2 種阿魏植物種質(zhì)鑒別與幼苗生長比較

邵聰慧，賴曉輝

（伊犁師范大學(xué)生物與地理科學(xué)學(xué)院，新疆伊寧 835000）

阿魏是傘形科阿魏屬（Ferula L.）植物的總稱，有150 多種，以地中海、非洲北部、中亞及西伯利亞地區(qū)分布較廣[1]。我國大約有26 種和1 變種[2]，主要分布在江蘇、云南、山西和西藏等地，新疆有20 余種[3]，在北疆地區(qū)如塔城、烏恰、托里、伊寧、阜康等地種群分布較多[1]。該屬有多種藥用植物，在新疆民間使用得非常廣泛。如：最早記錄在唐代《新修本草》中的新疆阿魏（Ferula sinkiangensis K.M.Shen）和阜康阿魏（Ferula fukanensis K.M.Shen），通常把它們的根和樹脂當(dāng)作藥物使用，研究表明，它們的根和樹脂具有鎮(zhèn)痛、解暑、抗炎、抗生育等多種藥理作用[4-5]。

基于野生藥用阿魏植物長年遭受濫砍濫伐，植物資源面臨匱乏枯竭，人們已開始進(jìn)行小面積種植阿魏藥材。民間藥用阿魏種植尚未規(guī)模化，阿魏市場魚龍混雜，沒有可靠種質(zhì)來源，因此，種植前期和早期明確種質(zhì)尤為重要。

大多數(shù)植物主要依靠傳統(tǒng)的形態(tài)和生理特性進(jìn)行物種鑒定。當(dāng)種質(zhì)形態(tài)差異較小時(shí)，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法比較困難。阿魏屬植物是多年生一次性開花草本植物，屬內(nèi)多個(gè)種間外部形態(tài)非常相似，通常只能看到植株基生葉，僅根據(jù)葉片形態(tài)特征進(jìn)行鑒定難度較大。然而，DNA 條形碼技術(shù)是基于物種的，不受形態(tài)特征的限制，具有識別效率高、操作簡單、易于在各個(gè)學(xué)科中應(yīng)用的新型技術(shù)手段[6]。DNA 條形碼技術(shù)是一種新的物種鑒定技術(shù)，它是一種分子診斷技術(shù)，通過在基因組中使用一個(gè)相對較短且被廣泛認(rèn)可的擴(kuò)增的DNA片段來鑒定物種。近年來已成為生物分類鑒定的研究熱點(diǎn)[7-8]。

許多實(shí)驗(yàn)證明了DNA 條形碼ITS2 序列能夠很好地鑒別蕓香科、黃岑屬、重樓屬等很多科屬植物，在許多科屬中，ITS2 序列的鑒定效率高達(dá)100%[9-11]。已有實(shí)驗(yàn)利用ITS2 序列對阿魏屬植物進(jìn)行種質(zhì)鑒定及親緣關(guān)系分析[13]。

本實(shí)驗(yàn)以2 種阿魏種子為材料，使用ITS 序列進(jìn)行2 種形態(tài)結(jié)構(gòu)相似的阿魏屬植物種子分類鑒定的基礎(chǔ)上，再進(jìn)行幼苗生長特性研究，鑒別比較2 個(gè)阿魏屬植物不同種間的差異。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

本實(shí)驗(yàn)所用2 種阿魏種子采購于伊寧縣農(nóng)場，低溫冷藏保存。實(shí)驗(yàn)主要儀器有：高壓蒸氣滅菌鍋（BOXUN）、JY 電泳儀（JY600C）、凝膠成像系統(tǒng)儀（S/NA011011-004）、臺式高速冷凍離心機(jī)（5430R）、PCR 儀（C1000Touch）、超低溫儲存冰箱（MDF-U3286S）等。

1.2 試劑

高效植物基因組DNA 提取試劑盒（天根DP350-02）、瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒（天根DP209-02）、PCR 試劑（大連寶）、瓊脂糖、核酸染料EB、2000 DNA Marker。實(shí)驗(yàn)所用引物合成及測序均由北京華大基因公司完成。ITS2 序列擴(kuò)增的通用引物[10]，正向引物ITS2F：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′，反向引物ITS3R：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′。

1.3 基因組總DNA 提取

采用高效植物基因組DNA 提取試劑盒（DP350-02）法，分別提取2 種阿魏種子中基因組總DNA，并對提取物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。按照試劑盒步驟進(jìn)行提取，操作步驟如下：

①材料預(yù)處理：將種子用蒸餾水沖洗干凈，并用濾紙吸干水分，稱取0.2g 放置于滅菌的研缽中，加入液氮充分碾磨成細(xì)粉狀。

②將粉末分裝至1.5mL 的離心管中，加入400μL的FGA 緩沖液和6μL 的RNaseA（10mg/mL），反復(fù)顛倒混勻1min，室溫下放置10min。

③向離心管中加入130μL 的LP2 緩沖液，上下顛倒離心管充分混勻1min。

④12000rpm 高速離心5min，用移液槍吸取上清液至一個(gè)新的離心管中。

⑤在含有上清液的新離心管中加入2/3 體積的LP3 緩沖液（使用之前按瓶上標(biāo)簽的要求加入相應(yīng)量的無水乙醇），立即顛倒離心管充分混勻15s，可能會有絮狀沉淀出現(xiàn)。

⑥將上一步所得溶液和絮狀沉淀全部吸入到一個(gè)吸附柱中（吸附柱放入收集管中），然后12000rpm 高速離心30s，將收集管中的廢液倒掉，吸附柱重新放回到收集管中。

⑦在上一步的吸附柱中加入600μL 的PW 漂洗液（使用之前按瓶上標(biāo)簽的要求加入相應(yīng)量的無水乙醇），然后12000rpm 高速離心30s，將收集管中的廢液倒掉，吸附柱重新放回到收集管中。此過程重復(fù)操作2次。

⑧12000rpm 高速離心2min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放在室溫條件下約20min，徹底晾干殘余的漂洗液。

⑨將上一步的吸附柱放至一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加150μL 的TB 洗脫緩沖液，放置室溫條件下2min，然后12000rpm 高速離心2min。

⑩重復(fù)上一步操作。將所得的離心液收集到一個(gè)新的離心管中，并保存于-20℃冰箱，防止DNA 降解。

1.4 PCR 擴(kuò)增

以種子基因組總DNA 為模板，以ITS2 通用引物為擴(kuò)增引物進(jìn)行ITS2 序列擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系為25μL，即：10μM 正、反向引物各1μL，10mM dNTP 1.5μL，25mM MgCl21.5μL，10×Buffer 2μL，DNA 模板3μL，Taq DNA 聚合酶0.2μL，加入ddH2O 補(bǔ)足至25μL。PCR 反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min、94℃變性30s、退火溫度56℃持續(xù)30s、72℃延伸45s、30 個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min，最后4℃保存。

1.5 擴(kuò)增產(chǎn)物回收

擴(kuò)增成功的產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測，切掉多余的膠塊，采用瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒（DP209-02）法對所獲得的目的膠塊進(jìn)行回收，操作步驟如下：

①平衡吸附柱：向吸附柱CA2 中（吸附柱放入收集管中）加入500μL 的BL 平衡液，12000rpm 離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

②稱量并記錄：將目的膠塊放入1 個(gè)干凈的離心管中，稱量目的膠塊的質(zhì)量并記錄下來。

③溶解膠塊：向目的膠塊中加入相同體積的PN溶膠液（若目的膠塊質(zhì)量為0.1g，就加入100μL 的PN溶膠液），放于水浴鍋內(nèi)，溫度提前調(diào)至50℃。水浴期間上下不斷顛倒混勻，至膠塊完全溶解。

④將上一步所得溶液溫度降到室溫再加入到吸附柱（吸附柱放入收集管中），室溫條件下放置2min，然后12000rpm 高速離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回到收集管中。

⑤向上一步吸附柱中加入600μL 的PW 漂洗液（使用前按瓶上標(biāo)簽的要求加入相應(yīng)量的無水乙醇），然后12000rpm 高速離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回到收集管中。此過程重復(fù)操作2 次。

⑥12000rpm 高速離心1min，將吸附柱在室溫條件下放置約20min，徹底晾干殘余的漂洗液。

⑦將吸附柱放到一個(gè)新的離心管中，向吸附膜中間部位懸空滴加50μL 的EB 洗脫緩沖液，室溫條件下放置2min。

⑧12000rpm 高速離心2min，收集所得溶液。

⑨將離心所得的溶液重新吸入離心吸附柱中，室溫條件下放置2min 再12000rpm 高速離心2min，收集離心液，即DNA 溶液，轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管，并保存于-20℃冰箱。

將回收后的產(chǎn)物送往北京華大基因公司進(jìn)行序列測定。為保證測序的準(zhǔn)確性，采用正反雙向測通。對于低質(zhì)量的測序結(jié)果進(jìn)行重新擴(kuò)增測序。將待測樣本ITS 序列提交至NCBI 網(wǎng)站中的GenBank 核酸數(shù)據(jù)庫，采用分析相似性搜索法（BLASTn），并查找與待測樣相似度最高的序列。

1.6 大田播種

選取新疆阿魏生境地附近農(nóng)田作為實(shí)驗(yàn)田，前期整好地。將2 種阿魏種子浸水24h 后，置于4℃冰箱低溫層積處理50d，選取種子胚根突破種皮者于3 月下旬進(jìn)行穴播，播種深度2～3cm，株距為50cm，行距50cm，幼苗生長期間適當(dāng)進(jìn)行除草。待種子萌發(fā)生長50d 后統(tǒng)計(jì)2 種阿魏幼苗株高及真葉數(shù)，使用SPSS 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用兩獨(dú)立樣本T 檢驗(yàn)方法進(jìn)行樣本間差異比較，顯著性水平為0.05，使用Graphpad 軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子總DNA 及擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測

種子總DNA 用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測：條帶清晰無雜質(zhì)（如圖1 所示），可用于后續(xù)PCR 實(shí)驗(yàn)。

圖1 阿魏種子總DNA 瓊脂糖凝膠電泳

ITS2 擴(kuò)增產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶清晰明亮，無雜質(zhì)（如圖2所示），可用于切膠回收，回收產(chǎn)物再經(jīng)電泳檢測合格，送樣測序。

圖2 擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

2.2 擴(kuò)增產(chǎn)物回收檢測

吸取2μL 切膠回收產(chǎn)物，與1μL 的6×Lodding Buffer 反復(fù)吹打混勻，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶清晰明亮，無雜質(zhì)（如圖3 所示）。回收后的產(chǎn)物可用于后續(xù)測序。

圖3 切膠回收產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

2.3 ITS2 序列的同源性分析

對成功測序的2 條ITS2 擴(kuò)增序列進(jìn)行在線BLAST 比對。結(jié)果顯示，1 號樣品ITS2 序列分別與GenBank 數(shù)據(jù)庫中新疆阿魏（Ferula sinkiangensis K.M.Shen）登錄號為JX667752.1 序列同源性最高，為99.9%，2 號樣品ITS2 序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫中山地阿魏（Ferula akitschkensis B.Fedtsch.ex K.-Pol.）登錄號為KP406810.1 序列同源性最高，為99.9%（如圖4 所示）。由此推測，2 種阿魏分別是新疆阿魏（Ferula sinkiangensis K.M.Shen）和山地阿魏（Ferula akitschkensis B.Fedtsch.ex K.-Pol.）

圖4 ITS2 擴(kuò)增序列進(jìn)行在線BLAST 比對

2.4 2 種阿魏幼苗生長情況比較

對新疆阿魏和山地阿魏50d 幼苗進(jìn)行株高測量與真葉數(shù)統(tǒng)計(jì)（如表1 所示）。2 種阿魏幼苗株高均服從正態(tài)分布，如表2 所示，且方差齊，進(jìn)行獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，P＜0.05，2 種阿魏50d 幼苗株高存在顯著差異（如表3）。新疆阿魏幼苗平均株高為7.9451±2.0cm，山地阿魏平均株高為6.1313±2.0cm，新疆阿魏幼苗植株顯著高于山地阿魏（如圖4）。

表1 株高及真葉數(shù)統(tǒng)計(jì)描述

表2 株高數(shù)據(jù)正態(tài)性檢驗(yàn)

表3 2 種阿魏幼苗株高獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)

2 種阿魏50d 幼苗的真葉數(shù)：新疆阿魏平均真葉數(shù)2.69 枚，山地阿魏平均2.48 枚。對2種阿魏50d 幼苗真葉數(shù)進(jìn)行獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，P＞0.05，不存在顯著差異，說明幼苗期2 種阿魏幼苗真葉生長情況差異較小，無法進(jìn)行區(qū)分，不能作為幼苗期種質(zhì)鑒定指標(biāo)。

圖5 2 種阿魏50d 幼苗株高比較

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)是以2 種阿魏的種子為材料，利用分子生物學(xué)的手段，獲得種子基因組DNA，利用ITS2 部分序列，進(jìn)行BLAST 比對，分別匹配出與2 種阿魏ITS 序列同源性最高的2 個(gè)種，最終確定2 種阿魏種子為新疆阿魏和山地阿魏。同時(shí)，比較2 種阿魏幼苗期生長情況，再次證明本次2 個(gè)待測樣品種子為阿魏屬不同種。本實(shí)驗(yàn)為藥用植物阿魏人工栽培前種質(zhì)鑒定提供基礎(chǔ)，避免藥材種植過程中種質(zhì)魚龍混雜，降低藥材品質(zhì)。但在實(shí)驗(yàn)過程中，提取的阿魏種子DNA 質(zhì)量不是很高，可能是種子細(xì)胞較難破碎，也可能是種子內(nèi)種皮、胚或胚乳當(dāng)中的次生代謝物較多，影響DNA 高質(zhì)量提取。因此，阿魏種子DNA 提取方法有待進(jìn)一步優(yōu)化。同時(shí)，阿魏屬植物幼苗期更多種質(zhì)鑒定指標(biāo)有待后續(xù)試驗(yàn)探索。近年來，植物的傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定和通過DNA 條形碼進(jìn)行植物種、屬鑒定之間存在很多分歧，需要在進(jìn)行物種分類鑒定時(shí)多方面綜合研究。結(jié)合傳統(tǒng)鑒別方法和現(xiàn)代分子生物學(xué)手段，在植物種子鑒定方面使分類鑒定結(jié)果更加準(zhǔn)確。