Jagged2在mRNA水平表達(dá)均降低(均P<0.01),Notch3、DLL1、DLL3表達(dá)在兩組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異(均P>0.05)。與正常組相比,RSA組蛻膜中Notch1、Notch2、Notch4、DLL1、DLL4、Jagged1、Jagged2在mRNA水平表達(dá)均降低(均P<0.05),Notch3、DLL3表達(dá)在兩組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異(均P>0.05)。見表2、3。
表2 兩組絨毛組織中Notch信號通路相關(guān)受體及配體mRNA表達(dá)水平比較
表3 兩組蛻膜組織中Notch信號通路相關(guān)受體及配體mRNA表達(dá)水平比較
2.2 兩組絨毛及蛻膜組織中Notch信號通路相關(guān)受體及配體蛋白表達(dá)水平比較 Western blot結(jié)果提示,與正常組相比,RSA組絨毛中Notch1、Notch2、Notch4、DLL4、Jagged1、Jagged2蛋白表達(dá)水平均降低(均P<0.01),Notch3、DLL1、DLL3表達(dá)在兩組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異(均P>0.05),見圖1(表4)。與正常組相比,RSA組蛻膜中Notch1、Notch2、Notch4、DLL1、DLL4、Jagged1、Jagged2蛋白表達(dá)水平均降低(均P<0.01),Notch3、DLL3表達(dá)在兩組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異(均P>0.05),見圖2(表5)。
表4 兩組絨毛組織中Notch信號通路相關(guān)受體及配體蛋白表達(dá)水平比較
表5 兩組蛻膜組織中Notch信號通路相關(guān)受體及配體蛋白表達(dá)水平比較
RSA為臨床中常見疾病,因其復(fù)雜和尚不明確的病因,目前尚未有較為精準(zhǔn)的診斷方法及治療手段[8],逐漸成為困擾人類生殖健康的一大問題。目前,基于RSA的病因?qū)W研究種類繁多,涉及免疫、細(xì)胞自噬[9]、非編碼RNA[10]等,但無論研究領(lǐng)域如何,正常且順利的胚胎著床以及容受性良好的蛻膜環(huán)境為避免RSA發(fā)生的基本要素。而Notch信號通路廣泛表達(dá)于女性生殖系統(tǒng)(如子宮內(nèi)膜)及妊娠相關(guān)組織(如胎盤、胚胎囊泡)中,其本身作為一類高度保守的受體-配體信號系統(tǒng),在細(xì)胞增殖、凋亡、分化、侵襲、黏附,以及細(xì)胞間免疫調(diào)節(jié)方面均發(fā)揮重要生理性作用[11];而Notch信號通路受體-配體表達(dá)的缺失或者異常均可直接影響上述生理過程,導(dǎo)致妊娠過程異常的發(fā)生,包括RSA、子癇前期疾病等[6]。
作為跨膜蛋白家族,Notch信號通路的正常運轉(zhuǎn)依靠其受體與配體間的正常相互作用。相關(guān)研究[12-13]表明,在整個妊娠期,部分Notch信號通路相關(guān)配體及受體可在不同類型絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞及蛻膜基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。因此,本研究從“種子”(絨毛)和“土壤”(蛻膜)組織層面出發(fā),探究Notch信號通路參與RSA的可能方式。我們選擇正常早孕流產(chǎn)患者作為對照,研究RSA患者絨毛及蛻膜組織中Notch信號通路相關(guān)受體及配體的表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn):在Notch受體層面,RSA組患者絨毛及蛻膜組織中Notch1、Notch2、Notch4在mRNA及蛋白水平表達(dá)降低,而Notch3表達(dá)則在兩組間無統(tǒng)計學(xué)差異;作為哺乳動物中表達(dá)的4種Notch受體,均可在滋養(yǎng)細(xì)胞或子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá);其中Notch1、Notch2能夠通過對白介素4的表達(dá)調(diào)控,促進(jìn)輔助性T細(xì)胞的分化[14];而在體外實驗中也發(fā)現(xiàn)Notch1能夠增加兩種滋養(yǎng)細(xì)胞的浸潤過程[15];Notch2則在胚胎著床早期能夠影響滋養(yǎng)層細(xì)胞多種功能[16];此外,Notch4在子宮內(nèi)膜增殖期表達(dá)增高,被證明參與內(nèi)膜容受性調(diào)節(jié)過程[17];Notch4也能夠參與滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲性調(diào)節(jié)與螺旋動脈重鑄過程[18]。結(jié)合本研究中發(fā)現(xiàn)提示Notch1、Notch2、Notch4的表達(dá)降低,進(jìn)一步減低了Notch信號通路的受體-配體結(jié)合率,影響了該通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用,減弱了滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲、蛻膜正常容受性建立過程,從而可能與RSA相關(guān)。
Notch配體包括Delta 樣分子(DLL)以及Serrate 的同源分子(Jagged),當(dāng)Notch配體與受體結(jié)合后,才會激活轉(zhuǎn)錄活化因子,發(fā)揮其細(xì)胞功能調(diào)節(jié)能力;DLL及Jagged均能夠反向促進(jìn)和激活Notch信號通路作用。本研究中我們對Notch配體檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn):RSA組絨毛組織中DLL4、Jagged1、Jagged2在mRNA及蛋白水平表達(dá)降低,DLL1、DLL3表達(dá)在兩組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異;而在RSA組蛻膜中DLL1、DLL4、Jagged1、Jagged2在mRNA及蛋白水平表達(dá)均降低,DLL3表達(dá)在兩組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異。DLL4、Jagged1能夠促進(jìn)母胎界面T細(xì)胞增殖;而相關(guān)研究已證實DLL4、Jagged1、Jagged2在子癇前期胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞中低表達(dá),它們與胎盤血管形成異常相關(guān)[19-20],這與我們的發(fā)現(xiàn)具有一致性。而除外內(nèi)皮細(xì)胞,DLL1、DLL4也可表達(dá)于子宮內(nèi)膜NK細(xì)胞,并通過影響γ干擾素分泌,發(fā)揮Notch通路對螺旋動脈重鑄的影響。而DLL3與其他配體不同,其能夠抑制其他配體與Notch通路的結(jié)合,進(jìn)而降低Notch通路的激活[21]。綜上,推測由于分布于不同生殖相關(guān)組織(滋養(yǎng)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞等)的Notch信號通路部分配體表達(dá)下降,從而導(dǎo)致Notch信號傳導(dǎo)激活過程受阻,進(jìn)一步導(dǎo)致母胎界面中免疫平衡、滋養(yǎng)細(xì)胞功能異常、血管重鑄及蛻膜化過程障礙等發(fā)生,最終誘發(fā)RSA產(chǎn)生。
本研究中發(fā)現(xiàn)Notch信號通路部分相關(guān)受體及配體在RSA患者絨毛及蛻膜組織中呈現(xiàn)病理性低表達(dá),一方面提示Notch信號通路與RSA發(fā)病相關(guān),另一方面也說明Notch信號通路可因受體-配體結(jié)合異常,在妊娠早期從胚胎本身及蛻膜狀態(tài)兩個層面影響了最終的正常植入過程,即參與了RSA發(fā)生。本研究為進(jìn)一步明確RSA發(fā)病機(jī)制提供了實驗依據(jù)。