基于羧甲基殼聚糖-氧化透明質(zhì)酸自組裝行為構(gòu)建的pH響應(yīng)型納米乳水凝膠給藥系統(tǒng)

湯小涵，王 哲，閆 巧，秦祉劍，袁海龍*

基于羧甲基殼聚糖-氧化透明質(zhì)酸自組裝行為構(gòu)建的pH響應(yīng)型納米乳水凝膠給藥系統(tǒng)

湯小涵1, 2，王 哲2，閆 巧2，秦祉劍1，袁海龍1, 2*

1. 安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230032 2. 空軍特色醫(yī)學(xué)中心 藥學(xué)部，北京 100142

基于羧甲基殼聚糖（carboxymethyl chitosan，CMC）-氧化透明質(zhì)酸（oxidized hyaluronic acid，OHA）的自組裝行為，構(gòu)建一種用于局部遞送難溶性藥物的pH響應(yīng)型納米乳水凝膠給藥系統(tǒng)。采用自乳化法制備丹參酮IIA（tanshinone ⅡA，Tan IIA）納米乳，通過平衡溶解度的考察和偽三元相圖的繪制優(yōu)化納米乳處方，對納米乳進行理化性質(zhì)考察。高碘酸鈉氧化法制備OHA，以成膠時間為指標優(yōu)選CMC和OHA的濃度。將OHA溶解于納米乳中與CMC溶液自組裝形成Tan IIA納米乳水凝膠（CMC-OHA/Tan IIA-NBHs）。對得到的CMC-OHA/Tan IIA-NBHs進行理化性質(zhì)和體外抑菌活性評價。優(yōu)化處方可制備得到O/W型Tan IIA納米乳，粒徑為（52.18±0.15）nm，PDI為0.165±0.012。自組裝得到的CMC-OHA/Tan IIA-NBHs具有良好的穩(wěn)定性、酸響應(yīng)性和藥物緩釋性能。抑菌圈實驗表明CMC-OHA/Tan IIA-NBHs體外可顯著抑制痤瘡丙酸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長。CMC-OHA/Tan IIA-NBHs制備方法簡便、穩(wěn)定性好，可以有效改善難溶性藥物的體外溶出行為，為納米乳局部遞送難溶性藥物提供了新的思路和方法。

自組裝；水凝膠；藥物遞送；pH響應(yīng)性；緩釋；丹參酮IIA

丹參酮IIA（tanshinone IIA，TanIIA）作為中藥丹參中的主要活性成分，對痤瘡丙酸桿菌和金黃色葡萄球菌有較好的抑制作用，但由于Tan IIA屬于BCS II類藥物，水溶性極差（2 μg/mL），嚴重影響了其在臨床上的使用效果[8]。因此本研究以Tan IIA為模型藥物，制備了粒徑小、分散均勻的Tan IIA納米乳，然后將OHA溶于Tan IIA納米乳形成藥物前體溶液，與CMC溶液自組裝形成Tan IIA納米乳水凝膠給藥系統(tǒng)（CMC-OHA Tan IIAnanoemulsion- based hydrogels，CMC-OHA/Tan IIA-NBHs），并對其穩(wěn)定性、pH響應(yīng)性和體外抑菌活性進行評價，為功能型水凝膠遞送難溶性藥物的研究提供新思路。

1 儀器與材料

1.1 儀器

DF101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，北京恒豐長偉科技有限公司；Winner802型納米激光粒度儀，濟南微納顆粒儀器股份有限公司；Tecnai G2 F30型場發(fā)射透射電子顯微鏡（TEM），美國FEI公司；KQ-100E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；BT125D型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；TGL-16G型臺式離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；LC-20A型高效液相色譜系統(tǒng)，日本島津公司；Nicolet-5799型傅里葉紅外光譜儀，美國熱力公司；ZRS-8G型智能溶出試驗儀，天津市天大天發(fā)科技有限公司。

1.2 材料

Tan IIA原料藥，質(zhì)量分數(shù)95%，西安鴻生生物技術(shù)有限公司，批號150301；Tan IIA對照品，質(zhì)量分數(shù)98%，中國食品藥品檢定研究院，批號110766- 201520；蓖麻油，湖南爾康制藥股份有限公司；油酸乙酯，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；肉豆蔻酸異丙酯（isopropyl myristate）、聚氧乙烯蓖麻油（cremophor EL，CEL）購自長沙研邦化工科技有限公司；聚氧乙烯氫化蓖麻油（cremopher RH 40，CRH），北京鳳禮精求商貿(mào)有限責(zé)任公司；乙醇、聚山梨酯80、聚乙二醇（PEG）400購自天津市光復(fù)精細化工研究所；甘油、1,2-丙二醇購自北京化工廠；辛癸酸甘油酯，Sigma生物科技有限公司；磷酸,天津福晨試劑廠；色譜甲醇，F(xiàn)isher Chemical公司；蒸餾水由實驗室超純水機生產(chǎn)；痤瘡丙酸桿菌、金黃色葡萄球菌標準株及培養(yǎng)基購自西安國聯(lián)質(zhì)量檢測技術(shù)股份有限公司。

2 方法

2.1 TanIIAHPLC分析方法的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Inerteil ODS-3柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-0.1%磷酸水溶液（85∶15）；柱溫30 ℃；體積流量1 mL/min；檢測波長270 nm；進樣量20 μL[9]。

2.1.2 溶液的配制

現(xiàn)階段，經(jīng)濟環(huán)境發(fā)生了比較顯著的變化，工資水平也越來越高，交個稅的群體也越來越多，不過由于物價水平的持續(xù)提升，拋除通貨膨脹的影響，整體的購買能力還是比較低，不過還是需要繳納個人所得稅，個人稅收負擔(dān)會增加，隨著二胎政策的推廣，一些家庭的生活壓力越來越大，要想顯示出稅收的公平性，就需要進行個人所得稅扣除項目改革。

（1）對照品溶液的制備：精密稱定5.00 mg對照品Tan IIA置于10 mL量瓶中，加適當甲醇溶解后，甲醇定容至刻度得質(zhì)量濃度為500 μg/mL的對照品儲備液。精密吸取對照品儲備液適量，用甲醇按不同比例稀釋，得質(zhì)量濃度為1.00、2.00、4.00、8.00、10.00、20.00、40.00 μg/mL系列對照品溶液。

（2）供試品溶液的配制：精密稱取Tan IIA納米乳1.0 g于50 mL量瓶中，加甲醇超聲破乳，定容得母液；再精密量取0.5 mL母液于10 mL量瓶中甲醇定容，搖勻得Tan IIA納米乳供試品溶液。

（3）陰性對照溶液的配制：精密稱取空白納米乳1.0 g于25 mL量瓶中，甲醇超聲破乳，定容得母液；精密量取0.5 mL母液至10 mL量瓶中加甲醇定容，搖勻得陰性對照溶液。

2.1.3 專屬性考察 分別取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液，0.22 μm微孔濾膜濾過后，按“2.1.1”項下條件測定。圖1顯示，Tan IIA峰形對稱且達到基線分離，供試品與對照品溶液中Tan IIA保留時間基本一致，納米乳輔料和水凝膠基質(zhì)對測定無干擾。

圖1 CMC-OHA/Tan IIA-NBHs (A)、Tan IIA對照品(B)和空白納米乳水凝膠(C) 的HPLC圖

2.1.4 線性關(guān)系考察 以Tan IIA質(zhì)量濃度為橫坐標（）、峰面積為縱坐標（）進行線性回歸，得回歸方程為＝127 733＋28 346，＝0.999 6，表明Tan IIA在質(zhì)量濃度為1.00～40.00 μg/mL線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度試驗 取“2.1.2”項下質(zhì)量濃度為8.00 μg/mL的Tan IIA對照品溶液，按“2.1.1”項下的色譜條件進樣分析，計算精密度。結(jié)果顯示Tan IIA峰面積RSD為1.35%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 吸取“2.1.2”項下的供試品溶液適量，分別于0、2、4、6、8、16、24 h按“2.1.1”項下的色譜條件進樣分析。結(jié)果顯示Tan IIA峰面積RSD為0.83%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7 重復(fù)性試驗 取同一批的Tan IIA納米乳3份，每個樣品按“2.1.2”項下供試品的制備方法平行配制6個樣品，共制備18個樣品，按“2.1.1”項下的色譜條件進樣分析，記錄峰面積。結(jié)果RSD為1.38%，表明此方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 按“2.1.2”項下供試品的制備方法制備供試品溶液9份，分別加入對照品儲備液適量，配制成質(zhì)量濃度為12.85、14.35、15.75 μg/mL的樣品溶液。按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算加樣回收率。結(jié)果低、中、高不同質(zhì)量濃度的平均回收率分別為99.53%、100.07%、99.03%，RSD值均小于1.5%。表明回收率符合要求。

2.2 TanIIA在納米乳成分中的溶解度測定

取各輔料1.00 g于2 mL離心管中，分別加入過量Tan IIA，渦旋混勻5 min后超聲4 h助溶，靜置過夜后，5000 r/min離心10 min，取上清液用甲醇稀釋至適當質(zhì)量濃度，過0.22 μm微孔濾膜后，使用HPLC法測定Tan IIA在各輔料中的平衡溶解度[10]。平衡溶解度測定結(jié)果如圖2所示，結(jié)合輔料的性質(zhì)，初步選擇對Tan IIA溶解度大的聚山梨酯80和PEG 400作為納米乳的乳化劑和助乳化劑，辛癸酸甘油酯為油相。

圖2 Tan IIA在不同輔料中的溶解度

2.3 偽三元相圖的繪制及Km值的確定

將確定的乳化劑（聚山梨酯80）和助乳化劑（PEG 400）分別按質(zhì)量比（m）為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2的比例混合，然后將油相和混合乳化劑按1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1的比例加入西林瓶中，于37 ℃水浴下攪拌15 min混勻，緩慢滴加蒸餾水繼續(xù)攪拌直至形成澄清透明的納米乳，記錄體系從黏稠變?yōu)榱鲃有粤己脮r的臨界點用水量，以該點為相圖中可形成納米乳的邊界點。用Origin 7.5軟件繪制偽三元相圖，比較不同比例油相、乳化劑、助乳化劑所形成納米乳區(qū)域的大小。結(jié)果如圖3所示，m值（聚山梨酯80和PEG 400的質(zhì)量比）為2∶1時，該體系形成的納米乳區(qū)面積最大。根據(jù)偽三元相圖確定聚山梨酯80和PEG 400比例為2∶1。

2.4 Tan IIA納米乳的制備

按處方量加入乳化劑、助乳化劑、油相和Tan IIA原料藥粉末，37 ℃水浴下600 r/min攪拌15 min混勻，緩慢滴加1 mL蒸餾水，即得Tan IIA納米乳。取同法制備的空白納米乳于西林瓶中，不同比例油相形成的納米乳放置7 d后觀察乳液形態(tài)，結(jié)果顯示辛癸酸甘油酯與混合乳化劑的比例為1∶9時形成的乳液更加穩(wěn)定，沒有出現(xiàn)分層，絮凝或粒徑增大的情況。最終確定Tan IIA納米乳的最佳處方為聚山梨酯80-PEG 400-辛癸酸甘油酯（6∶3∶1）。

圖3 不同Km值的偽三元相圖

2.5 Tan IIA納米乳的表征

為鑒定納米乳的類別分別加入適量蘇丹紅和亞甲藍染料，靜置3 min后觀察2種染料的擴散速度。如圖4-A所示，最優(yōu)處方制備的Tan IIA納米乳為澄清透明的橙紅色液體，沒有沉淀或絮凝。如圖4-B和4-C所示，亞甲藍的擴散速度快于蘇丹紅，表明所制備的Tan IIA納米乳為水包油型。

取Tan IIA納米乳稀釋20倍后用激光粒度分析儀測定其平均粒徑。粒徑測定結(jié)果（圖5）表明，Tan IIA納米乳粒徑為（52.18±0.21）nm，多分散系數(shù)為0.165±0.012，說明該處方制備的納米乳粒徑小，分布范圍窄，是均一穩(wěn)定的分散體系。

圖4 Tan IIA納米乳的外觀(A) 及鑒定研究示意圖(B, C)

圖5 Tan IIA納米乳的粒徑分布

將Tan IIA納米乳稀釋5倍和20倍后滴于覆有支持膜的銅網(wǎng)上，濾紙吸去多余液體后，靜置10 min自然晾干，再滴加入質(zhì)量濃度為10 mg/mL的磷鎢酸溶液于銅網(wǎng)上負染10 min，自然揮干，TEM觀察納米乳外觀。Tan IIA納米乳的形態(tài)可見圖6-a、b所示，稀釋倍數(shù)為5倍時Tan IIA納米乳的乳滴大多團聚在一起，粒徑大小均在1 μm內(nèi)，稀釋倍數(shù)為20倍時Tan IIA納米乳的乳滴被均勻分散，呈類圓形，粒子間無黏連。

a-5倍稀釋 b-20倍稀釋

2.6 氧化透明質(zhì)酸的制備和表征

采用高碘酸鈉氧化法制備OHA[11]，將2.00 g透明質(zhì)酸溶于50 mL蒸餾水中，37 ℃水浴以600 r/min的速度攪拌直至完全溶解，室溫冷卻后加入1.30 g高碘酸鈉，在25 ℃水浴條件下持續(xù)攪拌12 h后，加入1 mL乙二醇淬滅未反應(yīng)的高碘酸鈉，繼續(xù)攪拌1 h，隨后將產(chǎn)物裝入透析袋（截留相對分子質(zhì)量3500），以蒸餾水透析48 h，然后冷凍干燥得到OHA。

取少許新鮮制備的OHA于研缽中，加入100倍左右的溴化鉀粉末，研磨后壓片利用紅外吸收光譜對合成產(chǎn)物進行表征。結(jié)果如圖7所示，與HA的紅外光譜圖對比，1726 cm?1處醛基的特征吸收峰表明使用該方法成功制備OHA。

圖7 HA和OHA的FT-IR圖

2.7 CMC-OHA/Tan IIA-NBHs的制備

2.7.1 成膠時間的測定和空白水凝膠基質(zhì)的選擇 采用傾斜法測定成膠時間，OHA和CMC溶液接觸后開始計時，然后傾斜西林瓶，觀察溶液的流動情況，待傾斜西林瓶時體系不再流動則停止計時，該時間即為成膠時間。以成膠時間為評價指標，優(yōu)化凝膠的處方比例。取制備好的OHA粉末溶解在蒸餾水中，形成質(zhì)量濃度為10、20、30 mg/mL的均勻溶液；CMC溶解在蒸餾水中，形成質(zhì)量濃度為10、20、30、40 mg/mL的均勻溶液。將等體積的OHA和CMC溶液在37 ℃水浴下混合均勻，并保持在37 ℃直至成膠。形成的空白基質(zhì)根據(jù)組成基質(zhì)的初溶液質(zhì)量濃度進行命名，例如20 mg/mL的OHA溶液和30 mg/mL的CMC溶液形成的空白基質(zhì)命名為O2C3。各組水凝膠的成膠時間和混合1 min時的成膠狀態(tài)見圖8、9?？梢园l(fā)現(xiàn)OHA和CMC的質(zhì)量濃度均對凝膠的成膠時間有顯著影響，隨著二者質(zhì)量濃度的增大凝膠時間逐漸縮短。當OHA質(zhì)量濃度和CMC質(zhì)量濃度均為10 mg/mL時，無法形成穩(wěn)定的水凝膠。當OHA質(zhì)量濃度為10 mg/mL，隨著CMC的質(zhì)量濃度由20 mg/mL增大到40 mg/mL，成膠時間由261.67 s縮短至176.33 s。當OHA質(zhì)量濃度為30 mg/mL時，隨著CMC的質(zhì)量濃度由10 mg/mL增大到40 mg/mL，成膠時間進一步由152.00 s縮短至24.00 s。進一步提高質(zhì)量濃度會延長前體溶液的制備時間，導(dǎo)致總體制備時間增大，因此，最終優(yōu)選O3C4進行后續(xù)研究。

圖8 不同質(zhì)量分數(shù)CMC和OHA形成水凝膠的成膠時間

圖9 1 min時各組水凝膠的狀態(tài)

2.7.2 載藥水凝膠的制備和載藥量的測定 取制備好的OHA粉末用Tan IIA納米乳溶解，隨后與等體積的CMC溶液在37 ℃水浴下混合均勻直至成膠，即得CMC-OHA/Tan IIA-NBHs。最佳處方制備得到的CMC-OHA/Tan IIA-NBHs可見圖10，其外觀均勻且成膠性能良好。經(jīng)測定，CMC-OHA/Tan IIA-NBHs的成膠時間為（24.32±0.03）s，與O3C4空白水凝膠基質(zhì)的成膠時間沒有顯著性差異。取1.00 g CMC-OHA/Tan IIA-NBHs置于10 mL量瓶中，加入適量甲醇超聲15 min后用甲醇定容至刻度，過0.22 μm濾膜后用HPLC法測得CMC-OHA/Tan IIA- NBHs中Tan IIA的質(zhì)量分數(shù)為1.0 mg/g。

圖10 CMC-OHA/Tan IIA-NBHs的外觀

2.8 CMC-OHA/Tan IIA-NBHs的穩(wěn)定性考察

2.8.1 離心穩(wěn)定性 將Tan IIA和CMC-OHA/Tan IIA-NBHs以8000 r/min的速度離心20 min，觀察離心后其外觀是否有變化[12]。離心穩(wěn)定性結(jié)果如圖11所示，8000 r/min離心20 min后Tan IIA納米乳（b）仍澄清透明，未產(chǎn)生分層破乳現(xiàn)象，但有少量藥物析出沉積在底部，而CMC-OHA/Tan IIA-NBHs（a）經(jīng)過離心處理沒有藥物析出，表明CMC-OHA/Tan IIA-NBHs離心穩(wěn)定性良好。

2.8.2 光穩(wěn)定性 Tan IIA作為一種具有醌式結(jié)構(gòu)的化合物，易被氧化，并有研究顯示其光穩(wěn)定性較差，因此對CMC-OHA/Tan IIA-NBHs（a）的光穩(wěn)定性進行了考察，與Tan IIA納米乳（b）和Tan IIA乙醇溶液（c）進行對比。將Tan IIA乙醇溶液、Tan IIA納米乳和CMC-OHA/Tan IIA-NBHs置于透明西林瓶中，于25 ℃、日光燈下（4500 lx）保存。分別于0、1、2、4、8、12、24、36、48、72 h取樣0.50 g，用甲醇稀釋并超聲后定容至刻度，過0.22 μm濾膜后用HPLC法測定Tan IIA含量。如圖12所示，在25 ℃、日光燈下（4500 lx）保存3 d后，Tan IIA乙醇溶液中Tan IIA的含量下降了44.66%，Tan IIA納米乳含量下降了30.92%，而CMC-OHA/Tan IIA-NBHs中Tan IIA含量變化最小，僅下降了6.92%。說明將Tan IIA制備成納米乳水凝膠能顯著提升其光穩(wěn)定性。

a-CMC-OHA/Tan IIA-NBHs b-Tan IIA納米乳

a-CMC-OHA/Tan IIA-NBHs b-Tan IIA納米乳 c-Tan IIA乙醇溶液

2.8.3 長期穩(wěn)定性 將CMC-OHA/Tan IIA-NBHs置于密閉器皿中，于4、25、40 ℃不同溫度條件下避光放置，在0、3、7、14、21、30 d取樣，HPLC法測定Tan IIA的含量。如圖13所示，于4 ℃和25 ℃條件下儲存的CMC-OHA/Tan IIA-NBHs在30 d內(nèi)Tan IIA質(zhì)量分數(shù)分別下降2.82%和2.99%，在40 ℃條件下儲存的CMC-OHA/Tan IIA-NBHs在30 d內(nèi)Tan IIA含量下降8.48%。因而CMC-OHA/Tan IIA-NBHs在室溫或冷藏的避光儲存條件下具備較好的藥物穩(wěn)定性，但熱穩(wěn)定性較差。

圖13 CMC-OHA/Tan IIA-NBHs的長期穩(wěn)定性(, n = 3)

2.9 CMC-OHA/Tan IIA-NBHs的體外響應(yīng)性釋放

采用透析袋法考察CMC-OHA/Tan IIA-NBHs在pH為5.0、5.5、7.4的PBS緩沖溶液中的釋放。取10.00 g CMC-OHA/Tan IIA-NBHs于活化好的透析袋（截留相對分子質(zhì)量14 000）中，兩端夾緊，置于盛有200 mL PBS的溶出杯中，溫度為37 ℃，轉(zhuǎn)速為100 r/min，分別于0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、32、48、54、72 h取樣0.5 mL，同時補加同溫同體積的溶出介質(zhì)，樣品用0.22 μm的微孔濾膜濾過，HPLC法測定Tan IIA含量，并計算Tan IIA累積釋放量。CMC-OHA/Tan IIA-NBHs的體外響應(yīng)性釋放結(jié)果如圖14所示，在pH 5.0、5.5的PBS緩沖液中，72 h內(nèi)Tan IIA的釋放度分別為73.74%和67.56%，而在pH為7.4的緩沖溶液中，72 h內(nèi)Tan IIA的釋放度僅為37.11%。此外，在酸性緩沖溶液中，CMC- OHA/Tan IIA-NBHs在24 h內(nèi)釋放率超過40%，而在中性緩沖溶液中的釋放度不足30%。結(jié)果表明CMC-OHA/Tan IIA-NBHs具有明顯的酸響應(yīng)性，并有良好的緩釋作用，可以在接觸微酸性皮膚時緩慢釋放藥物。

圖14 CMC-OHA/Tan IIA-NBHs在PBS緩沖液中釋放曲線(, n = 3)

2.10 抑菌效果評價

為了考察CMC-OHA/Tan IIA-NBHs的抑菌活性，分別考察了CMC-OHA/Tan IIA-NBHs對痤瘡丙酸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌能力。痤瘡丙酸桿菌和金黃色葡萄球菌于培養(yǎng)平板上活化，將2種菌轉(zhuǎn)移至硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基中，分別于37 ℃培養(yǎng)箱進行無氧和有氧培養(yǎng)，然后使用無菌水將二者稀釋至活菌量在1×105～1×106cfu/mL，作為供試菌液備用。精密量取2種供試菌液各150 μL，分別均勻涂抹于培養(yǎng)基，并平行制備3份。使用直徑為0.5 cm的圓形模圈在含菌培養(yǎng)基表面分別涂抹等質(zhì)量0.20 g的CMC-OHA/Tan IIA-NBHs、陽性藥紅霉素、O3C4空白凝膠和卡波姆空白凝膠后痤瘡丙酸桿菌于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)進行無氧培養(yǎng)，金黃色葡萄球菌于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)進行有氧培養(yǎng)。48 h后觀察測量各給藥部位的抑菌圈直徑，并按表1評判標準進行評判[13]。

表1 抑菌圈評分

Table 1 Scoring table of bacteriostatic ring

抑菌圈直徑敏感度評分 直徑＞20 mm極度敏感4 20 mm＞直徑≥15 mm高度敏感3 15 mm＞直徑≥10 mm中度敏感2 10 mm＞直徑≥7 mm低度敏感1 直徑＜7 mm不敏感0

CMC-OHA/Tan IIA-NBHs的體外抑菌活性評估結(jié)果如表2所示。對于痤瘡丙酸桿菌，陽性藥紅霉素抑菌圈大小為（27.30±1.27）mm，敏感程度評分4級，CMC-OHA/Tan IIA-NBHs的抑菌圈大小為（23.70±0.71）mm，敏感程度評分4級，O3C4空白凝膠的抑菌圈大小為（15.60±1.12）mm，敏感程度評分3級。對于金黃色葡萄球菌，陽性藥紅霉素抑菌圈大小為（29.10±1.00）mm，敏感程度評分4級，CMC-OHA/Tan IIA-NBHs的抑菌圈大小為（33.10±1.40）mm，敏感程度評分4級，O3C4空白凝膠的抑菌圈大小為（17.60±1.33）mm，敏感程度評分3級，卡波姆空白凝膠對痤瘡丙酸桿菌和金黃色葡萄球菌沒有抑菌能力。結(jié)果證明CMC- OHA/Tan IIA-NBHs具有良好的抑菌活性，體外能抑制痤瘡丙酸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長。

表2 CMC-OHA/Tan IIA-NBHs的體外抑菌活性

Table 2 Antibacterial activity of CMC-OHA/Tan IIA-NBHs in vitro

藥物痤瘡丙酸桿菌金黃色葡萄球菌 抑菌圈直徑評分抑菌圈直徑評分 紅霉素27.30±1.27429.1±1.004 CMC-OHA/Tan IIA-23.70±0.71433.1±1.404 NBHs O3C415.60±1.12317.6±1.333 卡波姆凝膠1.40±0.9702.9±0.750

3 討論

制備簡單、工藝成熟的納米乳液近年來在食品和藥品領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注，制備納米乳的輔料具有生物相容性好毒性低的特點，因此，納米乳很適合封裝和遞送親脂性活性成分。然而由于其低黏度性和不穩(wěn)定性，納米乳不適合局部給藥，為了解決這些問題，將納米乳和凝膠劑結(jié)合是一個很有效的解決方案[14-15]。在成膠時間的測定中發(fā)現(xiàn)，隨著OHA和CMC質(zhì)量濃度的升高，凝膠的成膠時間會顯著縮短。這是因為OHA-CMC水凝膠是通過席夫堿反應(yīng)形成，OHA的氨基和CMC的醛基生成具有pH響應(yīng)性的亞胺鍵，因此水凝膠的成膠時間主要和溶液中的活性氨基和醛基數(shù)有關(guān)，隨著OHA和CMC質(zhì)量濃度的升高，溶液中發(fā)生交聯(lián)的活性基團密度會增加，凝膠的成膠時間會顯著縮短[16]。

皮膚面部的pH與多種因素有關(guān)，有研究顯示在多種皮膚屏障受損的疾病中，均觀察到了不同程度的皮膚表面pH的升高[17-18]。因此本研究選擇考察CMC-OHA/Tan IIA-NBHs中Tan IIA在pH為5.0、5.5的緩沖溶液中的釋放，同時以pH為7.4的緩沖溶液組作為對照。體外釋放實驗結(jié)果表明，CMC-OHA/Tan IIA-NBHs在pH為5.0的PBS緩沖液中，Tan IIA72 h的累積釋放度可達到70%以上，而在pH 7.4時僅僅不到30%，表明具有較好的酸響應(yīng)性。根據(jù)Chen等[19]實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，席夫堿結(jié)構(gòu)在弱酸性環(huán)境下降解緩慢，完全降解需要10 d左右，因此CMC-OHA/Tan IIA-NBHs在72 h內(nèi)難以釋放完全。而在pH7.4的緩沖液中，席夫堿鍵較為穩(wěn)定，CMC和OHA水凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)降解程度較低，不利于藥物釋放。因此這種pH響應(yīng)型的藥物載體在藥物遞送領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用潛力。

體外抑菌活性實驗表明，CMC-OHA/Tan IIA- NBHs在體外能夠有效抑制痤瘡丙酸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長。此外O3C4水凝膠基質(zhì)也有一定的抑菌活性，這是因為殼聚糖的高電荷多陽離子結(jié)構(gòu)與帶負電的細菌磷脂膜成分會產(chǎn)生強烈的靜電相互作用，通過膜損傷和隨后的內(nèi)容物泄漏導(dǎo)致細菌死亡，因此適當提高殼聚糖的濃度有利于提高凝膠的抗菌性能[20-21]。

本研究利用CMC和OHA的自組裝行為，在溫和的反應(yīng)條件下，一步制備完成了納米乳和水凝膠的結(jié)合，得到的CMC-OHA/Tan IIA-NBHs具有良好的穩(wěn)定性、pH響應(yīng)性和緩釋能力，可在體外顯著抑制痤瘡丙酸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長。為納米乳和難溶性藥物的外用產(chǎn)品開發(fā)與臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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pH-responsive nanoemulsion hydrogel drug delivery system based on self- assembly behavior of carboxymethyl chitosan-oxidized hyaluronic acid

TANG Xiao-han1, 2, WANG Zhe2, YAN Qiao2, QIN Zhi-jian1, YUAN Hai-long1, 2

1. School of Pharmacy, Anhui Medical University, Hefei 230032, China 2. Department of Pharmacy, Air Force Medical Center, PLA, Beijing 100142, China

To construct a pH-responsive nanoemulsion hydrogel drug delivery system based on the self-assembly behavior of carboxymethyl chitosan (CMC)-oxidized hyaluronic acid (OHA) for the topical delivery of in poor solubility drugs.The optimum prescription of nanoemulsion was determined according to the amount of tanshinone ⅡA(Tan IIA) dissolved in various excipients and the pseudo-ternary phase diagram and the physicochemical properties of the nanoemulsion were investigated. Furthermore, OHA was prepared by sodium periodate oxidation and the concentration of CMC and OHA is optimized by using the gel formation time as an indicator. CMC-OHA Tan IIAnanoemulsion-based hydrogels (CMC-OHA/ Tan IIA-MBHs) were prepared by dissolving OHA in nanoemulsion and self-assembling the mixture with CMC solution. Physicochemical properties andantibacterial activity of CMC-OHA/Tan IIA-MBHs were observed and detected.The mean particle size of the prepared Tan IIAnanoemulsion was (52.18 ± 0.21) nm and PDI was 0.165 ± 0.012. Theevaluation results showed CMC-OHA/Tan IIA-NBHs had good centrifugal stability, light stability, pH responsiveness, and sustained-release properties. The bacterial inhibition ring test showed that CMC-OHA/TanIIA-NBHs could significantly inhibit the growth of Propionibacterium acnes and Staphylococcus aureus.With the advantages of simple preparation and good stability, CMC-OHA/Tan ⅡA-MBHs could effectively improve thedissolution behavior of insoluble drugs, providing a new idea and method for topical delivery of poorly soluble drugs by nanoemulsion.

self-assembly; hydrogel; drug delivery; pH-sensitive; sustained-released; tanshinone IIA

R283.6

A

0253 - 2670(2022)16 - 4992 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.16.008

2022-02-21

國家自然科學(xué)基金面上項目（81873092）

湯小涵，碩士研究生，研究方向為中藥新型給藥系統(tǒng)研究。E-mail: 3206820156@qq.com

袁海龍，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向為中藥新型給藥系統(tǒng)研究。Tel: (010)66928505 E-mail: yhlpharm@126.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]