基于UPLC-Q-TOF MS技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)數(shù)據(jù)自動(dòng)化解析的不同花期沙棗花成分分析

張佳妮，都青鈺，汪興財(cái)，劉嘉楠，馬夢(mèng)晗，馬興玲，趙娟娟，郭曉萌，張 陽，于永杰*

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，寧夏 銀川 750004；2.浙江工業(yè)大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，浙江 杭州 310032）

沙棗花為胡頹子科胡頹子屬植物沙棗（Elaeagnus angustifoliaL.）的花朵，主要分布于我國西北地區(qū)如寧夏、甘肅、青海、新疆等地。沙棗花形似漏斗、銀白色、小而香［1］，開花時(shí)間隨不同地區(qū)的海拔高度和氣候條件而有所差異，但多集中于5 ～6 月份，花期約20 余天。沙棗花作為藥食同源的植物，具有廣泛的生物活性和應(yīng)用價(jià)值［2］。沙棗花味甘、澀，性溫，止咳平喘。沙棗花蜜可供氣虛畏寒、脾胃虛寒的病人食用。沙棗花精油可用于化妝品行業(yè)［3］，也可作為原輔料添加在加工食品中，如沙棗花茶、沙棗花調(diào)味酒等。不同花期沙棗花的化學(xué)成分含量分布有所不同，并會(huì)影響沙棗花的品質(zhì)，因此研究沙棗花花期中的化學(xué)成分變化對(duì)于產(chǎn)品原料的保障具有實(shí)際價(jià)值。

目前，國內(nèi)外已針對(duì)沙棗花的化學(xué)成分開展了研究，如王雅等［4］對(duì)沙棗花開花周期中精油的含量和質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估，發(fā)現(xiàn)沙棗花精油在不同開花周期中具有規(guī)律性，精油含量在開花率為80%時(shí)達(dá)到峰值。喬海軍等［3］對(duì)沙棗花的揮發(fā)油進(jìn)行了氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）分析，分離出64 個(gè)組分并鑒定了54個(gè)組分，其中含量最高的化合物為反式肉桂酸乙酯。丁嘉文等［5］通過水蒸氣蒸餾法、固相微萃取法、頂空采集法、氣囊采集法4 種方法對(duì)沙棗花中的揮發(fā)性成分進(jìn)行提取，采用GC-MS 進(jìn)行成分鑒定，發(fā)現(xiàn)4種方法均可提取出反式肉桂酸乙酯和鄰苯二甲酸二乙酯。Torbati等［6］應(yīng)用GC-MS和氣相色譜-火焰離子化檢測器（GC-FID）聯(lián)用技術(shù)，對(duì)沙棗花中提取的揮發(fā)油進(jìn)行化學(xué)成分分析，最終鑒定出53個(gè)成分，占精油總含量的96.59%。

當(dāng)前針對(duì)沙棗花中化學(xué)成分的研究多集中于揮發(fā)性成分，側(cè)重于利用GC-MS開展沙棗花精油的相關(guān)研究，而有關(guān)沙棗花的超高效液相色譜-串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF MS）分析研究鮮有報(bào)道。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)作為代謝組學(xué)研究的主要平臺(tái)［7-8］，能夠?qū)崿F(xiàn)沙棗花中難揮發(fā)性化合物更準(zhǔn)確且穩(wěn)定的檢測。但當(dāng)前高分辨質(zhì)譜信息的解析存在多種難題，如化合物提取困難、化合物鑒定錯(cuò)誤和難以篩選差異性化合物等。為解決這一問題，本課題組提出了超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜（UPLC-HRMS）數(shù)據(jù)自動(dòng)化分析處理軟件AntDAS［9-10］，根據(jù)化合物離子分布特點(diǎn)，采用離子密度聚類方法實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)中提取離子色譜（EIC）峰的構(gòu)建。隨后采用動(dòng)態(tài)窗口拓展結(jié)合儀器噪聲自動(dòng)估計(jì)策略實(shí)現(xiàn)EIC峰的提取，并標(biāo)記精確m/z值。待樣本中所有EIC峰提取后，根據(jù)EIC峰的高精度m/z值進(jìn)行注釋，識(shí)別［M+H］+、［M+Na］+、［M-H2O+H］+等。AntDAS在多樣本分析時(shí)能夠根據(jù)色譜峰保留時(shí)間進(jìn)行注冊(cè)，支持統(tǒng)計(jì)分析如方差分析（ANOVA）、化學(xué)計(jì)量學(xué)方法如主成分分析（PCA）、偏最小二乘判別分析（PLS-DA）、層次聚類分析（HCA）等，并對(duì)篩選的差異性化合物進(jìn)行鑒別，可為不同花期沙棗花中化學(xué)成分的變化研究提供新的分析工具。

本研究以寧夏地區(qū)不同花期沙棗花為研究對(duì)象，通過液質(zhì)聯(lián)用與非靶向代謝組學(xué)技術(shù)結(jié)合課題組發(fā)展的AntDAS平臺(tái)對(duì)不同花期沙棗花中的差異性代謝物進(jìn)行分析，并采用主成分分析和層次聚類分析對(duì)不同花期的沙棗花樣本進(jìn)行了判別分析，以期為供應(yīng)品質(zhì)穩(wěn)定的沙棗花工業(yè)原料提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

ACQUITY UPLC I-Class PLUS超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Triple TOF 5600+質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX 公司）；ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm × 100 mm，1.7 μm，美國Waters 公司）；氮?dú)獍l(fā)生儀（英國PEAK 公司）；真空泵（德國Leybold公司）；KQ-250B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；渦旋儀（杭州旌斐儀器科技有限公司）；離心機(jī)、-40 ℃冰箱（賽默飛世爾科技（中國）有限公司）；電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；真空冷凍干燥機(jī)（上海葉拓科技有限公司）；高速萬能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）。

甲醇、乙腈、異丙醇（色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司）；甲酸（德國Merck 公司）；蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）；對(duì)照品：苯丙氨酸、谷氨酰胺、L-蛋氨酸、L-賴氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸、L-組氨酸購自美國Sigma 公司，N-甲基-L-脯氨酸、對(duì)羥基肉桂酸、水仙苷、反式阿魏酸、苦豆堿購自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 樣品采集

沙棗花樣本采集于寧夏回族自治區(qū)銀川市興慶區(qū)小雁湖旁（北緯38°24'40″，東經(jīng)106°16'24″）。采摘時(shí)間為2021 年5 月16 日至6 月2 日，平均間隔4 ～5 d 采集1 次，包括初花期G1（少量花開放至全樹25%花瓣開放）、盛花始期G2（全樹70%～80%花瓣開放）、盛花期G3（100%花瓣開放）以及盛花末期G4（花瓣蔫萎脫落）的樣本。每個(gè)花期采集8 個(gè)平行樣本，共采集32 個(gè)沙棗花樣本。樣本采摘后進(jìn)行液氮速凍，轉(zhuǎn)移至-40 ℃冰箱冷凍保存，直至樣本分析。

1.3 沙棗花中化合物的提取

將沙棗花樣本置于真空冷凍干燥機(jī)中凍干24 h 后取出粉碎。稱取沙棗花樣品20 mg 于2 mL 離心管中，加入1.5 mL 70%甲醇-水提取溶劑，渦旋2 min，超聲提取30 min，13000 r/min 下離心15 min后，取上清液裝入色譜瓶待分析。

質(zhì)控（QC）樣本由所有沙棗花凍干粉末等量混勻制得，其化合物提取與上述步驟相同。

1.4 UPLC-Q-TOF MS儀器條件

液相色譜條件：進(jìn)樣量：3μL；流速：0.2 mL/min；柱溫：35 ℃；流動(dòng)相A 為0.1%甲酸-水，B為0.1%甲酸-乙腈。梯度洗脫程序：0 ～1 min，95% ～85% A；1 ～7 min，85% ～80% A；7 ～13 min，80% ～75% A；13 ～19 min，75% ～65% A；19 ～27 min，65% ～42% A；27 ～32 min，42% ～25% A；32 ～35 min，25%～15% A；35 ～36 min，15%～0%A；36 ～39 min，0% A；39 ～40 min，0%～95% A。后運(yùn)行5 min。

質(zhì)譜條件：使用數(shù)據(jù)采集軟件（Analyst TF 1.8 Software）設(shè)置在信息依賴采集（IDA）模式下采集樣品的高分辨質(zhì)譜信息。離子源采用電噴霧電離源（ESI），正離子模式下采集，霧化氣（GS1）：344750 Pa（50 psi）；輔助加熱氣（GS2）：344750 Pa（50 psi）；氣簾氣（CUR）：117215 Pa（17 psi）；離子源溫度：500 ℃；霧化電壓（ISVF）：5500 V；去簇電壓（DP）：80 V。

正離子模式下設(shè)置一級(jí)質(zhì)譜質(zhì)量掃描范圍為100 ～1000 Da，碰撞能量（CE）為10 eV，一級(jí)采集頻率（Accumulation time）為0.2 s。IDA模式下自動(dòng)選取離子采集二級(jí)質(zhì)譜信息，二級(jí)質(zhì)譜質(zhì)量掃描范圍為50 ～1000 Da，碰撞能量擴(kuò)展（CES）：15 eV，質(zhì)量允差（Mass tolerance）為100 mDa，采集頻率為0.03 s，每個(gè)循環(huán)監(jiān)測的候選離子最多選擇5個(gè)母離子掃描二級(jí)質(zhì)譜信息，動(dòng)態(tài)排除時(shí)間為5 s。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析由課題組研發(fā)的AntDAS數(shù)據(jù)處理軟件完成。該軟件能直接對(duì)儀器采集的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，包括自動(dòng)實(shí)現(xiàn)EIC峰構(gòu)建、EIC峰提取、峰注釋、樣本時(shí)間漂移校正、峰注冊(cè)和峰填充等，可獲得樣本×EIC 峰的化合物信息列表。基于該列表進(jìn)行化學(xué)計(jì)量學(xué)分析，如方差分析、層次聚類分析和主成分分析，最終將篩查出的化合物質(zhì)譜譜圖與第三方數(shù)據(jù)庫（http：//prime.psc.riken.jp/compms/msdial/main.htmL）進(jìn)行匹配鑒定。

2 結(jié)果與討論

2.1 AntDAS實(shí)現(xiàn)沙棗花中化合物信息的提取

AntDAS 能 夠 直 接 讀 取UPLC-HRMS 的原始數(shù)據(jù)，圖1為沙棗花QC樣本的總離子流色譜（TIC）圖，由圖可見TIC峰在整個(gè)流出段內(nèi)基本得到良好分離。利用AntDAS 能夠自動(dòng)實(shí)現(xiàn)儀器采集的原始數(shù)據(jù)分析，圖2A給出了AntDAS 中m/z133.1012 Da 下色譜峰的提取結(jié)果，共提出17 個(gè)EIC 峰，多數(shù)EIC 峰實(shí)現(xiàn)了基線分離。圖2B 和圖2C 給出了峰提取結(jié)果的局部放大圖，表明即使借助于高分辨質(zhì)譜技術(shù)，仍存在部分化合物信號(hào)重疊的情況。針對(duì)化合物的重疊信號(hào)，AntDAS能夠?qū)崿F(xiàn)較為合理的分割。從圖2C可以看出，AntDAS能夠從儀器背景噪聲中準(zhǔn)確識(shí)別化合物的EIC峰，并準(zhǔn)確估計(jì)化合物的流出范圍。利用AntDAS 對(duì)39 個(gè)樣本進(jìn)行分析，最終得到19478×39 的化合物信息列表，其中19478為EIC峰數(shù)量，39為樣本數(shù)量（包括32個(gè)不同花期的沙棗花樣本與7個(gè)QC樣本）。

圖1 沙棗花QC樣本的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of QC sample of Elaeagnus angustifolia L. flowers

圖2 AntDAS進(jìn)行EIC峰提?。ˋ）及其細(xì)節(jié)圖示例（B、C）Fig.2 EIC peak extraction with AntDAS（A）and its detail diagram（B，C）

對(duì)樣本中7 個(gè)QC 樣本進(jìn)行評(píng)估，計(jì)算各EIC 峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果如圖3 所示。由圖可知，RSD ≤20% 的色譜峰數(shù)量為11267 個(gè)，占總峰數(shù)量的57.8%。RSD ≤30%的色譜峰數(shù)量為12998個(gè)，占總峰數(shù)量的66.7%。即使在RSD ≤10%的水平下，峰數(shù)量仍達(dá)到總峰數(shù)量的33.1%，說明該方法在批量進(jìn)樣過程中穩(wěn)定，所采集的數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠，可以進(jìn)行后續(xù)研究。

圖3 基于QC樣本的色譜峰面積RSD分布圖Fig.3 RSD distribution map of chromatographic peak area based on QC samples

2.2 不同花期沙棗花樣本分析

利用ANOVA 對(duì)注冊(cè)的化合物EIC 峰進(jìn)行分析，在P值為0.01 置信水平下，篩選出13664 個(gè)在不同組別間存在差異的EIC 峰。隨后基于差異性EIC 峰進(jìn)行PCA 和HCA 分析，結(jié)果如圖4A 和圖4B 所示。PCA 分析結(jié)果表明，前兩個(gè)主成分解釋了樣本中約60%的信息（圖4A）。樣本在前兩個(gè)主成分上的分布清晰地顯示出不同花期的沙棗花樣本分別聚成一類。不同花期的樣本在前兩個(gè)主成分上的分布距離存在明顯不同，沿第一主成分軸逐步變化，體現(xiàn)了不同花期沙棗花中的化合物不斷變化。從PCA 圖中還可看出QC 樣本位于前兩個(gè)主成分軸的原點(diǎn)，表明樣本混合均勻。且QC 樣本聚集較為緊密，表明本方法的精密度較好。HCA 分析表明，不同花期的沙棗花樣本聚為4類（圖4B）。其中初花期和盛花始期較為接近，而盛花期和盛花末期較為接近，與PCA分析結(jié)果相一致。

圖4 不同花期沙棗花樣本的PCA（A）和HCA（B）分析結(jié)果Fig.4 PCA（A）and HCA（B）analysis results of flower samples of Elaeagnus angustifolia L. in different flowering stagesG1：initial bloom stage（初花期）；G2：pre-full bloom stage（盛花始期）；G3：full bloom stage（盛花期）；G4：ending of the bloom stage（盛花末期）

2.3 化合物鑒定

AntDAS能夠自動(dòng)根據(jù)EIC峰的峰形和MS/MS結(jié)果將同一化合物的峰劃分到一起，同時(shí)整合多樣本的信息構(gòu)建化合物離子源內(nèi)裂解形成的MS 及MS/MS 譜圖，用于化合物的識(shí)別。以槲皮素-3，4'-二-Oβ-葡萄糖苷為例，圖5展示了基于AntDAS 的化合物識(shí)別流程。圖5A 為AntDAS 構(gòu)建的化合物MS 譜圖，由化合物源內(nèi)裂解形成的碎片離子構(gòu)成。圖5B 為對(duì)應(yīng)各碎片離子的EIC 圖，流出曲線的形狀高度一致。圖5C為m/z627.15的MS/MS譜圖，該離子斷裂后主要形成m/z465.1125和303.0489的碎片離子，與圖5A中MS的離子一致，表明AntDAS能夠從復(fù)雜數(shù)據(jù)中準(zhǔn)確構(gòu)建化合物的MS和MS/MS譜圖。圖5D為化合物最終的鑒定結(jié)果，該物質(zhì)的MS 和MS/MS 譜圖匹配較好。利用AntDAS 構(gòu)建的MS 和MS/MS 譜圖對(duì)化合物進(jìn)行識(shí)別，最終鑒定出沙棗花中19 個(gè)化合物（見表1）。同時(shí)對(duì)鑒定的化合物進(jìn)行對(duì)照品驗(yàn)證，最終能明確12個(gè)化合物。

表1 利用AntDAS構(gòu)建的MS和MS/MS化合物識(shí)別結(jié)果Table 1 The results of compound identified through MS and MS/MS constructed by AntDAS

圖5 AntDAS的化合物鑒定過程示例Fig.5 An example of the compound identification process by AntDASA：MS spectrum of compound constructed by AntDAS；B：EICs corresponding to each fragment ions；C：MS/MS spectrum of m/z 627.15；D：final result of compound identification

圖6 給出了19 個(gè)化合物的熱圖分析結(jié)果。由圖可知，不同花期沙棗花中化合物的含量分布有明顯差異，初花期中氨來呫諾、對(duì)羥基肉桂酸、苯丙氨酸、4-羥基肉桂醛的含量相對(duì)較高。盛花始期中，氨來呫諾、5-羥基色胺、谷氨酰胺、山奈酚-3-O-葡萄糖苷-6″-p-香豆酰、L-蛋氨酸、L-酪氨酸6 個(gè)化合物的含量較高。盛花期中，N-甲基-L-脯氨酸、水仙苷、反式阿魏酸、5-羥基色胺、谷氨酰胺、L-蛋氨酸、L-酪氨酸、L-組氨酸、L-賴氨酸、L-色氨酸等化合物的含量相對(duì)較高。盛花末期中，槲皮素-3，4'-二-O-β-葡萄糖苷、5-羥基色胺、矮牽牛素-3-O-β-葡萄糖苷、L-蛋氨酸、L-酪氨酸、L-組氨酸、L-賴氨酸、L-色氨酸、香橙素9個(gè)化合物的含量較高。

圖6 AntDAS鑒定出的沙棗花中化合物的熱圖分析結(jié)果Fig.6 The heatmap analysis results of compounds in Elaeagnus angustifolia L. flowers identified by AntDAS compound numbers were the same as those in Table 1

熱圖分析結(jié)果顯示，沙棗花中多數(shù)氨基酸在盛花期和盛花末期中含量較高?，F(xiàn)有研究表明，氨基酸與植物進(jìn)行光合作用、抗病蟲害、調(diào)節(jié)植物生長有關(guān)。同時(shí)氨基酸還可作為衡量植物品質(zhì)的重要指標(biāo)［11］，其組成和含量影響植物的化學(xué)成分，例如茶葉中的氨基酸調(diào)控其香氣和滋味［12］，煙草中的氨基酸對(duì)其香氣有重要貢獻(xiàn)，影響卷煙品質(zhì)［13］，由此推測沙棗花的特殊香味也與其種類豐富的氨基酸有關(guān)。此外，沙棗花中鑒定出以下化合物，如香橙素具有清除氧自由基、抗病毒等作用［14］；反式阿魏酸具有抗炎、止痛、抗血栓、抗自由基和調(diào)節(jié)免疫功能等作用；苦豆堿具有抗腫瘤、抗蟲和抗炎等作用；水仙苷具有抗炎和殺蟲等作用［15］，其在盛花期的沙棗花中含量相對(duì)較高。而初花期和盛花始期的沙棗花中氨來呫諾含量相對(duì)較高，該化合物已在臨床上用于治療哮喘、過敏性鼻炎和復(fù)發(fā)性口腔潰瘍［16］，這與沙棗花的功能主治相似，提示用于止咳平喘的沙棗花應(yīng)在花期相對(duì)靠前的時(shí)間采集。

以上分析表明，基于本課題組自主開發(fā)的AntDAS 結(jié)合UPLC-Q-TOF MS 技術(shù)能實(shí)現(xiàn)不同花期沙棗花中差異性化合物的篩查和鑒定，可用于沙棗花開花期間的化合物含量變化研究。本研究不僅對(duì)沙棗花的品質(zhì)穩(wěn)定性評(píng)估以及后期開發(fā)應(yīng)用提供了理論支撐，同時(shí)為復(fù)雜植物中化學(xué)成分分析提供了新的技術(shù)手段。

3 結(jié)論

本文提出了將AntDAS與UPLC-Q-TOF MS非靶向代謝組學(xué)技術(shù)相結(jié)合的策略用于研究不同花期沙棗花中差異性代謝物的變化。借助該策略篩選出19個(gè)化合物，其中12個(gè)化合物經(jīng)對(duì)照品驗(yàn)證一致，多數(shù)氨基酸在沙棗花的盛花期和盛花末期中含量更高，槲皮素-3，4'-二-O-β-葡萄糖苷、香橙素等黃酮類化合物在盛花末期中含量更高，在其它生長時(shí)期含量偏低。本研究不僅為不同花期沙棗花的化學(xué)成分分析以及開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)，同時(shí)表明AntDAS可為其他植物體系不同采收時(shí)期樣本的評(píng)估提供新的手段。