免疫親和柱凈化-超高效液相色譜-三重四極桿復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜法測定雙殼貝類中短裸甲藻毒素的含量

朱 波,倪一平

(深圳市羅湖區(qū)疾病預(yù)防控制中心,深圳 518020)

貝類毒素是海洋毒素中對人類健康影響較大的一類毒素,主要由水體中產(chǎn)毒藻類或微生物產(chǎn)生,按照中毒癥狀可將其分為麻痹性貝類毒素、腹瀉性貝類毒素、神經(jīng)性貝類毒素、記憶缺失性貝類毒素等四大類[1-2]。神經(jīng)性貝類毒素主要為短凱倫藻產(chǎn)生的短裸甲藻毒素(Pbtx),該毒素可導(dǎo)致魚類大量死亡,牡蠣、蛤和貽貝等雙殼貝類則對其不敏感。對于長期生長在毒藻分布水域中的雙殼貝類,雖然其外表呈現(xiàn)完全健康的狀態(tài),但體內(nèi)卻在富集毒素,消除半衰期長達(dá)數(shù)十天甚至數(shù)月。Pbtx熱穩(wěn)定性較好,加熱、微波等常規(guī)加工處理方式無法消除毒素,反而會(huì)因處理過程中貝類食物含水量降低而導(dǎo)致毒素濃度水平顯著升高。當(dāng)消費(fèi)者食用被污染的雙殼貝類后,可能產(chǎn)生惡心、嘔吐、腹瀉、痙攣、支氣管收縮、麻痹、昏迷等神經(jīng)性中毒癥狀[3-4]。同時(shí),Pbtx能夠通過空氣傳播,被人吸入后,引起氣喘、咳嗽等中毒癥狀[5]。按照基本結(jié)構(gòu),Pbtx可分為A 型(Pbtx-A)、B型(Pbtx-B)及十幾種衍生物,其中Pbtx-B 最常見[6]。Pbtx主要分布在美洲墨西哥灣沿岸和新西蘭豪拉基海灣,但目前已有研究表明,其他海域也受到了此毒素的侵?jǐn)_[7]。聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)、世界衛(wèi)生組織(WHO)、歐盟、加拿大、新西蘭、澳大利亞等規(guī)定貝類中Pbtx限量為20 MUs/100 g,我國暫無相應(yīng)限量的規(guī)定[8]。因此,有必要對雙殼貝類中Pbtx的含量進(jìn)行監(jiān)控。

目前,Pbtx 的檢測方法主要有小鼠生物測定法[9]、體外分析法(細(xì)胞毒性試驗(yàn)[10]、受體結(jié)合試驗(yàn)[11])、免疫分析法(放射免疫法[12]、酶聯(lián)免疫法[13])、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[14-15]等。小鼠生物測定法雖然是發(fā)展較早、較常用的分析方法,但存在特異性、重現(xiàn)性、靈敏度都很差,耗時(shí)長,容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果等問題。體外分析法和免疫分析法均無法準(zhǔn)確定性定量,并且容易受交叉反應(yīng)的影響,出現(xiàn)假陽性或者假陰性結(jié)果。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法兼具液相色譜法和質(zhì)譜法的優(yōu)勢,具有靈敏度高、定性定量準(zhǔn)確等特點(diǎn),越來越廣泛地被應(yīng)用在Pbtx 的檢測中。在采用該方法測定時(shí),雖然使用了固相萃取[16]、液液萃取[17]等方法凈化樣品,但仍存在特異性不強(qiáng)、提取效率不佳等問題,降低了方法的應(yīng)用推廣價(jià)值。

免疫親和柱凈化技術(shù)利用抗原抗體特異性結(jié)合,能夠在有效富集毒素的同時(shí)凈化樣品,減少了基質(zhì)干擾,提高了方法靈敏度和準(zhǔn)確度,已被應(yīng)用于生物毒素檢測中[18-19]。多反應(yīng)監(jiān)測-信息依賴性分析-增強(qiáng)子離子(MRM-IDA-EPI)為超高效液相色譜-三重四極桿復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜儀的特有掃描模式,能夠?qū)崿F(xiàn)一次采樣同時(shí)獲得兩種采集模式下的數(shù)據(jù),即在獲得MRM 定量結(jié)果的同時(shí)完成目標(biāo)物的二級(jí)質(zhì)譜掃描,通過目標(biāo)物的二級(jí)質(zhì)譜圖與標(biāo)準(zhǔn)二級(jí)質(zhì)譜圖的比對,完成雙重定性,提高定性分析的準(zhǔn)確度[20]。本工作采用免疫親和柱前處理樣品,結(jié)合MRM-IDA-EPI掃描模式測定雙殼貝類中Pbtx-B的含量,可為海產(chǎn)品中Pbtx的食品風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測評(píng)估、養(yǎng)殖海域環(huán)境及生物中Pbtx的本地污染調(diào)查,以及因食用被毒素污染的貝類而中毒的患者的病因診斷及臨床救治提供先進(jìn)可靠的技術(shù)支持。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

TripleQuad 5500+型超高效液相色譜-三重四極桿復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜儀;3-30KS型臺(tái)式冷凍離心機(jī);Visiprep 型固相萃取裝置;Millipore Q 型純水系統(tǒng)。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:10 mg·L-1,用甲醇將Pbtx-B標(biāo)準(zhǔn)品0.1 mg完全溶解并定容于10 mL 容量瓶中,于-20 ℃保存。其他標(biāo)準(zhǔn)溶液均由該溶液用甲醇逐級(jí)稀釋制得。

磷酸鹽緩沖液(PBS):pH 7.3,取十二水合磷酸氫二鈉6.45 g、二水合磷酸二氫鈉1.09 g、氯化鈉4.25 g,用水溶解并定容于500 mL容量瓶中。

Pbtx-B標(biāo)準(zhǔn)品的純度為95%;甲醇、甲酸、甲酸銨均為色譜純;十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉、氯化鈉均為分析純;試驗(yàn)用水為超純水。

試驗(yàn)樣品均隨機(jī)購自當(dāng)?shù)啬乘a(chǎn)市場,包括扇貝、貽貝、牡蠣、帶子、青口、馬刀貝等水產(chǎn)品,分析前于-20 ℃冷凍保存。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

Poroshell 120 EC-C18色譜柱(100 mm ×2.1 mm,2.7μm);柱溫40℃;進(jìn)樣量10μL;流動(dòng)相A 為10 mmol·L-1甲酸銨-0.1%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲酸溶液,B為甲醇;流量0.3 mL·min-1。梯度洗脫程序:0～1.0 min時(shí),A 為80%;1.0～4.0 min時(shí),A 由80%降至10%,保持5.0 min;9.0～9.1 min時(shí),A 由10%跳轉(zhuǎn)至80%,保持2.9 min。

1.2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源正離子(ESI+)模式;離子化電壓5 500 V;離子源溫度550 ℃;氣簾氣壓力241 k Pa,噴霧氣壓力379 kPa,輔助加熱氣壓力379 k Pa;接口加熱功能為開啟;碰撞氣壓力模式為高模式;入口電壓10 V,出口電壓10 V;MRM-IDA-EPI掃描模式。IDA 參數(shù):動(dòng)態(tài)背景扣除;MRM 信號(hào)觸發(fā)EPI閾值500 cps。EPI參數(shù):碰撞能量35 e V;擴(kuò)展能量15 eV。Pbtx-B母離子質(zhì)荷比(m/z)895.5;去簇電壓80 V;特征子離子m/z859.6,877.5(定量離子),碰撞能量分別為26,33 eV。

1.3 試驗(yàn)方法

取1.0 g(精確至0.001 g)充分勻質(zhì)的樣品于離心管中,加入80%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲醇溶液4 mL,渦旋2 min后超聲提取10 min。以8 000 r·min-1轉(zhuǎn)速于4 ℃冷凍離心5 min,上清液轉(zhuǎn)移至另一個(gè)潔凈的離心管中,重復(fù)提取一次。合并上清液,用80%甲醇溶液稀釋至10 mL,充分混勻。分取5 mL,加入20 mL PBS,渦旋混勻,待凈化。以保存液活化神經(jīng)性貝類毒素免疫親和柱,將待測液過柱,用20%(體積分?jǐn)?shù))甲醇溶液3 mL 淋洗,待淋洗液流干后,適當(dāng)加壓徹底排干柱內(nèi)殘留液體,加入甲醇3 mL洗脫,過程中確保溫度為室溫,過柱速率為2～3 mL·min-1。收集洗脫液,并完全混勻,分取1.0～1.5 mL 置于離心管中,用10 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心10 min,上清液按照儀器工作條件測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 免疫親和柱的使用效果

為了驗(yàn)證免疫親和柱的使用效果,分別進(jìn)行了回收試驗(yàn)和基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn)。在80%甲醇溶液5 mL中加入適量標(biāo)準(zhǔn)溶液,使Pbtx-B 加標(biāo)量達(dá)到50μg·L-1,充分混勻后加入20 mL PBS,按照試驗(yàn)方法測定,所得Pbtx-B 的回收率大于80.0%,準(zhǔn)確度滿足試驗(yàn)需求。分別以空白基質(zhì)溶液和甲醇配制100μg·L-1標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照儀器工作條件測定,以二者峰面積的比值計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)值,所得結(jié)果為98.8%,說明采用免疫親和柱凈化樣品可有效降低基質(zhì)效應(yīng)。

2.2 色譜條件的選擇

結(jié)合Pbtx-B親脂的性質(zhì),常規(guī)C18色譜柱即可滿足分離需求,同時(shí)對梯度洗脫程序、流量、柱溫等色譜條件進(jìn)行優(yōu)化,所得參數(shù)見1.2.1節(jié)。在此條件下,目標(biāo)物色譜峰峰形尖銳、對稱,基線平穩(wěn),目標(biāo)物在7 min內(nèi)即可得到較好分離。

2.3 質(zhì)譜條件的選擇

根據(jù)Pbtx-B分子結(jié)構(gòu),選擇在ESI+模式下檢測,采用針泵進(jìn)樣,在確定母離子和子離子的m/z后分別優(yōu)化去簇電壓和碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù),使Pbtx-B的響應(yīng)信號(hào)最大,得到MRM 模式下Pbtx-B的總離子流色譜圖,結(jié)果見圖1。

圖1 Pbtx-B的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of Pbtx-B

在MRM 采集條件的基礎(chǔ)上建立MRM-IDAEPI掃描模式,用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)獲得Pbtx-B的標(biāo)準(zhǔn)二級(jí)質(zhì)譜圖并加入譜庫。根據(jù)Pbtx-B 的響應(yīng)值合理設(shè)定IDA 中信號(hào)強(qiáng)度閾值,當(dāng)樣品中可疑色譜峰的響應(yīng)值超過設(shè)置的IDA 閾值時(shí),質(zhì)譜在1 ms內(nèi)自動(dòng)將Q3切換為線性離子阱,并對該MRM 通道的母離子執(zhí)行EPI,在低(20 eV)、中(35 eV)、高(50 e V)碰撞能量下分別掃描碎片離子,3個(gè)碰撞能量所得的碎片離子混合圖即為二級(jí)質(zhì)譜圖。軟件在譜庫中搜索對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)二級(jí)質(zhì)譜圖,并自動(dòng)計(jì)算二者的相似程度百分比,結(jié)合常規(guī)方法學(xué)驗(yàn)證,從而實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)物的定性確證。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

按照儀器工作條件測定質(zhì)量濃度分別為5,10,20,50,200,500μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,以Pbtx-B的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),其對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示,Pbtx-B標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為5～500μg·L-1,線性回歸方程為y＝2.145×103x-9.738×103,相關(guān)系數(shù)為0.996 8。

按照試驗(yàn)方法制備并測定加標(biāo)空白樣品溶液,以3倍信噪比(S/N)對應(yīng)的質(zhì)量濃度計(jì)算檢出限(3S/N),結(jié)果為30μg·kg-1。

2.5 精密度和回收試驗(yàn)

在陰性扇貝樣品中添加低(檢出限)、中(5倍檢出限)、高(10倍檢出限)等3個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液,每個(gè)濃度水平做6 個(gè)平行樣,按照試驗(yàn)方法分析,每個(gè)樣品均重復(fù)測定6次,計(jì)算回收率和測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表1。

表1 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)Tab.1 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

2.6 樣品分析

按照試驗(yàn)方法分析扇貝、貽貝、牡蠣、帶子、青口、馬刀貝等水產(chǎn)品,均未檢出Pbtx-B,與相關(guān)文獻(xiàn)[21]的研究結(jié)果基本一致。

同步分析加標(biāo)樣品(加標(biāo)量150μg·kg-1),并在標(biāo)準(zhǔn)譜庫中對EPI模式下采集的二級(jí)質(zhì)譜圖進(jìn)行匹配性檢索。結(jié)果顯示,二者二級(jí)質(zhì)譜圖的匹配度值、反匹配度值、純度值均大于60%,相似度較高,說明本方法可用于雙殼貝類中Pbtx-B的檢測。

本工作采用免疫親和柱凈化技術(shù)結(jié)合MRMIDA-EPI模式檢測雙殼貝類中的Pbtx-B,該方法特異性強(qiáng)、定性定量準(zhǔn)確,彌補(bǔ)了暫無相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)方法的短板,具有很好的應(yīng)用前景。