黃芪總黃酮對血管性癡呆模型大鼠學習記憶損傷的干預作用*

陳 攻，江增宏

(合肥職業(yè)技術學院，安徽 合肥 230012)

血管性癡呆(Vascular dementia, VD)是因多種腦血管疾病所致腦組織損傷引起，以學習認知功能障礙為主的臨床綜合征，是僅次于阿爾茨海默病(Alzeimer's disease, AD)的常見癡呆原因，約占癡呆的20%[1]。隨著年齡的增長和中風存活率的提高，VD發(fā)病率不斷升高；據統計，60歲以上的腦卒中幸存者中，25%～41%將會在3個月內發(fā)展為VD[2-3]。目前仍缺乏有效的干預VD的藥物和手段。

黃芪是豆科黃耆屬植物，據中國藥典記載，黃芪具有生津養(yǎng)血、斂瘡生肌、補氣升陽等功效?，F代醫(yī)學研究表明黃芪具有免疫調節(jié)和抗炎作用、抗氧化、抗腫瘤、預防心腦血管疾病等功效。黃芪總黃酮(total flavonoids of Astragalus, TFA)是從黃芪干燥根中提取的有效成分。一系列研究表明，TFA具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗突變、抗動脈粥樣硬化等生物學效應[4-5]。另有研究表明TFA通過抗凋亡、減輕炎癥反應、抑制氧化應激反應保護腦缺血再灌注損傷[6]。因TFA對血管性癡呆大鼠的學習記憶損傷作用未見明確報道, 因此, 本研究就TFA對血管性癡呆模型大鼠學習記憶損傷的作用和機制進行了研究。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑 TFA(批號：DST160804-093)由上海源業(yè)生物科技有限公司(中國上海)提供, 臨用前用生理鹽水(NS)溶解至所需濃度?？筊OCK2單克隆抗體、Tau Ser262磷酸化單克隆抗體、內參β-actin抗體購于Biosourse公司。大鼠神經特異性烯醇化酶(NSE)酶聯免疫分析試劑盒購于南京建成生物工程研究所有限公司。國產或進口分析純均購自于上海生工公司。

1.2動物 SD大鼠，雌雄各半，購于安徽省實驗動物中心，合格證號: SCXK 2005001。

1.3方法

1.3.1建立大鼠血管性癡呆模型[7]70只野生型SD大鼠分成6組，每組12只。實驗分組如下：模型組、生理鹽水對照組、假手術組、TFA治療組(25，50，100 mg/kg)。于模型建立當日開始給予相關藥物灌胃(每日給藥一次)，連續(xù)給藥15 d。血管性癡呆模型的建立：大鼠給予5%異氟烷吸入麻醉，固定，頸部切開，分離雙側頸總動脈，頸總動脈下方穿2根浸有生理鹽水的4號絲線，進行雙重結扎并剪斷血管保證血液斷流?？p合頸部切口，術后肌肉注射青霉素3 d。

1.3.2神經功能評分 腦缺血后第30天，根據改良的Garcia評分系統評估神經系統評分[8]，0-3分：自發(fā)活動；1-3分：側撫摸反應；1-3分：觸碰振動反應；0-3分：肢體對稱性；0-3分：前肢伸展；0-3分：攀爬；0-4分：橫木行走能力。以上7個子測驗的總分用于評價神經功能。低分表示神經功能較差，高分表示功能較好。

1.3.3Morris水迷宮試驗(Morris Water Maze Test, MWM) 神經功能評分測試結束后，MWM檢測實驗大鼠的學習記憶功能。(1)定位航行試驗：MWM包括一個圓形水池(直徑150 cm，高度60 cm)和一個平臺。水池內注入清水至水深21 cm，水溫控制在22～24 ℃，圓形水池劃分為4個象限(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ)。第1天，將大鼠放入池內游泳60 s，并剔除游泳能力差的大鼠。第2天，在第Ⅲ象限放置平臺，低于水面約1 cm處，將大鼠分別從4個象限的入水點(從Ⅰ～Ⅳ的順序)面向池壁放入水中，觀察并記錄大鼠爬上平臺的時間，即逃避潛伏期。如果大鼠在60 s內爬上平臺并停留3 s，視為尋臺成功。如果在60 s內，大鼠不能找到平臺，則將其引至平臺并停留15 s以熟悉環(huán)境，該逃避潛伏期按60 s記，按順序進行下一個象限測試。連續(xù)訓練4 d，每天4次，每次間隔30 s。大鼠在迷宮中的運動通過連接到計算機的視頻跟蹤系統進行監(jiān)控。(2)空間探索觀察小鼠的學習能力觀察小鼠的空間記憶能力：定位航行試驗的第5 天撤去平臺，將大鼠從第Ⅰ象限入水點處面向池壁放入水中自由游泳，分別記錄大鼠在60 s內穿過原平臺所在象限的次數、原平臺所在象限游程比率和時間比率(即大鼠在原平臺所在象限的游程、時間分別占總游程、總時間的比率)。以此來評價動物的空間記憶能力。MWM試驗結束，麻醉處死大鼠，取腦組織、取血，收集血清。

1.3.4血清NSE活力檢測 MWM試驗結束，麻醉處死大鼠，收集血清，轉移至96孔板里，按照NSE酶聯免疫分析試劑盒(南京建成)說明書，分光光度法檢測血清NSE活性。

1.3.5Western blot 將腦組織勻漿，加入細胞裂解液，離心取上清。制作聚丙烯酰胺凝膠，用微量移液槍將蛋白樣品或Marker加入凝膠孔內，恒壓電泳。裁剪合適大小的PVDF膜，用無水甲醇浸泡，同樣裁剪適合大小的濾紙，用轉移液浸泡。根據marker指示條帶小心切下待測目的蛋白及內參β-肌動蛋白(β-actin)凝膠，與濾紙一同浸泡在轉移液中，按照2張濾紙、膠、膜、兩張濾紙的順序疊放好，各層之間重復接觸，不能有氣泡，濾紙和膜的大小相同，用夾子固定好后放入轉移槽中，合上電極，接通電源，200 mA恒流轉膜3 h。轉膜結束后，取出PVDF 膜，放入封閉液中，室溫封閉 1～2 h，封閉結束后TBST洗一遍；分別加入抗ROCK2抗體(1∶1000)或者抗pTau抗體(1∶1000)，4 ℃搖床孵育過夜；用TBST洗3次后，加入相應的辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗鼠IgG(1:5000)，室溫孵育2 h；TBST洗膜3次，每次10 min，將顯影液A和B按1∶1比例混合涂于膜上，用凝膠圖像處理系統分析目標條帶的光密度值。

2 結果

2.1TFA對實驗性血管性癡呆大鼠的學習記憶損傷的作用

2.1.1Morris水迷宮試驗結果 血管性癡呆大鼠造模的第30天，Morris水迷宮試驗檢測各組大鼠的學習記憶功能改變。訓練第1天，各組大鼠尋臺潛伏期相似，無顯著性差異(P>0.05)。訓練第2天，雖然潛伏期減少，但各組之間仍無顯著差異(P>0.05)。訓練第3～4 天，模型組與假手術的潛伏期出現顯著差異(P<0.01)；與模型組相比，TFA(50，100 mg/kg)治療組大鼠的尋臺潛伏期明顯縮短(P<0.05或0.01)，但是25 mg/kg TFA對大鼠尋臺潛伏期的影響不明顯(P>0.05)，表明(50，100 mg/kg)TFA對血管性癡呆大鼠的學習損傷有明顯保護作用。見圖1。

圖1 TFA對血管性癡呆大鼠學習記憶功能的影響

2.1.2空間探索實驗結果 訓練第5 天進行空間探索實驗。模型組大鼠的穿過原平臺象限次數，時間及游程比率與假手術組相比均明顯減少(P<0.01)；與模型組相比，TFA(50，100 mg/kg)組大鼠穿過原平臺象限次數，時間及游程比率明顯增多(P<0.01)，進一步表明黃芪總黃酮對血管性癡呆大鼠的記憶損傷有保護作用。見表1。

表1 TFA對血管癡呆模型大鼠空間探索能力的影響

2.2TFA對大鼠神經功能評分和血清NSE活性的影響 腦缺血30 d后，模型組與假手術組比較神經功能評分明顯降低(P<0.01)；給予50，100 mg/kg TFA治療可明顯提高大鼠神經功能評分(P<0.01)。與假手術組相比，模型組大鼠血清中NSE活性明顯增高(P<0.01)，提示腦缺血后神經損傷；與模型組比較，TFA50，100 mg/kg治療組大鼠血清中NSE活性明顯降低(P<0.01)，進一步提示TFA具有神經保護作用。見圖2。

圖2 TFA對大鼠神經功能評分(A)和血清NSE活力(B)的影響

2.3TFA對大鼠腦組織中ROCK2表達和Tau Ser262磷酸化的影響 Western blot檢測海馬CA1區(qū)的腦組織中ROCK2表達和Tau Ser262位點磷酸化改變：模型組ROCK2表達和Tau Ser262位點磷酸化與假手術組比較明顯增高(P<0.01)；與模型組比較，TFA(25，50，100 mg/kg)可以明顯下調ROCK2表達和Tau Ser262位點磷酸化(P<0.01)。見圖3。

圖3 TFA對大鼠海馬CA1腦組織內ROCK2表達和Tau Ser262磷酸化的影響

3 討論

VD是由腦組織低灌注或腦血管疾病引起腦功能障礙而導致的嚴重認知功能衰退綜合征。隨著研究的深入，VD被證實是可預防、可治療的癡呆。但目前仍缺乏有效干預藥物[9]。因此，VD研究的首要任務是探索神經保護策略，并為臨床應用尋找新的藥物。

中草藥被認為是具有多靶點、多層次、多環(huán)節(jié)作用的特點，具有廣闊的應用前景[10]。幾千年來，人們發(fā)現中藥被用于治療各種疾病[11]。前期研究發(fā)現，一些植物源性天然活性成分具有抗蛛網膜下腔出血后腦損傷作用[12]。TFA是從黃芪干燥根中提取的有效部位，前期研究發(fā)現TFA通過調節(jié)巨噬細胞中細胞因子和介質腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細胞介素(IL)-1β、IL-6、一氧化氮(NO)的產生，具有顯著的免疫調節(jié)和抗炎作用[13]。本研究運用雙側頸總動脈結扎構建大鼠血管性癡呆模型，觀察TFA對VD大鼠的學習記憶損傷影響，發(fā)現50和100 mg/kg TFA可逆轉VD大鼠的學習記憶障礙。

tau是微管相關蛋白(microtubule associated protein, MAP)之一[14]，存在于胞質和軸突中。tau蛋白促進微管形成和維持微管結構，維持軸突的營養(yǎng)物質和代謝產物的運輸，為軸突延伸生長創(chuàng)造條件[15]。過度磷酸化修飾的tau與微管結合能力會明顯降低，影響微管的穩(wěn)定性，其中Ser262、Ser356 過度磷酸化直接影響 tau 蛋白與微管結合，最終使微管解聚[16]。從微管上脫落下來的過度磷酸化tau蛋白彼此相互聚集成雙螺旋細絲形成神經纖維纏結(neurofibrillar tangles, NFTs)，損害神經元的形態(tài)和功能。本研究運用Western blot檢測VD模型大鼠海馬CA1區(qū)的腦組織內tau蛋白Ser262磷酸化改變，發(fā)現模型組tau Ser262磷酸化(pTau)明顯上調(與假手術組比，P<0.01)，而黃芪總黃酮(50，100 mg/kg)可以明顯下調pTau。

tau蛋白磷酸化水平受蛋白激酶的磷酸化作用和蛋白磷酸酯酶(protein phosphatases, PPs)的去磷酸化作用共同調節(jié)。Rho相關卷曲螺旋激酶(Rho associated coiled coil-forming kinase, ROCK)是細胞內廣泛存在的Ser/Thr蛋白激酶，包括ROCK1和ROCK2亞型。ROCK的功能改變在中風的病理過程中發(fā)揮重要的作用，局灶性(大鼠)腦缺血模型可見缺血腦組織ROCK表達呈2倍以上的增加，而給予非選擇性ROCK抑制劑處理，腦缺血急性期損傷明顯減輕，并且能促進缺血損傷后神經功能的恢復[17-19]。雖然ROCK在各種組織細胞內均有表達，但是在腦組織中ROCK2表達更為豐富，siRNA干擾ROCK2的表達，可以明顯減輕軸突的退化，促進軸突再生[20]。局灶性腦缺血模型實驗動物的學習和記憶損傷與ROCK2表達上調有關[21-22]。由此可見，ROCK2可作為中樞損傷及退行性神經系統疾病研究的主要靶點[23]。本研究運用Western blot法檢測海馬CA1區(qū)的腦組織內ROCK2表達，并發(fā)現TFA(50，100 mg/kg)可逆轉VD大鼠海馬組織中ROCK2表達增高，提示TFA抗血管性癡呆大鼠學習記憶損傷與下調ROCK2表達有關。

綜上所述，黃芪總黃酮可明顯改善血管性癡呆大鼠的學習記憶損傷，其機制可能與抑制ROCK2表達和下調tau磷酸化有關。