基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討五苓散防治高脂血癥的作用機(jī)制*

羅雪霞, 王思敏, 陳紫航, 楊艷紅，雷自立

(1.廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院(臨床醫(yī)學(xué)院)，廣州 廣東 510080；2.廣東藥科大學(xué)中醫(yī)藥研究院)

高脂血癥(Hyperlipidemia)屬于代謝綜合征之一[1]。我國(guó)成人血脂異常發(fā)病率為34.0 %，男性發(fā)病率41.9 %，女性發(fā)病率32.5 %[2]。高脂血癥與冠心病、腦中風(fēng)、高血壓等心腦血管疾病高病死率的形成過(guò)程密切相關(guān)[3]，已成為一個(gè)亟須解決的社會(huì)公共衛(wèi)生問(wèn)題。他汀類、貝丁酸類、煙酸類、樹脂類是目前臨床上應(yīng)用較多的治療高脂血癥的藥物[4], 其中最普遍應(yīng)用的他汀類藥物有可能引起肌肉毒性、糖尿病高發(fā)風(fēng)險(xiǎn)、肝酶異常以及出血性腦卒中等不良反應(yīng)[5]。中藥因具有辨證施治、多靶點(diǎn)起效、不良反應(yīng)少等特點(diǎn)，在高脂血癥的防治中具有天然優(yōu)勢(shì)。因此，進(jìn)一步挖掘高脂血癥發(fā)生的病理機(jī)制，尋找多靶點(diǎn)、高效、低毒的防治高脂血癥藥物具有重要意義。

五苓散出自“醫(yī)圣”張仲景所著的《傷寒雜病論》，由豬苓、茯苓、澤瀉、白術(shù)和桂枝五味藥組成，在臨床可用于防治高脂血癥[6-9]。

由于中藥復(fù)方具有多成分、多靶點(diǎn)等特點(diǎn)，導(dǎo)致了在研究其作用機(jī)制時(shí)存在困難[10]。而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)，通過(guò)檢索網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)、利用多種信息化分析工具來(lái)構(gòu)建生物、基因之間關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖的一門新興學(xué)科[11]。中醫(yī)研究的整體觀、辨證論治與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的整體性和系統(tǒng)性是一致的，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在中醫(yī)研究中的應(yīng)用已成為一種趨勢(shì)[12]。近年來(lái)，眾多學(xué)者采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)復(fù)方中藥治療高脂血癥、糖尿病以及高血壓等多種疾病進(jìn)行了研究[13-15]。本研究使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)，預(yù)測(cè)五苓散防治高脂血癥活性成分、作用靶點(diǎn)及作用機(jī)制，以期為五苓散防治高脂血癥提供新的思路。

1 資料與方法

1.1高脂血癥靶點(diǎn)信息收集 在Drugbank 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://go.drugbank.com/)和DisGeNET數(shù) 據(jù) 庫(kù) (https://www.disgenet.org/) 檢索與高脂血癥相關(guān)的靶點(diǎn)基因，并且將靶點(diǎn)基因?qū)險(xiǎn)niprot數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/) 進(jìn)行基因標(biāo)準(zhǔn)化后歸納整理。

1.2相關(guān)中藥成分收集 基于藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，分別以“豬苓”、“茯苓”、“白術(shù)”、“澤瀉”、“桂枝”為關(guān)鍵詞在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)數(shù)據(jù)庫(kù)( TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php) 按照口服生物利用度(OB)≥ 30 %，類藥性(DL)≥0.14條件篩選有關(guān)中藥的有效成分[16]。

1.3相關(guān)中藥成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 將收集到的各個(gè)中藥的有效成分導(dǎo)入PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)或ALOGPS 2.1 (http://www.vcclab.org/web/alogps/)，查詢各成分的SMILE結(jié)構(gòu)，通過(guò) SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.swisstargetprediction.ch/) 收集有效成分的作用靶點(diǎn)，并導(dǎo)入U(xiǎn)niprot數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因標(biāo)準(zhǔn)化。

1.4五苓散防治高脂血癥靶點(diǎn)收集 將五苓散靶點(diǎn)和高脂血癥靶點(diǎn)導(dǎo)入 Excel 表格，通過(guò)查找重復(fù)值找出共同靶點(diǎn)，即為五苓散防治高脂血癥的可能靶點(diǎn)。將五苓散治療高脂血癥的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建交集靶點(diǎn)間相互作用關(guān)系PPI圖。將PPI圖導(dǎo)入Cytoscape 3.2.1進(jìn)行可視化與網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，并根?jù)自由度對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行篩選。自由度(degree)表示網(wǎng)絡(luò)中與該節(jié)點(diǎn)直接相互作用的節(jié)點(diǎn)的數(shù)目，degree值越高，則該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的作用越重要。

1.5分子對(duì)接驗(yàn)證 在ZINC數(shù)據(jù)庫(kù)(http://zinc.docking.org/)中查詢“1.3”項(xiàng)篩選獲得的五苓散防治高脂血癥有效成分，在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.rcsb.org/)中查詢并下載“1.4”項(xiàng)篩選獲得的五苓散防治高脂血癥靶點(diǎn)的3D結(jié)構(gòu)，使用AutoDockTools對(duì)靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行加氫等預(yù)處理。運(yùn)行AutoDockTools對(duì)有效成分和靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行對(duì)接，以最低結(jié)合能作為分子對(duì)接的結(jié)果，結(jié)合能<0提示有效成分與靶點(diǎn)蛋白能發(fā)生自發(fā)結(jié)合，結(jié)合能≤5提示有較強(qiáng)的結(jié)合能力[17]。

1.6生物學(xué)功能和通路分析 將五苓散與高脂血癥的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp) ，選擇物種智人(Homo sapiens)，進(jìn)行GO(Gene Ontology)分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia Of Genes and Genome)分析。利用ImageGP 工具(http://www.ehbio.com/ImageGP/index.php/Home/Index/) 繪制五苓散防治高脂血癥的相關(guān)分析圖或通路圖。

2 結(jié)果

2.1高脂血癥靶點(diǎn)信息收集和篩選 利用Drugbank 數(shù)據(jù)庫(kù)和DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)檢索與高脂血癥有關(guān)的靶點(diǎn)基因，分別得到24個(gè)、472個(gè)高脂血癥靶點(diǎn)，并且導(dǎo)入U(xiǎn)niprot數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因標(biāo)準(zhǔn)化后歸納整理，得到452個(gè)高脂血癥的潛在靶點(diǎn)。

2.2相關(guān)中藥成分收集和篩選 在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)收集豬苓、茯苓、白術(shù)、澤瀉、桂枝化學(xué)成分，其中豬苓有31種、茯苓有34種、白術(shù)有55種、澤瀉有46種、桂枝有220種?；贠B≥30 %、DL≥0.14條件篩選中藥有效成分，得到豬苓11個(gè)、茯苓15個(gè)、白術(shù)10個(gè)、澤瀉12個(gè)、桂枝10個(gè)有效成分(表1)，總共得到54個(gè)五苓散有效成分，其中包含4個(gè)共有成分，茯苓與豬苓共有成分為cerevisterol和stellasterol，桂枝與澤瀉共有成分為3-epi-beta-sitosterol，桂枝與豬苓共有成分為peroxyergosterol。

2.3相關(guān)中藥成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 將收集到各個(gè)中藥的有效成分導(dǎo)入PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)或ALOGPS 2.1查詢各成分的SMILE結(jié)構(gòu)，通過(guò)SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)收集有效成分的作用靶點(diǎn)，并且導(dǎo)入U(xiǎn)niprot數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因標(biāo)準(zhǔn)化，得到552個(gè)五苓散的有效成分的作用靶點(diǎn)。將五苓散54個(gè)有效成分的作用靶點(diǎn)分別與452個(gè)高脂血癥疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入 Excel 表格，通過(guò)查找重復(fù)值找出共同靶點(diǎn)，其中47個(gè)五苓散有效成分的作用靶點(diǎn)與高脂血癥靶點(diǎn)有交集，即五苓散47個(gè)有效成分與防治高脂血癥有關(guān)，其中4個(gè)共同成分均與防治高脂血癥靶點(diǎn)相關(guān)。

2.4五苓散防治高脂血癥靶點(diǎn)收集 將452個(gè)高脂血癥疾病靶點(diǎn)與552個(gè)五苓散有效成分作用靶點(diǎn)繪制韋恩圖，即五苓散治療高脂血癥的交集靶點(diǎn)(圖1)，由此可篩選得到五苓散治療高脂血癥的潛在靶點(diǎn)84個(gè)。

表1 五苓散有效成分

將五苓散治療高脂血癥的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建交集靶點(diǎn)間相互作用關(guān)系PPI圖(圖2)，有84個(gè)節(jié)點(diǎn)和652條邊，平均節(jié)點(diǎn)度為15.5，平均局部聚類系數(shù)為0.531。將PPI圖導(dǎo)入Cytoscape 3.2.1進(jìn)行處理，以節(jié)點(diǎn)的大小和顏色的深淺反映degree值的大小。節(jié)點(diǎn)越大、顏色越深，對(duì)應(yīng)的degree值越大，則該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的地位越重要。經(jīng)計(jì)算得網(wǎng)絡(luò)平均degree值為15.71，以大于平均degree值的2倍為條件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行二次篩選[18]，最終獲得8個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，分別為AKT1、IL-6、TNF、MAPK1、IL1B、PTGS2、PPARG和EGFR。

圖1 五苓散治療高脂血癥的靶點(diǎn)韋恩圖

圖2 五苓散和高脂血癥共同靶點(diǎn)間相互

2.5分子對(duì)接驗(yàn)證 將“2.4”項(xiàng)篩選得到的8個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)與五苓散防治高脂血癥靶點(diǎn)數(shù)量排名前3的有效成分進(jìn)行分子對(duì)接，得到分子對(duì)接的最低結(jié)合能(表2)，選擇3種有效成分中結(jié)合能較低的靶蛋白作分子對(duì)接模式圖(圖3)。除了PTGS2蛋白，其余每1個(gè)靶點(diǎn)蛋白至少可與1種有效成分較好結(jié)合，3種有效成分均能與大部分關(guān)鍵靶點(diǎn)自發(fā)結(jié)合。結(jié)果表明，五苓散的有效成分可以對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)發(fā)揮調(diào)控作用。

表2 五苓散防治高脂血癥關(guān)鍵靶點(diǎn)與五苓散有效成分的分子對(duì)接結(jié)果

圖3 五苓散防治高脂血癥靶蛋白與五苓散有效成分的分子對(duì)接模式

2.6生物學(xué)功能和通路分析

2.6.1GO分析 將五苓散有效成分和高脂血癥的84個(gè)共同靶點(diǎn)導(dǎo)入 DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇物種智人(Homo sapiens)，得到GO分析295個(gè)生物學(xué)過(guò)程、34個(gè)細(xì)胞組分、79個(gè)分子功能。根據(jù)P值篩選前20個(gè)生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能，利用ImageGP工具繪制“五苓散防治高脂血癥中的生物學(xué)過(guò)程(GO-BP)分析”(圖4) ，“五苓散防治高脂血癥涉及的細(xì)胞組分(GO-CC)分析” (圖5)，“五苓散防治高脂血癥涉及的分子功能(GO-MF)分析”(圖6)。

圖4 五苓散防治高脂血癥中的生物學(xué)過(guò)程(GO-BP)分析

圖5 五苓散防治高脂血癥涉及的細(xì)胞組分(GO-CC)分析

圖6 五苓散防治高脂血癥涉及的分子功能(GO-MF)分析

2.6.2KEGG分析 將五苓散有效成分和高脂血癥的84個(gè)共同靶點(diǎn)導(dǎo)入 DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇物種智人(Homo sapiens)，得到102條KEGG通路。根據(jù)P值篩選前20條通路，利用ImageGP工具繪制“五苓散防治高脂血癥通路(KEGG)”(圖7)。進(jìn)一步通過(guò)DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)分析了VEGF信號(hào)通路圖(圖8)和AMPK信號(hào)通路圖(圖9)。

圖7 五苓散防治高脂血癥通路(KEGG)

圖8 VEGF信號(hào)通路

圖9 AMPK信號(hào)通路

3 討論

本研究通過(guò)兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)收集得到高脂血癥的452個(gè)靶點(diǎn)，提示高脂血癥的發(fā)生可能由多個(gè)靶點(diǎn)共同導(dǎo)致。通過(guò)篩選，收集到五苓散54個(gè)有效成分，其中47個(gè)有效成分與防治高脂血癥靶點(diǎn)有關(guān)，4個(gè)共同成分均與防治高脂血癥相關(guān)。五苓散有效成分與高脂血癥之間存在84個(gè)共同靶點(diǎn)，Trametenolic acid、Eburicoic acid、Oleic acid等可能為五苓散防治高脂血癥的主要成分，AKT1、IL-6、TNF、MAPK1、IL-1B、PTGS2、PPARG和EGFR等可能為五苓散防治高脂血癥的主要靶點(diǎn)。研究表明，從茯苓提取的Dehydro-trametenolic acid 可以激活PPARG，誘導(dǎo)脂肪轉(zhuǎn)化并充當(dāng)胰島素增敏劑[19]。Eburicoic acid可以增強(qiáng)骨骼肌中p-AMPK和p-AKT的水平以及增加肝臟p-FOXO1的表達(dá)水平，產(chǎn)生降糖作用；并且，Eburicoic acid增加了PPARG的肝臟表達(dá)水平，增強(qiáng)脂肪酸氧化，產(chǎn)生降血脂作用[20]。GO功能富集分析結(jié)果表明，五苓散防治高脂血癥主要涉及一氧化氮生物合成過(guò)程的正調(diào)控、脂質(zhì)代謝過(guò)程以及類固醇激素介導(dǎo)的信號(hào)通路等295個(gè)生物學(xué)過(guò)程；膜筏、胞質(zhì)溶膠、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜等34個(gè)細(xì)胞組分；類固醇激素受體活性、酶結(jié)合、磷脂酰肌醇3-激酶活性等79個(gè)分子功能。KEGG通路富集分析結(jié)果表明，五苓散防治高脂血癥通路有102條，包括VEGF信號(hào)通路與AMPK信號(hào)通路等，這些通路互相密切相關(guān)，由許多共同基因協(xié)調(diào)調(diào)控，為五苓散防治高脂血癥提供了新思路。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)家族包括VEGF-A/B/C/D和胎盤生長(zhǎng)因子；其受體VEGFR-1/2/3是一種受體酪氨酸激酶，主要分布于內(nèi)皮細(xì)胞、骨髓來(lái)源細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞膜[21]。阜新顆?？赏ㄟ^(guò)TGF-β1/Smad和VEGF/VEGFR2信號(hào)通路顯著改善小鼠的高血糖和高脂血癥[22]。重組 VEGF-B 蛋白抑制小鼠高脂飲食誘導(dǎo)的體重增加，并減少肥胖相關(guān)的高脂血癥和脂肪肝[23]。淋巴管生成和 VEGF-D 的喪失導(dǎo)致小鼠嚴(yán)重的高脂血癥和乳糜微粒殘留的清除延遲[24]。因此，五苓散可能通過(guò)調(diào)節(jié)VEGF信號(hào)通路影響血脂水平，從而起到防治高脂血癥的作用。

腺苷酸活化蛋白激酶 (AMPK) 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，被稱為“人類細(xì)胞能量的監(jiān)視器”[25]?？ǜ窳袃敉ㄟ^(guò) AMPK 增加肝臟和腸道中 ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，增加膽汁和糞便膽固醇的排泄，改善高脂血癥[26]。小檗堿抑制腸道和肝臟中的線粒體復(fù)合物I，抑制脂質(zhì)代謝，從而治療肥胖和脂肪肝[27]。白楊素可通過(guò)調(diào)節(jié) HepG2 細(xì)胞和小鼠體內(nèi)的 AMPK/PI3K/AKT 信號(hào)通路來(lái)改善糖脂代謝紊亂[28]。因此，五苓散可能通過(guò)調(diào)節(jié)AMPK信號(hào)通路影響脂質(zhì)平衡和穩(wěn)態(tài)代謝微環(huán)境，如脂肪分解和分化，從而降低高脂血癥。

綜上所述，五苓散防治高脂血癥具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路特點(diǎn)，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析平臺(tái)對(duì)五苓散的有效成分靶點(diǎn)、高脂血癥靶點(diǎn)以及五苓散防治高脂血癥通路進(jìn)行預(yù)測(cè)，對(duì)五苓散防治高脂血癥的機(jī)制研究具有重要意義。