全自動(dòng)固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定醫(yī)化園區(qū)周邊地表水中甾體激素類及相關(guān)藥物的殘留量

李旭霞

(山東科泰環(huán)境監(jiān)測(cè)有限公司,臨沂 276007)

改革開(kāi)放以來(lái),我國(guó)工業(yè)化進(jìn)程不斷推進(jìn),許多省份、地區(qū)產(chǎn)業(yè)園,如紡織品產(chǎn)業(yè)園、醫(yī)化產(chǎn)業(yè)園、電子產(chǎn)業(yè)園等發(fā)展迅速[1-3],由此帶來(lái)的環(huán)境污染問(wèn)題越來(lái)越受人關(guān)注。隨著我國(guó)環(huán)境監(jiān)管投入和處罰力度的加大,園區(qū)生產(chǎn)企業(yè)偷排、直排等現(xiàn)象越來(lái)越少,但仍存在部分不法生產(chǎn)企業(yè)偷排現(xiàn)象,給周邊水環(huán)境造成惡劣影響[4-8]。我國(guó)甾體激素類以及相關(guān)藥物年產(chǎn)量約占全球的30%以上,如雌激素、雄激素、孕激素、皮質(zhì)激素等甾體激素類以及米非司酮等抗激素類藥物,廣泛應(yīng)用于皮膚病、哮喘等疾病的治療,以及安胎避孕、減肥等[9-15]。人若誤食甾體激素類藥物,會(huì)引起男性精子數(shù)量減少、雄性退化等健康問(wèn)題,嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致人不孕不育、胎兒畸形、免疫機(jī)能降低等。目前暫未發(fā)現(xiàn)相關(guān)國(guó)內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)對(duì)地表水中甾體激素類及相關(guān)藥物殘留進(jìn)行規(guī)定。因此,很有必要監(jiān)測(cè)醫(yī)化園區(qū)周邊地表水中甾體激素類及相關(guān)藥物的殘留量,以幫助了解當(dāng)?shù)氐乇硭h(huán)境污染現(xiàn)狀和有效指導(dǎo)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的修訂。

地表水中甾體激素類及相關(guān)藥物殘留量的研究較少[16-17],相關(guān)文獻(xiàn)一般采用固相萃取法進(jìn)行前處理,液相色譜-質(zhì)譜法進(jìn)行測(cè)定,研究對(duì)象多為性激素,孕激素和皮質(zhì)激素的研究不多,不能全面地反映地表水中甾體激素類及相關(guān)藥物的殘留水平。鑒于此,本工作以全自動(dòng)固相萃取法富集水樣中皮質(zhì)激素類(地塞米松、潑尼松)、孕激素類(炔諾酮)、雌激素類(炔雌醇)、雄激素類(甲睪酮)和抗孕激素類(米非司酮)藥物,以超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定其含量,此方法準(zhǔn)確度、精密度好,適用于地表水中極微量甾體激素類以及相關(guān)藥物殘留水平的監(jiān)測(cè)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290型超高效液相色譜儀,配備自動(dòng)進(jìn)樣器等;Triple QuadTM4500型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀;HLB 固相萃取柱(1 000 mg/12 mL);EXTRA型全自動(dòng)固相萃取儀;Neofuge 18R 型大容量臺(tái)式高速冷凍離心機(jī);MS 205DU 型電子天平;DSY-VI型水浴氮吹儀;Milli-plus 2150 型超純水系統(tǒng)。

單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:200 mg·L-1,分別取地塞米松、潑尼松、炔諾酮、炔雌醇、甲睪酮和米非司酮標(biāo)準(zhǔn)品各20 mg,分別用甲醇溶解并定容至100 mL 容量瓶中,搖勻備用。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列:取適量各目標(biāo)化合物的單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,用甲醇逐級(jí)稀釋,配制成地塞米松、潑尼松、炔諾酮、炔雌醇、甲睪酮和米非司酮質(zhì)量濃度分別為0.005,0.01,0.05,0.1,0.5,1,5 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

地塞米松標(biāo)準(zhǔn)品純度為99.8%,批號(hào)為100129- 201907;潑尼松標(biāo)準(zhǔn)品純度為99.6%,批號(hào)為100199- 201503;炔諾酮標(biāo)準(zhǔn)品純度為99.4%,批號(hào)為100053- 201807;炔雌醇標(biāo)準(zhǔn)品純度為99.4%,批號(hào)為100052- 201210;甲睪酮標(biāo)準(zhǔn)品純度為99.5%,批號(hào)為100172- 201404;米非司酮標(biāo)準(zhǔn)品純度為99.5%,批號(hào)為410003-201301。

甲酸、乙酸銨均為分析純;甲醇、乙腈均為色譜純;試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

Agilent Zorbax Eclipse Plus C18色譜柱(100 mm×3.0 mm,1.8μm);柱溫35 ℃;進(jìn)樣體積10μL;流動(dòng)相A 為1 mmol·L-1乙酸銨溶液,B為乙腈;流量0.4 mL·min-1。

梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution procedure

1.2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源,負(fù)離子掃描模式;噴霧電壓4 000 V;離子傳輸管溫度340 ℃,離子源溫度580℃;氣簾氣壓力0.14MPa;輔助氣壓力0.38MPa;碰撞氣為氮?dú)?多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式。其他質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 質(zhì)譜參數(shù)Tab.2 MS parameters

1.3 試驗(yàn)方法

隨機(jī)采集醫(yī)化園區(qū)周邊地表水樣5 L,去除水樣中肉眼可見(jiàn)物(如樹(shù)葉等漂浮物),置于棕色廣口瓶中,于2～8 ℃避光冷藏儲(chǔ)存。取上述水樣,放置至室溫后,用1 mol·L-1鹽酸溶液或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)其酸度至pH 7,置于全自動(dòng)固相萃取儀的樣品瓶中。將HLB固相萃取柱加載在全自動(dòng)固相萃取儀萃取架上,按照設(shè)定好的程序預(yù)處理柱子并洗脫樣品,即先分別用12 mL 水、12 mL 甲醇和12 mL正己烷活化固相萃取柱,再將上述水樣500 mL 以流量10 mL·min-1過(guò)固相萃取柱,最后用20%(體積分?jǐn)?shù))甲醇溶液15 mL 洗脫。收集洗脫液,于50 ℃氮吹至近干,用甲醇定容至1 mL,渦旋30 s,所得溶液按照儀器工作條件測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 固相萃取柱的選擇

目標(biāo)化合物中雌激素類藥物極性較強(qiáng),皮質(zhì)激素類和孕激素類藥物極性偏弱,因此應(yīng)選用強(qiáng)極性或非極性的固相萃取柱,而用于地表水中有機(jī)物殘留檢測(cè)的常用固相萃取柱主要有氨基固相萃取柱、弗羅里硅土固相萃取柱、C18固相萃取柱和HLB 固相萃取柱等。試驗(yàn)考察了規(guī)格相同(1 000 mg/12 mL)的這4 種固相萃取柱對(duì)加標(biāo)水樣(加標(biāo)量0.1 mg·L-1)中6種目標(biāo)化合物回收率的影響,結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同固相萃取柱所得回收率Tab.3 Recovery with different solid phase extraction columns

由表3可知,相較其他極性和非極性固相萃取柱,HLB固相萃取柱所得6種目標(biāo)化合物的回收率均大于80.0%,準(zhǔn)確度較高,這是由于HLB 固相萃取柱所用填料通用性較強(qiáng),對(duì)中等極性以及非極性分析物的萃取效果較好。因此,試驗(yàn)選擇以HLB固相萃取柱富集樣品中的目標(biāo)化合物。

2.2 水樣酸度的選擇

6種目標(biāo)化合物的極性范圍較寬,在不同酸度地表水中的電離程度不同,可能影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度。因此,試驗(yàn)考察了水樣酸度分別為pH 4,5,6,7,8,9 時(shí)對(duì)加標(biāo)水樣(加標(biāo)量0.1 mg·L-1)中6種目標(biāo)化合物回收率的影響。結(jié)果顯示:當(dāng)酸度為pH 4,5,6時(shí),炔雌醇、地塞米松和潑尼松的回收率為40.0%～70.0%;當(dāng)酸度為pH 8,9時(shí),炔諾酮、甲睪酮和米非司酮的回收率為60.0%～80.0%;當(dāng)酸度為pH 7時(shí),6種目標(biāo)化合物的回收率均較高,為80.0%～100%。這是由于在弱酸、弱堿性條件下,上述6種目標(biāo)化合物均有不同程度電離,導(dǎo)致其在HLB 固相萃取柱中吸附能力降低;在中性條件下,上述6種目標(biāo)化合物均呈現(xiàn)分子態(tài),在HLB 固相萃取柱中吸附能力較強(qiáng),富集作用增強(qiáng)。因此,應(yīng)結(jié)合水樣的實(shí)際酸度,用酸或堿溶液將水樣的酸度調(diào)節(jié)至pH 7后再對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。

2.3 質(zhì)譜條件的選擇

以0.1 mg·L-1地塞米松標(biāo)準(zhǔn)溶液為例進(jìn)行質(zhì)譜條件的優(yōu)化。首先設(shè)定質(zhì)譜采集模式為Q1SCAN(全掃描)模式,找到地塞米松分子離子峰并確定地塞米松Q1參數(shù);再設(shè)定質(zhì)譜采集模式為Production SCAN(產(chǎn)物離子掃描)模式,找到地塞米松分子離子對(duì)應(yīng)的產(chǎn)物離子,選擇響應(yīng)較高的2個(gè)產(chǎn)物離子作為監(jiān)測(cè)離子(定量離子和定性離子);最后利用地塞米松分子離子與其對(duì)應(yīng)的2個(gè)監(jiān)測(cè)離子進(jìn)行去簇電壓和碰撞能量的優(yōu)化,建立地塞米松MRM 方法。同法建立潑尼松、炔諾酮、炔雌醇、甲睪酮和米非司酮的MRM 方法,優(yōu)化后的質(zhì)譜條件見(jiàn)表2。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

本方法雖然有較好的選擇性,但是共流出的基質(zhì)和目標(biāo)化合物的競(jìng)爭(zhēng)會(huì)影響接口離子化效率,進(jìn)而產(chǎn)生基質(zhì)增強(qiáng)或抑制效應(yīng),從而影響最終檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度。按照試驗(yàn)方法分析加標(biāo)水樣(加標(biāo)量0.1 mg·L-1),所得地塞米松、潑尼松、炔諾酮、炔雌醇、甲睪酮和米非司酮回收率分別為85.9%,90.3%,84.7%,88.6%,91.0%,87.3%,說(shuō)明地表水中基質(zhì)干擾較小,定量結(jié)果準(zhǔn)確。在最優(yōu)試驗(yàn)條件下,6種目標(biāo)化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.1 Chromatogram of the mixed standard solution

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

按照試驗(yàn)方法測(cè)定混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,以6種目標(biāo)化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),其對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合,所得6種目標(biāo)化合物的線性范圍均為0.005～5 mg·L-1,其他線性參數(shù)見(jiàn)表4。

以3倍信噪比(S/N)計(jì)算檢出限(3S/N),結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 線性參數(shù)和檢出限Tab.4 Linearity parameters and detection limits

2.6 精密度和回收試驗(yàn)

隨機(jī)采集醫(yī)化園區(qū)周邊地表水樣,按照試驗(yàn)方法對(duì)其進(jìn)行低、中、高等3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn),每個(gè)濃度水平平行測(cè)定5次,計(jì)算回收率和測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝5)Tab.5 Results of tests for precision and recovery(n＝5)

由表5可知:地表水中檢出了地塞米松和炔雌醇,檢出量分別為0.75,1.27μg·L-1;6種目標(biāo)化合物的回收率為83.9%～105%,測(cè)定值的RSD 為2.7%～4.1%,說(shuō)明該方法的準(zhǔn)確度和精密度較好。

本工作提出了全自動(dòng)固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定醫(yī)化園區(qū)周邊地表水中6種目標(biāo)化合物含量的方法,該方法自動(dòng)化程度高、過(guò)程簡(jiǎn)單、分析快速、結(jié)果準(zhǔn)確,具有一定的應(yīng)用價(jià)值。