基于生信分析篩選鼻咽癌放療抵抗干性相關(guān)基因及相關(guān)通路的研究

陳勁海，徐亞麗

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院耳鼻喉科，廣東 廣州510260)

鼻咽癌是一種起源于鼻咽黏膜上皮的惡性腫瘤，其全球地理分布極不平衡，80%的鼻咽癌病例都集中在中國華南地區(qū)和東南亞。大灣區(qū)NPC發(fā)病率高居全球第一，特別是廣東地區(qū)的人患鼻咽癌的概率，是其它低發(fā)病率地區(qū)的20倍。放射治療是非轉(zhuǎn)移性鼻咽癌的主要治療手段[1-2]。但是大約15%～30%的NPC患者在放射治療后出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)和/或遠處轉(zhuǎn)移，而放療抵抗的存在可能是導(dǎo)致這類患者治療失敗的主要原因，并嚴重制約了患者的預(yù)后及生存質(zhì)量[3-4]。

腫瘤干細胞是腫瘤中一群具有干細胞特性的異質(zhì)細胞，這些細胞可以不斷進行自我更新和無限增殖，并且多向分化，促使腫瘤生長、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移[5]。普遍認為CSCs特征的細胞群比普通腫瘤細胞具有更明顯的放療抵抗效應(yīng)，是造成許多晚期腫瘤患者對放療耐受和復(fù)發(fā)的重要原因[6]。腫瘤干細胞學(xué)說的提出為我們重新認識腫瘤的起源和本質(zhì)以及臨床腫瘤治療提供了新的方向。仍而，系統(tǒng)應(yīng)用腫瘤干細胞理論來指導(dǎo)鼻咽癌的放療增敏，計算識別干性相關(guān)基因還未有報道。因此，本文通過結(jié)合腫瘤相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子、腫瘤放療抵抗干性相關(guān)基因和腫瘤特征通路構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，甄別鼻咽癌放療抵抗干性相關(guān)基因和關(guān)鍵的信號通路，為后期的增敏鼻咽癌放療效果，改善和提高患者生存質(zhì)量及預(yù)后提供了可靠的分子標志物和潛在的治療靶點，具有重要的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集及處理

在GEO數(shù)據(jù)庫下載鼻咽癌數(shù)據(jù)集GSE32389。數(shù)據(jù)內(nèi)容主要包括轉(zhuǎn)錄組及對應(yīng)的輻射信息等臨床數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)下載完成后在本地后進行統(tǒng)一管理，數(shù)據(jù)進行對數(shù)變換進行標化操作，共有20例樣本可以可用于下游的數(shù)據(jù)分析。差異表達基因的篩選條件為調(diào)整P<0.05和|log2FC|>1。

1.2 識別鼻咽癌放療抵抗干性相關(guān)基因

腫瘤干性的數(shù)據(jù)和方法主要參考Tathiane MM[7]，該文獻通過分析人胚胎發(fā)育各階段干性細胞數(shù)據(jù),采用機器學(xué)習(xí)模型(單類別的logistic回歸模型)得到了關(guān)于細胞干性指數(shù)的評價指標。其具體模型為最小化下述數(shù)學(xué)表達式為(參考gelnet軟件包技術(shù)文檔)：

其中si=wTxi，w為基因干性的權(quán)重系數(shù)，gi為基因表達水平，正則化項:

1.3 鼻咽癌放療抵抗干性相關(guān)基因的基因本體(GO)和京都基因和基因組百科全書(KEGG)通路富集分析

基因的差異表達采用經(jīng)驗貝葉斯模型進行分析(limma v3.51.8),后續(xù)通過下載MSigDB(version 7.0,https:∥www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/index.jsp)提供的基因集數(shù)據(jù)庫，進行基因功能的富集分析(clusterProfiler v 4.3.4)，包括GO 聚類和KEGG 信號通路等，識別調(diào)控鼻咽癌放療抵抗相關(guān)基因的重要細胞分子過程及相關(guān)通路。

1.4 構(gòu)建鼻咽癌放療抵抗基因網(wǎng)絡(luò)

通過Cistrome數(shù)據(jù)庫(http:∥cistrome.org/)可下載318個腫瘤相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子(TFs)，同時根據(jù)MSigDB數(shù)據(jù)庫中收錄的50個腫瘤特征集(Cacer hallmark)，通過GSVA(version 1.38.0)計算單樣本通路基因集變異分數(shù),再結(jié)合上述識別的鼻咽癌放療抵抗干性基因,可構(gòu)建鼻咽癌放療抵抗基因網(wǎng)絡(luò)，在此基礎(chǔ)上進行網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)分析(igraph version 1.2.5)，識別放療抵抗重要的功能模塊(Cystoscape與igraph軟件包)，同時根據(jù)網(wǎng)絡(luò)結(jié)點的連接度，介數(shù)及緊密性等指標篩選重要的網(wǎng)絡(luò)結(jié)點基因。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

本研究均應(yīng)用R(version 4.0.2)軟件對數(shù)據(jù)進行分析，用ggplot2(version 3.3.3)軟件包等統(tǒng)計可視化工具軟件進行統(tǒng)計作圖，其中熱圖采用ComplexHeatmap(v2.11.1),放療抵抗基因網(wǎng)絡(luò)采用network(v1.17.1)。

2 結(jié) 果

2.1 鼻咽癌干性指數(shù)的評分

圖1 鼻咽癌干性指數(shù)與放療敏感性的ROC曲線

2.2 計算識別鼻咽癌放療抵抗干性相關(guān)基因及GO,KEGG富集分析

根據(jù)基因表達數(shù)據(jù)和干性分數(shù),分別計算放療抵抗差異表達基因733個和和干性相關(guān)差異基因678個(圖2A，B和圖3A，B)。GO分析顯示放療抵抗差異基因調(diào)節(jié)的生物過程主要集中在B細胞介導(dǎo)免疫、免疫效應(yīng)過程和分子介導(dǎo)的免疫反應(yīng)；調(diào)節(jié)的細胞成分富集在質(zhì)膜外；調(diào)節(jié)的分子功能富集在細胞因子受體結(jié)合、細胞因子結(jié)合和酪氨酸蛋白激酶結(jié)合(圖2C)。KEGG分析顯示差異基因可在Intestinal immune network for IgA production、JAK-STAT、Cytokine-cytokine receptor interaction等信號通路富集(圖2D)。另外，干性相關(guān)差異基因的GO分析顯示其生物過程主要集中在細胞活化的正調(diào)控、適應(yīng)性免疫反應(yīng)、細胞黏附的正調(diào)控等。KEGG分析顯示基因可在Cytokine-cytokine receptor interaction、I型糖尿病、同種異體移植排斥等相關(guān)信號通路富集(圖3C,3D)。采用彈性網(wǎng)絡(luò)logistic回歸機器學(xué)習(xí)方法識別放療抵抗干性相關(guān)差異表達相關(guān)基因,共篩選到27個,分別為ACTC1，AGTRAP，CHRM5，CNIH3，DPT，F(xiàn)AM8A1，F(xiàn)ANCL，HAS2，HOXB2，IGLC1，IL1RN，KIFAP3，LNX1，MRPL13，MYL6，NLRP14，PRKDC，RABAC1，RABGAP1L，RALA，SENP5，SERPING1，SMDT1,SPAG7，TMA16，TMTC4和ZBTB33。

注：A：差異基因表達熱圖；B：差異基因表達的火山圖；C：差異基因Go分析；D：差異基因KEGG分析

注：A：差異基因表達熱圖；B：差異基因表達的火山圖；C：差異基因GO分析；D：差異基因KEGG分析

2.3 鼻咽癌放療抵抗網(wǎng)絡(luò)分析

首先進行放療抵抗相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和腫瘤特征的篩選(圖4)，進而相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子、腫瘤放療抵抗干性相關(guān)基因和腫瘤特征變異分數(shù)計算兩兩相關(guān)系數(shù),再根據(jù)相關(guān)系數(shù)構(gòu)建三者的相關(guān)網(wǎng)絡(luò)(圖5)。通過網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)分析,識別放療抵抗重要的功能模塊，同時根據(jù)網(wǎng)絡(luò)結(jié)點的連接度,認為PRKDC、HOXB2和ZBTB33在網(wǎng)絡(luò)中有著重要的作用,可作為鼻咽癌放療增敏的侯選標靶。

注：A、B：鼻咽癌放療抵抗干性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達及對應(yīng)的P值；C、D：鼻咽癌放療抵抗干性相關(guān)腫瘤特征的變異分數(shù)及對應(yīng)的P值。

注：A：熱圖；B：網(wǎng)絡(luò)拓撲結(jié)構(gòu)圖

3 討 論

本研究圍繞鼻咽癌臨床工作中放療抵抗導(dǎo)致治療后腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移這一突出問題，立足于腫瘤干細胞的視野，通過整合現(xiàn)有的腫瘤干細胞研究成果和多個有關(guān)鼻咽癌放療相關(guān)數(shù)據(jù)，在統(tǒng)一統(tǒng)計模型下進行分析，識別鼻咽癌放療抵抗干性相關(guān)基因，該方法可以解決傳統(tǒng)上只針對大部分腫瘤細胞而忽略CSCs的問題，使靶點更為可靠。

本文采用彈性網(wǎng)絡(luò)logistic回歸機器學(xué)習(xí)方法識別到27個放療抵抗干性相關(guān)差異表達相關(guān)基因。KEGG通路富集分析結(jié)果表明，其主要富集于JAK-STAT、Cytokine-cytokine receptor interaction等信號通路。腫瘤干細胞介導(dǎo)放療抵抗性的機制涉及到DNA修復(fù)的激活、清除活性氧防止不可逆的氧化應(yīng)激、抗細胞凋亡和改變腫瘤微環(huán)境[8]。大量研究表明，IL-6/JAK2/STAT3信號通路在許多類型的癌癥中異常高活化，同時強烈抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)，它在抑制腫瘤生長、癌細胞的耐藥、放療抵抗、抗腫瘤免疫方面具有相當(dāng)大的潛力和前景[9-13]。但IL-6/JAK/STAT3信號通路在鼻咽癌中的相關(guān)研究卻并不多見，尤其是放療抵抗方面的研究則更少見。

本研究最終確定的3個核心基因，PRKDC、HOXB2和ZBTB33均可以通過調(diào)控多種腫瘤細胞的DNA損傷修復(fù)、細胞周期和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等方面，維持不同腫瘤細胞的生物學(xué)活動[14-17]。

PRKDC(Proteinkinase,DNA-activated,catalytic subunit)基因編碼合成細胞核內(nèi)DNA依賴性絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(DNA-PK)的催化亞基，其蛋白產(chǎn)物為非同源末端連接修復(fù)(nonhomologous end joining，NHEJ)通路中重要的功能執(zhí)行因子。帥等通過綜合分析GEO和TCGA數(shù)據(jù)庫，并結(jié)合預(yù)后差異發(fā)現(xiàn)，PRKDC與食管鱗癌放射敏感性和預(yù)后均相關(guān)，且高表達患者經(jīng)過放射治療更易獲得完全緩解，預(yù)后也越好[18]。與其不同的是，Chen等發(fā)現(xiàn)miRNA-218-5p可以抑制抗輻射肺癌細胞的PRKDC的活性，從而加速DNA損傷、細胞凋亡并增加細胞的放療敏感性[19]。Zhang等發(fā)現(xiàn)敲低胃癌細胞的PRKDC表達可以促進DNA損傷，并提高胃癌細胞的化療抵抗性，提示PRKDC可作為克服胃癌化療抵抗的潛在靶點[20]。

Jing等發(fā)現(xiàn)HOXB2 and FOXC1通過促進Wilms瘤細胞的增殖和遷移作用而協(xié)同驅(qū)動Wilms腫瘤的進展[16]。Xu等發(fā)現(xiàn)HOXB2可以直接與c-Myc和Nanog的啟動子區(qū)域結(jié)合而激活其轉(zhuǎn)錄功能從而促進食管鱗狀細胞癌干細胞特性[21]。

ZBTB33基因位于Xq23，編碼的Kaiso蛋白屬于鋅指蛋白超家族中BTB/POZ轉(zhuǎn)錄因子亞家族的成員。Singha等研究發(fā)現(xiàn)Kaiso(ZBTB33)的亞細胞分布與其他乳腺癌生物標志物之間的多重多元分析揭示了Kaiso和自噬相關(guān)蛋白LC3A/B之間新的功能和預(yù)測聯(lián)系，這些蛋白與腫瘤免疫微環(huán)境、生存和種族的特征相關(guān)[22]。Feng等發(fā)現(xiàn)miR-4262可抑制宮頸癌細胞的增殖和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，接著又通過生信分析和熒光素酶報告實驗證實ZBTB33是miR-4262的潛在靶基因[15]。李等通過建立肺癌細胞增殖調(diào)控網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)，ZBTB33可以通過p53信號通路促進腫瘤細胞的增殖[23]。

綜上所述，本研究基于生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，PRKDC、HOXB2和ZBTB33可能是導(dǎo)致鼻咽癌放療抵抗的干性相關(guān)基因，這些基因可能成為提高鼻咽癌放療增敏、改善預(yù)后的潛在治療靶點。接下來，本研究團隊將設(shè)計相關(guān)生物實驗及臨床樣本進一步研究其分子機制，以期為今后臨床試驗和工作提供更加可靠的依據(jù)。