磁性氧化石墨烯分散固相萃取/液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定PVC兒童用品中內(nèi)分泌干擾物遷移量

曹 慧，張 慧，楊 春，姜 侃，王 瑾

（1.浙江省產(chǎn)品質(zhì)量安全科學(xué)研究院，浙江 杭州 310013；2.浙江科技學(xué)院，浙江 杭州 310023）

兒童用品的質(zhì)量安全直接關(guān)系著兒童的身體健康。有害化學(xué)物質(zhì)是影響兒童用品質(zhì)量安全的重要因素，這些物質(zhì)通過兒童接觸相關(guān)用品后進(jìn)入體內(nèi)，對兒童造成慢性積累性傷害。以雙酚A 和壬基酚為代表的內(nèi)分泌干擾物是一類會(huì)引起兒童性早熟的有害物質(zhì)，通常作為助劑添加在PVC 材質(zhì)的兒童用品中。

美國、加拿大、歐洲和日本等國家不允許在嬰幼兒產(chǎn)品中使用雙酚A。歐盟2017/898 號指令針對玩具的雙酚A 遷移限值為0.1 mg/L，而對于不足36 個(gè)月齡幼兒使用的玩具或其他可放入口中的玩具則減至0.04 mg/L［1］。近年來，作為雙酚A 替代品的雙酚S、雙酚F、雙酚E等多種內(nèi)分泌干擾物質(zhì)被逐步應(yīng)用于PVC 材質(zhì)中。兒童通過日常皮膚接觸或舔舐行為，經(jīng)汗液和唾液將用品中的內(nèi)分泌干擾物攝入體內(nèi)，從而影響身體健康，因此有必要開展PVC兒童用品中內(nèi)分泌干擾物遷移量的研究。

內(nèi)分泌干擾物的檢測方法主要為液相色譜法［2-3］、氣相色譜-質(zhì)譜法［4-5］和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［6-9］，其中氣相色譜-質(zhì)譜法需進(jìn)行衍生［10-11］，操作繁瑣，且衍生化試劑毒性大，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜是較為理想的檢測方法。目前已有關(guān)于內(nèi)分泌干擾物遷移量的報(bào)道［12-14］，但主要針對食品包裝材料采用食品模擬液開展遷移研究［15-16］，尚無關(guān)于PVC 兒童用品中內(nèi)分泌干擾物在人工模擬汗液和人工模擬唾液中遷移量的報(bào)道。

人工模擬汗液和人工模擬唾液由于含有大量的鹽，不能直接進(jìn)行質(zhì)譜分析，需先對遷移物進(jìn)行富集洗脫。磁性氧化石墨烯材料作為一種新型的碳納米材料，具有吸附性能強(qiáng)、分離方便、操作簡單、化學(xué)性能穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，被應(yīng)用于樣品前處理中［17-20］。本研究擬以磁性氧化石墨烯為分散固相萃取材料，富集凈化人工模擬汗液和人工模擬唾液中的雙酚A 等14種內(nèi)分泌干擾物，結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)分析PVC兒童用品中內(nèi)分泌干擾物的遷移量，為兒童用品的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測提供技術(shù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與裝置

LC-20AD 高效液相色譜儀（日本Shimadzu 公司）；QTRAP5500 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX 公司）；Milli-Q 超純水儀（美國Millipore 公司）；電子天平（梅特勒-托利多公司）；渦旋混合器（太倉市華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；固相萃取裝置（美國Waters公司）。

1.2 材料與試劑

雙酚A（BPA，純度99.9%）：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司產(chǎn)品；雙酚E（BPE，純度100.0%）、雙酚F（BPF，純度99.9%）、雙酚S（BPS，純度99.8%）、4-正辛基酚（4-n-OP，純度99.8%）、4-壬基酚（4-NP，純度99.4%）、4-正壬基酚（4-n-NP，純度99.4%）：北京Bepure 公司產(chǎn)品；雙酚B（BPB，純度98.0%）、雙酚AF（BPAF，純度99.9%）、雙酚AP（BPAP，純度99.9%）：美國TRC 公司產(chǎn)品；四溴雙酚A（TBBPA，純度98.0%）：美國Chem Service 公司產(chǎn)品；雙酚Z（BPZ，純度99.8%）：德國Dr.Ehrenstorfer GmbH 產(chǎn)品；四氯雙酚A（TCBPA，純度99.7%）、辛基酚（OP，純度98.0%）：美國AccuStandard 公司產(chǎn)品。甲醇、乙腈（色譜純，德國Merck 公司）；Oasis HLB 固相萃取柱（3 mL/60 mg，美國Waters公司）；磁性氧化石墨烯（直徑：＜5μm，F(xiàn)e3O4直徑：～10 nm）：南京先豐納米材料科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1 色譜條件色譜柱：AtlantisTMT3（150 mm×2.1 mm，3μm）；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：5.0μL；流速：0.4 mL/min；流動(dòng)相：A 為甲醇-乙腈（1∶1，體積比），B 為水。梯度洗脫程序：0～1 min，80%B；1～4 min，80%～5%B；4～8 min，5%B；8～8.2 min，5%～80%B；8.2～10 min，80%B。

1.3.2 質(zhì)譜條件離子源：電噴霧離子源；掃描模式：負(fù)離子模式；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；噴霧電壓：-4500 V；離子源溫度：550 ℃；噴霧氣：345 kPa；輔助加熱氣：379 kPa；氣簾氣：241 kPa。

1.4 溶液配制方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制準(zhǔn)確稱取14種待測物標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用甲醇溶解后定容于10 mL容量瓶中，配成1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液500 μL 至50 mL 容量瓶中，加入甲醇定容至50 mL，稀釋成質(zhì)量濃度為10.0μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)中間液。分別移取適量的標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，用基質(zhì)提取液稀釋配制成系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，其中雙酚A、雙酚E、雙酚F、雙酚AP、雙酚B、雙酚Z、四溴雙酚A、4-壬基酚、4-正壬基酚、辛基酚、4-正辛基酚的質(zhì)量濃度為0.5、1.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 μg/L，雙 酚S、雙 酚AF、四 氯 雙 酚A 的 質(zhì) 量 濃 度 為0.1、0.2、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0μg/L。

1.4.2 人工模擬液配制 分別稱取5.00 g 氯化鈉、1.00 g 尿素和1.00 g 90%的乳酸于900 mL 純水中，用1%的氫氧化鈉溶液調(diào)至pH 6.5，定容至1 L，作為人工模擬汗液。分別稱取0.17 g 氯化鎂、0.15 g氯化鈣、0.76 g磷酸氫二鉀、0.53 g碳酸鈣、0.33 g氯化鈉和0.75 g氯化鉀于900 mL 純水中，用1%的鹽酸溶液調(diào)至pH 6.8，定容至1 L，作為人工模擬唾液。

1.5 樣品前處理方法

1.5.1 樣品遷移兒童用品在人工模擬汗液和人工模擬唾液的遷移方法尚無相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。由于本文以玩具作為研究對象，故參考標(biāo)準(zhǔn)GB/T 38420-2019［21］，以每1 cm2兒童用品接觸10 mL 人工模擬液進(jìn)行遷移實(shí)驗(yàn)。試樣于室溫下在人工模擬液中浸泡2 h，將浸泡液渦旋30 s后待凈化。

1.5.2 樣品凈化準(zhǔn)確稱取10 mg磁性氧化石墨烯，加入浸泡液，渦旋混合15 min，在外磁場的作用下棄去上清液。加入3 mL 含有1%甲酸的丙酮，渦旋混合15 min，在外磁場的作用下取出上清液，氮?dú)獯抵两?，以初始流?dòng)相定容至2.0 mL，過濾膜后待測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

色譜柱的性能直接影響化合物的分離，實(shí)驗(yàn)比較了Kinetex C18（100 mm × 2.1 mm，2.6 μm）、Kinetex F5（150 mm×3.0 mm，2.6μm）、Kinetex F5（100 mm×3.0 mm，2.6μm）、AtlantisTMT3（150 mm×2.1 mm，3 μm）、XBridge C18（150 mm × 2.1 mm，1.7 μm）5 種色譜柱的分離效果。結(jié)果表明，使用AtlantisTMT3色譜柱時(shí)，14 種內(nèi)分泌干擾物的響應(yīng)和峰形優(yōu)于其他色譜柱。進(jìn)一步比較了AtlantisTMT3色譜柱長度分別為100 mm 和150 mm 時(shí)的分離效果，發(fā)現(xiàn)長度為100 mm 的色譜柱較150 mm 的色譜柱出峰快，同分異構(gòu)體不能有效分離。因此，選擇AtlantisTMT3（150 mm × 2.1 mm，3 μm）色譜柱進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

分別考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙腈（1∶1）-水作為流動(dòng)相時(shí)對14種內(nèi)分泌干擾物的分離效果。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，有機(jī)相采用甲醇體系時(shí)待測物的分離效果佳，但出峰晚、峰形不尖銳；采用乙腈體系時(shí)待測物的分離效果差，但出峰早、峰形佳；采用甲醇-乙腈（1∶1）體系時(shí)，14 種待測物的分離效果最佳，且峰形尖銳。嘗試在流動(dòng)相中加入0.1%氨水或0.1%甲酸，通過調(diào)節(jié)pH 值來影響待測物的離子化效率，結(jié)果表明，加入0.1%甲酸會(huì)抑制待測物的離子化效率，0.1%氨水的離子化效率不如水體系佳，因此采用甲醇-乙腈（1∶1）和水作為流動(dòng)相。圖1 為優(yōu)化條件下14 種內(nèi)分泌干擾物的色譜圖。

圖1 14種內(nèi)分泌干擾物的色譜圖Fig.1 Chromatogram of 14 endocrine disruptors the peak numbers denoted were the same as those in Table 1

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用針泵進(jìn)樣分別對14種內(nèi)分泌干擾物進(jìn)行母離子掃描，在電噴霧負(fù)離子模式下獲得準(zhǔn)分子離子峰，對每種化合物的母離子分別進(jìn)行二級碎片掃描，得到碎片離子信息。選取2 個(gè)響應(yīng)高、干擾小的碎片作為該化合物的子離子，并優(yōu)化去簇電壓（DP）和碰撞能量（CE）等參數(shù)，14 種待測物的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 14種內(nèi)分泌干擾物的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters of 14 endocrine disruptors

2.3 樣品凈化條件的優(yōu)化

2.3.1 磁性氧化石墨烯用量的影響考察了磁性氧化石墨烯用量分別為2、5、10、15、20 mg 時(shí)14 種待測物的回收率（見圖2）。結(jié)果表明：隨著磁性氧化石墨烯用量的增加，14 種待測物的回收率隨之增加，當(dāng)用量達(dá)到10 mg 后，14 種待測物的回收率趨于穩(wěn)定。由于磁性氧化石墨烯用量少時(shí)，通過外加磁場易于分離；用量大時(shí)，分離速度緩慢。綜合考慮，選擇磁性氧化石墨烯的用量為10 mg。

圖2 磁性氧化石墨烯用量對14種待測物萃取效率的影響Fig.2 Effect of dosage of magnetic graphene oxide on the extraction efficiencies of 14 analytes

2.3.2 吸附時(shí)間的影響考察了不同吸附時(shí)間（5、10、15、20、25 min）下14種待測物的回收率。結(jié)果表明：隨著吸附時(shí)間的增加，14種待測物的回收率隨之增加，當(dāng)吸附時(shí)間為15 min時(shí)，14種待測物的回收率最佳，之后回收率變化不明顯。因此，選擇吸附時(shí)間為15 min。

2.3.3 洗脫溶劑種類及用量的影響分別選取含1%甲酸的甲醇、乙腈、乙醇、丙酮作為洗脫溶劑，考察了14 種待測物的回收率（見圖3）。結(jié)果表明：含1%甲酸的丙酮作為洗脫溶劑時(shí)回收率最佳，故采用1%甲酸的丙酮作為洗脫溶劑。

圖3 洗脫溶劑種類對14種待測物萃取效率的影響Fig.3 Effect of desorption solvent on the extraction efficiencies of 14 analytes

分別選取1、2、3、4、5 mL含1%甲酸的丙酮進(jìn)行洗脫，考察了洗脫溶劑用量對待測物回收率的影響。結(jié)果表明：隨著洗脫溶劑體積的增加，14 種待測物的回收率增大，當(dāng)洗脫溶劑體積為3 mL 時(shí)，14 種待測物的回收率最大且趨于穩(wěn)定，因此選擇洗脫溶劑體積為3 mL。

2.3.4 洗脫時(shí)間的影響以3 mL 含1%甲酸的丙酮作為洗脫溶劑，分別考察了不同洗脫時(shí)間（5、10、15、20、25 min）下14 種待測物的回收率（見圖4）。結(jié)果表明：隨著洗脫時(shí)間的增加，14 種待測物的回收率增大，當(dāng)洗脫時(shí)間為15 min 時(shí)，14 種待測物的回收率趨于穩(wěn)定，因此選擇洗脫時(shí)間為15 min。

圖4 洗脫時(shí)間對14種待測物萃取效率的影響Fig.4 Effect of desorption time on the extraction efficiencies of 14 analytes

2.4 磁性氧化石墨烯的重復(fù)利用性能

按“1.5.2”凈化條件對磁性氧化石墨烯材料進(jìn)行反復(fù)10次吸附和脫附實(shí)驗(yàn)，考察14種待測物的回收率。結(jié)果表明：10 次實(shí)驗(yàn)中14 種待測物的回收率均在80%～120%范圍內(nèi)，說明磁性氧化石墨烯反復(fù)使用10次后，回收率能滿足分析要求。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)（ME）在質(zhì)譜分析中普遍存在，需要進(jìn)行考察評價(jià)。分別用純?nèi)軇┖突|(zhì)空白溶液稀釋標(biāo)準(zhǔn)中間液配制成系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，采用建立的方法進(jìn)行測定，通過ME=［（基質(zhì)溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率/純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線斜率）-1］×100%評價(jià)基質(zhì)效應(yīng)，ME 的絕對值小于20%時(shí)說明基質(zhì)效應(yīng)弱，ME 的絕對值為20%～50%時(shí)說明基質(zhì)效應(yīng)中等，大于50%時(shí)說明基質(zhì)效應(yīng)強(qiáng)。表2結(jié)果表明，部分化合物表現(xiàn)為中等基質(zhì)效應(yīng)，為消除基質(zhì)效應(yīng)的影響，采用基質(zhì)空白溶液配制標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行定量分析。

2.6 線性方程、檢出限與定量下限

采用本方法測定“1.4.1”配制的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以待測物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見表2）。結(jié)果顯示，14 種待測物在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.9901～0.9992，檢出限和定量下限分別為0.1 ～0.5μg/L和0.3 ～1.5μg/L。

表2 14種內(nèi)分泌干擾物的線性關(guān)系、基質(zhì)效應(yīng)、檢出限與定量下限Table 2 Linear relations，ME，LODs and LOQs of 14 endocrine disruptors

2.7 回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

取陰性樣品分別在人工汗液和人工唾液模擬物基質(zhì)中添加低、中、高3 個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度進(jìn)行6次平行實(shí)驗(yàn)，按“1.5”方法進(jìn)行前處理，采用“1.3”儀器條件進(jìn)行檢測（見表3）。結(jié)果表明：人工汗液中14種待測物的回收率為80.2%～103%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.2%～6.8%；人工唾液中的回收率為80.9%～105%，RSD為1.0%～6.4%。

表3 14種內(nèi)分泌干擾物的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 3 Recoveries and RSDs of 14 endocrine disruptors（n=6）

2.8 與商品化固相萃取柱的比較

取陰性樣品分別在人工汗液和人工唾液模擬物基質(zhì)中添加中等濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別采用Oasis HLB 固相萃取柱和磁性氧化石墨烯進(jìn)行前處理，進(jìn)行6次平行實(shí)驗(yàn)，比較商品化固相萃取柱和磁性氧化石墨烯的吸附效果。結(jié)果表明：使用Oasis HLB 前處理時(shí)14種待測物的回收率為80.8%～105%，RSD 為0.90%～6.9%；使用磁性氧化石墨烯前處理時(shí)14 種待測物的回收率為81.9%～99.8%，RSD 為0.50%～5.7%。說明磁性氧化石墨烯與商品化固相萃取柱的富集凈化效果相當(dāng)。磁性氧化石墨烯可均勻分散于溶液中，通過磁性進(jìn)行收集，可重復(fù)使用，因此與Oasis HLB 相比不僅操作簡便，且降低了實(shí)驗(yàn)成本。

2.9 樣品測定

采用本方法對25 份PVC 兒童用品進(jìn)行人工汗液和人工唾液模擬物中14 種待測物遷移量的測定，發(fā)現(xiàn)陽性樣品5份，陽性檢出率為20.0%，陽性樣品均含有雙酚A和雙酚S，部分樣品含有4-壬基酚（見表4）。結(jié)果表明：雙酚A、雙酚S和4-壬基酚在人工汗液和人工唾液中均會(huì)產(chǎn)生遷移，且遷移量相似，遷移量分別為14.1～268.9μg/L、0.3～7.8μg/L和1.7～4.6μg/L。個(gè)別兒童用品中雙酚A的遷移量較高，會(huì)對兒童的身體健康造成危害。

表4 14種內(nèi)分泌干擾物的遷移量結(jié)果Table 4 The migration results of 14 endocrine disruptors

3 結(jié)論

本文建立了磁性氧化石墨烯固相萃取/液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)測定PVC兒童用品中14種內(nèi)分泌干擾物遷移量的檢測方法，遷移至人工汗液和人工唾液中的內(nèi)分泌干擾物通過磁性氧化石墨烯富集凈化，經(jīng)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜定量分析。在最佳分析條件下，14種物質(zhì)的線性相關(guān)系數(shù)為0.9901～0.9992，檢出限為0.1～0.5μg/L，定量下限為0.3～1.5μg/L，加標(biāo)回收率為80.2%～105%，RSD為1.0%～6.8%。該方法操作簡單、分析速度快、重現(xiàn)性好，適用于PVC兒童用品中內(nèi)分泌干擾物遷移量的測定。