滋陰補(bǔ)腎序貫法對肥胖型多囊卵巢綜合征大鼠血清性腺相關(guān)激素及胰島素抵抗指數(shù)的影響*

林 偉，梅陽陽，劉 軼，朱宏陽，魏 霖

(1.福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院護(hù)理學(xué)院，福建 福州 350101；2.福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院病理科)

多囊卵巢綜合征(PCOS)是育齡期女性常見的內(nèi)分泌代謝紊亂性疾病，主要臨床表現(xiàn)為高雄激素血癥(HA)、高胰島素血癥(HI)及肥胖等，而肥胖體征在PCOS患者中占34.1% ～ 43.3%[1]，這不僅影響女性生育，還可增加糖尿病、心血管疾病及癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。PCOS具有病情周期長、難以治愈等特點(diǎn)，嚴(yán)重影響患者的身心健康。中醫(yī)藥治療PCOS具有療效高、改善代謝異常、不良反應(yīng)小等特點(diǎn)[2]。滋陰補(bǔ)腎序貫法在臨床治療PCOS過程中，可有效改善其臨床癥狀，但對肥胖型PCOS患者的治療效果如何，報(bào)道甚少。因此，本研究建立肥胖型PCOS大鼠模型，通過滋陰補(bǔ)腎序貫法干預(yù)，觀察大鼠血清性腺相關(guān)激素及胰島素抵抗的變化，為臨床患者用藥指導(dǎo)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼料 清潔級(jí)SD雌性大鼠56只，21日齡，體重(73.48±7.82)g，由福建閩侯潤怡實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(閩)2016-0002。高糖高脂飼料，由福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2主要儀器及設(shè)備 冷凍離心機(jī)(heal force公司，型號(hào)neofuge 13R)；酶標(biāo)檢測儀(Rayto公司，型號(hào)Rt2100c)；血糖儀及試紙(湖南三諾生物傳感股份有限公司，型號(hào)GA-3型)。

1.3主要試劑及藥品 脫氫表雄酮(DHEA，南京康滿林生物醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)2017020)；注射大豆油(武漢拉那白醫(yī)藥化工有限公司，批號(hào)20180102)；鏈脲佐菌素(Streptozotocin， STZ，源葉生物有限公司，貨號(hào)：18883-66-4)；ELISA試劑盒(上海潤裕生物科技有限公司，睪酮、黃體生成素、卵泡刺激素、胰島素及總膽固醇貨號(hào)分別為RY-EN30387、RY-EN30447、RY-EN34438、RY-EN30973、RY-E31082)；中藥方劑中，滋陰方：女貞子、旱墨蓮、熟地黃、山茱萸、白芍、菟絲子、當(dāng)歸；補(bǔ)腎方：川斷、巴戟天、黨參、淫羊藿、補(bǔ)骨脂；合方：即由滋陰和補(bǔ)腎方組成。上述藥方由福建省人民醫(yī)院提供。將上述藥方混勻后，分別用冷水浸泡30 min，武火煎煮30 min，改文火煎煮30 min，過濾；重復(fù)煎煮第2次，將2次過濾湯藥混勻，水浴濃縮至湯藥濃度為含生藥4.45 g/L，冷卻后4 ℃保存。給藥劑量按人鼠體重比劑量換算[3]。

1.4動(dòng)物建模 21日齡SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3日，隨機(jī)分為空白對照組(CN組，8只)和PCOS組48只。根據(jù)前期研究結(jié)果[4]建立PCOS大鼠模型，即PCOS組給予高糖高脂飲食，并且每只大鼠每日頸后背注射6 mg DHEA/100 g體質(zhì)量+0.2 mL注射用大豆油，連續(xù)20 d，禁食12 h，予腹腔注射120 mg/kg STZ 檸檬酸鈉溶液 0.1 mL/10 g 一次，繼續(xù)高糖高脂飼料喂養(yǎng)14 d。同時(shí)陰道涂片觀察各組大鼠動(dòng)情周期變化，以確定PCOS模型是否創(chuàng)建成功。

1.5建模后分組及給藥 PCOS組建模成功后，將其隨機(jī)分為安慰劑組(AW=12只)和藥物治療組(滋陰組，ZY組=12只；補(bǔ)腎組，BS組=12只；序貫組，XG組=12只)，常規(guī)飼料喂養(yǎng)，并按照人鼠體重比計(jì)算每日每組灌胃給藥劑量，即每日灌服5mL生藥，連續(xù)20 d。其中AW組、ZY組和BS組則每日分別灌服生理鹽水、滋陰方和補(bǔ)腎方湯藥，連續(xù)20 d；XG組，先滋陰方灌胃2 d，后合方灌胃2 d，如此交替重復(fù)20 d。此外，應(yīng)剔除因灌胃死亡例數(shù)(AW組，2只；XG組，2只)。

1.6血清性腺相關(guān)激素及胰島素相關(guān)指標(biāo)測定 干預(yù)結(jié)束后，于干預(yù)末日20:00開始禁食，次日晨8:00稱體重，測空腹血糖(FBG)。腹腔注射10%水合氯醛麻醉，抽取腹主動(dòng)脈血2 mL。離心血液標(biāo)本，提取血清，用ELISA法測定血清睪酮(T)、黃體生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)、空腹胰島素(FINS)及總膽固醇(TC)濃度，按照試劑盒說明操作。計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)，HOMA-IR= FBG×FINS/22.5，用來評估胰島素抵抗情況。

2 結(jié)果

2.1動(dòng)情周期變化 大鼠在動(dòng)情前期，陰道涂片中有大量有核上皮細(xì)胞；在動(dòng)情期，陰道涂片中可見大量無核角化上皮細(xì)胞；在動(dòng)情后期，陰道涂片中可見大量白細(xì)胞浸潤；在動(dòng)情間期，陰道涂片中則可見少量角化上皮、白細(xì)胞和有核上皮細(xì)胞。通過觀察大鼠陰道涂片的變化可以判斷各組大鼠的動(dòng)情周期。受試大鼠陰道涂片結(jié)果顯示，CN組動(dòng)情周期穩(wěn)定(4～5 d)；48只PCOS組大鼠連續(xù)14 d陰道脫落上皮細(xì)胞呈角化狀態(tài)，動(dòng)情期延長，延長5～10 d。

2.2各組大鼠間體重和血總膽固醇水平的變化 AW組和藥物治療組大鼠體重均高于CN組(P<0.05)；AW組、ZY組和XG組大鼠血清TC高于CN組(P<0.05)；AW組和藥物治療組之間大鼠體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.488，0.870，0.742)；AW組和藥物治療組之間大鼠血清TC差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.070，0.549，0.747)。見表1。

2.3各組間大鼠血清性腺相關(guān)激素的變化 AW組血清T較CN組顯著升高(P<0.01)，XG組血清T較AW組、ZY組和BS組顯著降低(P<0.01)，ZY組和BS組較AW組有所降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.990，0.977)。各組間LH差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.572)。與CN組相比，AW組血清FSH顯著降低(P<0.01)； XG組血清FSH較AW組和ZY組顯著升高(P<0.01)，且比BS組高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.948)。AW組LH/FSH值較CN組顯著升高(P<0.01)，BS組和XG組LH/FSH值較AW組顯著降低(P<0.01)，且XG組LH/FSH值較ZY組和BS組顯著降低(P<0.01)。見表2。

表1 各組大鼠間體重和血TC比較

表2 各組大鼠間血清T、LH、FSH及LH/FSH水平比較

2.4各組間大鼠胰島素抵抗指數(shù)的變化 各組間FBG差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.932)。AW組FINS較CN組顯著升高(P<0.01)；ZY組、BS組和XG組FINS較AW組顯著降低(P<0.01)，且XG組較ZY組和BS組顯著降低(P<0.01)。AW組HOMA-IR較CN組顯著升高(P<0.01)；ZY組、BS組和XG組HOMA-IR較AW組顯著降低(P<0.01)；ZY組、BS組和XG組之間HOMA-IR差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.079，0.060)，但XG組比ZY組和BS組低。見表3。

表3 各組間大鼠胰島素抵抗指標(biāo)水平比較

3 討論

PCOS病因及發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，主要會(huì)導(dǎo)致育齡期女性無排卵性不孕。有研究[5-6]發(fā)現(xiàn)PCOS患者體內(nèi)脂肪堆積、胰島素抵抗與體內(nèi)雄激素水平升高，導(dǎo)致卵泡發(fā)育異常，與形成卵巢多囊改變有關(guān)，且不管肥胖與否，PCOS患者均會(huì)出現(xiàn)不同程度的胰島素抵抗[7]。中醫(yī)認(rèn)為腎虛是PCOS患病的根本[8]，并且通過滋陰補(bǔ)腎序貫法已在臨床治療PCOS取得一定的療效，但對肥胖型PCOS患者的血清性腺相關(guān)激素及胰島素代謝情況的變化如何，尚未完全清楚。

本研究通過給SD雌性大鼠注射DHEA創(chuàng)建PCOS大鼠模型，陰道涂片結(jié)果顯示失去規(guī)律動(dòng)情周期，且血清雄激素水平高于CN組，提示造模成功；同時(shí)持續(xù)高糖高脂飲食，結(jié)果顯示PCOS組大鼠體重和TC、FINS高于CN組，提示PCOS組大鼠出現(xiàn)高胰島素血癥，且AW組HOMA-IR指數(shù)顯著高CN組，提示存在胰島素抵抗，可用于本實(shí)驗(yàn)及后續(xù)的研究。

有報(bào)道[9]顯示44 %～77 % PCOS患者存在高胰島素血癥或胰島素抵抗。高胰島素血癥可通過多種途徑使黃體生成素增加，促進(jìn)腎上腺和卵巢分泌雄激素，而高雄激素血癥和高胰島素血癥又可抑制肝臟中性激素結(jié)合球蛋白合成而導(dǎo)致血液中睪酮升高，影響卵泡發(fā)育和抑制排卵[10]。但本研究結(jié)果顯示各組間黃體生成素差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，AW組卵泡刺激素顯著低于CN組，且AW組LH/FSH值顯著高于CN組，這是否與卵巢局部過高雄激素而增強(qiáng)卵泡刺激素的芳香化酶活性，增加卵巢顆粒細(xì)胞中卵泡刺激素合成，從而抑制卵泡發(fā)育有關(guān)，其機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

高胰島素血癥可增加患者的食欲，升高血脂水平。研究[11-13]發(fā)現(xiàn)PCOS患者中體重越高，發(fā)生胰島素抵抗和高雄激素血癥的概率越高，且高胰島素血癥可引起高雄激素血癥，高雄激素血癥亦可導(dǎo)致高胰島素血癥，形成惡性循環(huán)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示AW組大鼠體重和TC水平顯著高于CN組； AW組FBG高于CN組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；AW組FINS和HOMA-IR值顯著高于CN組，這與馮蘭青等[14]研究結(jié)果相似。Bergman等[15]研究發(fā)現(xiàn)胰島素抵抗可影響糖原合成，使胰島素清除率下降，進(jìn)而出現(xiàn)肥胖，以及胰島素抵抗類PCOS的高胰島素血癥。這是否由于胰島素抵抗，使機(jī)體血糖水平維持正常水平，而使胰島細(xì)胞分泌過高的胰島素來降低血糖有關(guān)，進(jìn)而出現(xiàn)高胰島素血癥，具體機(jī)制尚待進(jìn)一步明確。

任青玲教授[16]在基于養(yǎng)心腎調(diào)整月經(jīng)周期，運(yùn)用滋陰補(bǔ)腎序貫法治療胰島素抵抗型PCOS患者取得一定的療效。本研究滋陰補(bǔ)腎序貫法干預(yù)后， XG組FINS顯著低于AW組、ZY組和BS組，且XG組FBG低于ZY組和BS組； XG組HOMA-IR指數(shù)均顯著低于AW組，且XG組HOMA-IR指數(shù)低于ZY組和BS組，說明滋陰補(bǔ)腎序貫法可以降低血清高胰島素水平，改善PCOS大鼠胰島素抵抗情況。這與任青玲教授[16]的臨床治療效果一致。而且本研究結(jié)果也顯示，XG組大鼠血清T顯著低于AW組、ZY組和BS組，XG組大鼠血清FSH顯著高于AW組、ZY組和BS組，XG組大鼠LH/FSH值顯著低于AW組、ZY組和BS組，說明滋陰補(bǔ)腎序貫法可以有效降低PCOS大鼠血清睪酮、升高血清卵泡刺激素水平，調(diào)節(jié)黃體生成素和卵泡刺激素的比值，而降低血清雄激素。本研究結(jié)果說明滋陰補(bǔ)腎序貫法可以通過降低PCOS大鼠高胰島素水平，改善胰島素抵抗情況，而降低PCOS大鼠高雄激素血癥，且XG組治療優(yōu)于ZY組和BS組，但是具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

任青玲教授[16]運(yùn)用滋陰補(bǔ)腎序貫法治療臨床PCOS患者后，患者體質(zhì)量和體質(zhì)指數(shù)明顯下降。但是本研究結(jié)果顯示，滋陰補(bǔ)腎序貫干預(yù)后，XG組PCOS大鼠的體重較AW組有所下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且血清TC水平仍高于CN組。這說明通過單純服藥無法改善肥胖型PCOS大鼠體重和總膽固醇，在臨床治療中還需要結(jié)合飲食、體育鍛煉和行為干預(yù)，以期達(dá)到最佳的治療。

綜上所述，滋陰補(bǔ)腎序貫法能有效降低肥胖型PCOS大鼠血清睪酮和空腹胰島素水平、升高卵泡刺激素水平，使 LH/FSH水平降低，提示滋陰補(bǔ)腎序貫法可通過改善胰島素抵抗和LH/FSH比值，而降低PCOS大鼠高雄激素水平，為臨床用藥指導(dǎo)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。