不同細(xì)胞分裂素對鵝毛玉鳳花無菌苗一步成苗的影響

邵 麗

（上海辰山植物園城市園藝技術(shù)研發(fā)與推廣中心，上海松江 201602）

鵝毛玉鳳花[Habenaria dentate (Sw.)Schltr.]是蘭科玉鳳花屬地生草本植物，別名雙腎參、雙腎子、天鵝抱蛋、對對參等，為國家二級重點保護野生植物，生于海拔630～1500m 的山坡林下，花期在8-10 月，在中國主要分布于安徽、浙江、江西、福建、臺灣、湖北、湖南、廣東、廣西、四川、貴州、云南、西藏[1]。鵝毛玉鳳花是珍貴的藥用植物，其塊莖可入藥，具有補肺腎、利尿等功能，主治腎虛腰痛、病后體虛、腎虛陽痿、疝氣痛、胃痛、肺結(jié)核咳嗽、睪丸炎及尿路感染等[2]。鵝毛玉鳳花野外資源稀缺，過度采挖、破壞生境可能是其野生種群逐漸減少的原因。該植物有較高的經(jīng)濟價值，但生長緩慢、繁殖困難，通過自然方式繁殖系數(shù)極低，長期以來，民間均依靠采挖野生資源作為藥用，只挖不栽，造成了資源的枯竭。而目前有關(guān)鵝毛玉鳳花組培快繁的相關(guān)研究和報道都較少，陳婭婭等[3]在藥用植物鵝毛玉鳳花胚培養(yǎng)的研究中已探討過其無菌播種的影響因子，萌發(fā)率可達82%。

本研究針對不同細(xì)胞分裂素6-BA（6-芐氨基腺嘌呤）、TDZ（噻苯?。┖蚄T（激動素）對鵝毛玉鳳花種子無菌播種以及萌發(fā)后原球莖分化成苗的影響[4]，篩選出種子萌發(fā)后一步成苗的最佳培養(yǎng)基，為大規(guī)模人工快速繁殖建立基礎(chǔ)，也為該物種的種群回歸、恢復(fù)以及藥用經(jīng)濟價值的開發(fā)研究提供參考和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取無病蟲害的健康鵝毛玉鳳花植株，在開花后1～3d 內(nèi)花粉活性較強時進行人工授粉。自交授粉1～2周后，若柱頭膨大、花瓣下垂內(nèi)卷，則授粉成功。鵝毛玉鳳花種子成熟時間較短，2 個月后種子成熟，即可采收果實并播種。若采下后不能及時播種，可將種子干燥保存于4℃冷藏室中，但儲存時間不宜過久，最好在10 d內(nèi)播種。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子消毒滅菌。將鵝毛玉鳳花蒴果用少許洗潔精輕輕搓洗后，在水流下沖洗30min，在無菌工作臺上用75%酒精浸泡30s，然后用0.1%升汞溶液震蕩消毒10～15min，無菌水沖洗3 次，濾紙吸干果莢表面水分，待用[5]。

1.2.2 種子無菌播種。將已消毒的蒴果在無菌環(huán)境剖開，取出種子并均勻接種在配制好的培養(yǎng)基上。將基礎(chǔ)培養(yǎng)基設(shè)為1/2MS，附加0.2mg/L NAA（萘乙酸）、0.5g/L活性炭、30g/L 蔗糖、7.5g/L 瓊脂，pH 值5.8～6.0。并設(shè)置13 個處理組，處理1～12 分別添加不同種類不同濃度梯度的細(xì)胞分裂素，分別為0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L 的6-BA；0.1mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L 的TDZ；0.2mg/L、0.4mg/L、0.8mg/L、1.6mg/L 的KT，處理13為對照組，不添加細(xì)胞分裂素。每個處理接種12 瓶，每瓶約100 粒種子，培養(yǎng)室溫度設(shè)置為25±2℃，光照時間為12h/d，光照強度為2000Lux[6]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

記錄萌發(fā)時間并統(tǒng)計萌發(fā)率，統(tǒng)計時以形成白色肉眼可見的原球莖為準(zhǔn)。種子萌發(fā)率（%）=萌發(fā)種子數(shù)量∕播種總數(shù)×100[7]。種子萌發(fā)成原球莖30d 后，統(tǒng)計原球莖膨大率、分化率，再過60d 統(tǒng)計成苗率。原球莖膨大率（%）=原球莖膨大數(shù)量∕萌發(fā)原球莖數(shù)量×100；分化率（%）=原球莖分化數(shù)量∕萌發(fā)原球莖數(shù)量×100；成苗率（%）=成苗數(shù)量∕萌發(fā)原球莖數(shù)量×100。

運用SPSS16.0 統(tǒng)計分析程序?qū)υ囼灲Y(jié)果進行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同細(xì)胞分裂素對鵝毛玉鳳花種子無菌萌發(fā)的影響

通過預(yù)試驗發(fā)現(xiàn)，鵝毛玉鳳花種子在1/2MS 附加NAA 和6-BA 的培養(yǎng)基中比MS 培養(yǎng)基的萌發(fā)率高，且附加6-BA 的培養(yǎng)基可使種子萌發(fā)后原球莖膨大、葉片分化并直接成苗。僅添加NAA 的1/2MS 培養(yǎng)基上的種子可萌發(fā)形成白色卵圓形原球莖，但原球莖長時間不分化直至變成黃褐色、萎縮死亡。而不添加任何生長素和細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基上，種子萌發(fā)率不到20%。因此，生長調(diào)節(jié)劑對鵝毛玉鳳花種子萌發(fā)和原球莖分化成苗有一定促進作用，而不同種類生長調(diào)節(jié)劑和不同濃度配比對其影響有顯著差異。本研究僅探討不同種類和濃度的細(xì)胞分裂素對其影響，生長素均使用NAA。由表1 可知，添加KT、TDZ 和6-BA 和未添加分裂素的培養(yǎng)基上種子均能萌發(fā)且萌發(fā)時間都為10d。未添加分裂素的培養(yǎng)基上種子萌發(fā)率為48.7%，顯著低于其他添加了分裂素的培養(yǎng)基，且種子萌發(fā)成原球莖后均停止生長，不分化直至變黃褐色萎縮。不同分裂素的培養(yǎng)基萌發(fā)率有差異但不顯著，添加了KT 的處理組萌發(fā)率隨著濃度增加而先上升后下降，可見，0.8mg/L 的KT 是適合種子萌發(fā)的濃度；添加TDZ 和6-BA 的處理組中最適合種子萌發(fā)的濃度分別為1.0mg/L 和0.5mg/L，萌發(fā)率分別為69.05%和65.56%，但萌發(fā)率并不隨分裂素濃度增加而有規(guī)律的變化。13 組處理的原球莖生長都有不同程度的變黃萎縮，但添加了分裂素的原球莖都有部分膨大，有些甚至能直接分化成苗，而未添加分裂素的處理13種子萌發(fā)成原球莖后停止生長并逐漸萎縮死亡。

表1 不同細(xì)胞分裂素對鵝毛玉鳳蘭種子萌發(fā)的影響

2.2 不同細(xì)胞分裂素對原球莖分化成苗的影響

此試驗周期為從播種到原球莖分化成苗的100d。表2 顯示，未添加分裂素的處理13 原球莖在試驗期間并無明顯生長現(xiàn)象，且逐漸萎縮死亡；添加了分裂素的原球莖均有部分分化?？梢?，分裂素在萌發(fā)培養(yǎng)基中能使種子萌發(fā)的原球莖一步成苗；分裂素的不同種類和不同濃度的促進作用也有顯著差異。3 種分裂素都能促使原球莖膨大，TDZ 處理組在原球莖膨大量、分化量和成苗量上都為最佳，且隨著TDZ 濃度的上升，這3個指標(biāo)也呈上升趨勢。TDZ 的處理7、8 顯著優(yōu)于處理5、6，但處理7 和處理8 的差異不顯著。處理組7、8 分別在萌發(fā)后40d 和45d 長根，100d 后苗高為4～5cm，根數(shù)1～2 根，根長3～4cm。KT 和6-BA 處理組的原球莖長勢無明顯規(guī)律，其中KT 組的原球莖長勢相對最差，成苗率也低；0.5mg/L 和1.0mg/L 6-BA 有少部分原球莖也能直接分化成苗，但大量不生長的原球莖變黃褐色且萎縮死亡。

表2 不同細(xì)胞分裂素對鵝毛玉鳳蘭原球莖分化的影響

3 煉苗移栽

將長至5cm 以上的鵝毛玉鳳花無菌瓶苗轉(zhuǎn)移到溫室內(nèi)煉苗，5～7d后將無菌苗從培養(yǎng)瓶中取出，沖洗掉植株上殘留的培養(yǎng)基，將幼苗種植在含樹皮（1～3mm）、草炭、蘭石（1～3mm）的介質(zhì)中，配比為1∶2∶1。置于溫室內(nèi)遮陰處，光照3000～5000Lux，室溫22～28℃，保持濕度60%～80%，待植株穩(wěn)定生長后可進行常規(guī)水肥管理。

4 討論

鵝毛玉鳳花在野生狀態(tài)和人工栽培條件下生長緩慢，且冬季時植株進入休眠期，只留塊莖在地下或盆土中，很難采用其他蘭科植物常用的分株繁殖方式，用植株器官進行組培也會傷及母株影響生長。而鵝毛玉鳳花的種子細(xì)小，且胚發(fā)育不完全，自然狀態(tài)下人工播種難以萌發(fā)，須借助共生菌類供給養(yǎng)料[8]。因此，利用種子無菌播種的培養(yǎng)方式即可有效解決繁殖困難、繁殖系數(shù)低和周期長的問題。

影響鵝毛玉鳳花種子無菌繁殖的因素有多種，如種子活性、培養(yǎng)環(huán)境等，本試驗在其他因素都相同的情況下，僅研究細(xì)胞分裂素對其產(chǎn)生的影響，并探討無菌苗一步成苗的可能性。通常蘭花種子到成苗要經(jīng)過無菌播種、原球莖分化、生根壯苗和煉苗移栽4 個步驟，需要繼代培養(yǎng)2～3 次。因此，研究鵝毛玉鳳花無菌苗一步成苗需要對培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分和生長調(diào)節(jié)劑配比作出調(diào)整。1/2MS 培養(yǎng)基上的種子萌發(fā)率高于MS，說明低鹽分培養(yǎng)基更有利于種子萌發(fā)。生長素NAA 對種子萌發(fā)有一定作用，但萌發(fā)后的原球莖無法繼續(xù)分化生長，需要轉(zhuǎn)入含分裂素的分化培養(yǎng)基上做繼代培養(yǎng)，細(xì)胞分裂素可刺激細(xì)胞分裂，促進芽分化和生長。試驗結(jié)果表明，未添加分裂素的萌發(fā)培養(yǎng)基無法做到一步成苗。在KT、TDZ 和6-BA 中，1.5mg/L TDZ 對原球莖直接分化成苗的促進作用最佳，但能夠一步成苗的處理組的成苗率并不高，且同一種培養(yǎng)基上成苗所耗時間不同，可能是由于生長調(diào)節(jié)劑濃度配比和培養(yǎng)條件設(shè)置不準(zhǔn)確或者需要添加一些營養(yǎng)物質(zhì)如香蕉、椰青、馬鈴薯等來促進植株器官組織生長[9]。后續(xù)還需通過試驗研究其他因素對其影響，探索一步成苗的最佳方法。

鵝毛玉鳳花的種子萌發(fā)后形成的原球莖可以促使它直接分化形成完整的植株，也可以進行原球莖的增殖和叢生苗的誘導(dǎo)，從而獲得大量的組培苗。而研究其一步成苗的方法意在快速得到成年植株，縮短培養(yǎng)周期，節(jié)約人工和培養(yǎng)成本，短期快速提供優(yōu)質(zhì)組培苗，為科學(xué)研究和大面積栽培奠定基礎(chǔ)[10]。