運動對小型豬肢體熒光素鈉循經(jīng)遷移影響的初步觀察

熊楓 賈術(shù)永 宋曉晶 王廣軍 王淑友 李宏彥，3 王瑾玉 張維波

1 中國中醫(yī)科學(xué)院針灸研究所（北京 100700）

2 北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院（北京 100029）

3 中國中醫(yī)藥科技發(fā)展中心（國家中醫(yī)藥管理局人才交流中心）（北京 100027）

生命在于運動，《素問·上古天真論》指出：“余聞上古有真人者，提挈天地，把握陰陽，呼吸精氣，獨立守神，肌肉若一”，強(qiáng)調(diào)中醫(yī)養(yǎng)生要鍛煉身體，使筋骨肌肉的活動高度協(xié)調(diào)。運動養(yǎng)生有多種形式，跑步是西方式運動鍛煉的一種普遍形式，而東方的太極拳、八段錦等緩慢運動甚至幾乎不動的站樁、瑜伽等也具有顯著的養(yǎng)生作用。不同運動對機(jī)體產(chǎn)生有益作用的差異和機(jī)制是什么？Litscher與張維波等曾初步比較了慢跑與打太極拳的心率變化，發(fā)現(xiàn)兩者的心率都有所增加，而慢跑者的平均心率更快，其心率變異性也有所不同[1]。

《靈樞·經(jīng)脈》講：“經(jīng)脈者，所以能決死生，處百病，調(diào)虛實，不可不通也。”認(rèn)為經(jīng)絡(luò)通暢是維持生命健康的基本條件。張維波根據(jù)組織液流動的達(dá)西定律和連續(xù)性方程，推測經(jīng)脈具有低流阻特性，存在組織液向經(jīng)脈的匯聚和沿經(jīng)脈的流動[2]；使用生物力學(xué)方法證明了經(jīng)脈的低流阻特性以及較低的組織液壓[3-5]，在人和小型豬上發(fā)現(xiàn)了循經(jīng)低流阻通道[2]。隨后，該團(tuán)隊使用阿爾新藍(lán)染料在透明魚上發(fā)現(xiàn)了類經(jīng)脈的遷移軌跡[6-7]，又使用熒光素鈉（sodium fluorescein，SF）和熒光照相法在大鼠任脈以及小型豬上發(fā)現(xiàn)了循經(jīng)遷移軌跡[8-9]，最新的研究在人體穴位上注射SF，發(fā)現(xiàn)了循經(jīng)的SF遷移軌跡[10]。一系列實驗證明，經(jīng)絡(luò)是存在于間質(zhì)中、具有低流阻特性的組織液通道，簡稱為“間質(zhì)通道”，該學(xué)說可稱為經(jīng)絡(luò)的間質(zhì)通道學(xué)說。

20世紀(jì)80年代，劉亦鳴等[11]發(fā)明了基于低頻脈沖阻抗測量原理的經(jīng)絡(luò)定位儀，?？傮J等[12]用該儀器發(fā)現(xiàn)了與古典經(jīng)脈線基本重合的循經(jīng)低電阻點（low im?pedance point，LIP）。90年代，穆祥等[13]用該儀器在小型豬上測出了循經(jīng)低電阻線（low impedance line along meridians，LILM），該測量逐漸成為動物經(jīng)絡(luò)定位普遍使用的方法。筆者前期已在麻醉的小型豬四肢上觀察到SF循經(jīng)遷移的現(xiàn)象，但麻醉狀態(tài)下小型豬的肢體完全不動，會影響淋巴管的自發(fā)收縮[14]，在麻醉濃度下的戊巴比妥鈉和氟烷會導(dǎo)致動物胸導(dǎo)管淋巴流量的減少，有時可能還會使毛細(xì)血管濾出量減少[15]；而在運動情況下，不管是主動運動還是被動運動，腿部的淋巴流是增加的[16-18]，間接說明了間質(zhì)中組織液量的增加。為了進(jìn)一步驗證運動對循經(jīng)間質(zhì)通道中組織液流動的影響，我們進(jìn)行了如下實驗：

1 材料與方法

1.1 實驗動物、飼養(yǎng)方法及分組

選用中國實驗用巴馬豬（北京市琉璃河科興實驗動物養(yǎng)殖中心）4 只（雄性2 只，雌性2 只），體重11 ±2 kg，實驗動物使用許可證號SCXK（京）2017-0003。每日提供濃縮飼料（希望飼料有限公司）：8:00 給料150 g，20:00給料100 g，飲水不限量，單籠飼養(yǎng)。動物房溫度20℃± 2℃，濕度50% ± 10%Rh。整個實驗獲中國中醫(yī)科學(xué)院針灸研究所倫理委員會批準(zhǔn)。小型豬進(jìn)行麻醉（麻醉組）、清醒原地運動（原地組）和清醒節(jié)律運動（節(jié)律組）三種狀態(tài)的同體比較（示蹤劑注射部位相同）。為方便在清醒狀態(tài)下注射，本實驗選取前肢外側(cè)中部的LILM 與后肢外側(cè)中部的LILM 為觀察部位。每只小豬的LILM 左右肢對稱各1 例，故每組含4只小豬共8例肢體LILM；后肢外側(cè)1例因1只小豬注射時掙扎，針頭脫出試劑污染皮膚表面不便觀察，故后肢外側(cè)每組7例。

1.2 主要儀器及試劑

3%戊巴比妥鈉（德國分裝，含量>99%），速眠新Ⅱ（吉林省華牧動物保健品有限公司），熒光素鈉（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），寵物跑步機(jī)C400WS（武義宇晟運動器械有限公司），WQ6F30 經(jīng)絡(luò)定位儀（北京海淀區(qū)東華電子儀器廠），5D Mark2 相機(jī)（日本Canon），MC UV 77 mm 窄帶濾色鏡（日本kenko），600EX Ⅱ-RT 閃光燈（日本Canon），F(xiàn)ilmer 600S LED燈（上海Starison），濾色紙（春興牌彩色燈光濾色片），玉兔聽診器（上海醫(yī)療器械有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 麻醉與循經(jīng)低電阻線的測定

使用3%的戊巴比妥鈉溶液（0.5 ml/kg）和速眠新Ⅱ（0.1 ml/kg）分別注射小型豬兩側(cè)臀部肌肉進(jìn)行麻醉。用電推剪去毛，暴露四肢部皮膚，有臟污處用75%的酒精棉球擦干凈、晾干。使用經(jīng)絡(luò)定位儀在小型豬四肢外側(cè)進(jìn)行LIP的定位，前肢從腕部到臂部沿四肢長軸間隔約1 cm 依次掃描，后肢從跖部到大腿部掃描，用彩筆給予標(biāo)記，這些點的連線稱為LILM[13]。

1.3.2 示蹤劑的注射

在小型豬清醒狀態(tài)下，由一人抱起小型豬，然后選取LILM 在腕踝部的一點作為注射點（節(jié)律組和原地組），用記號筆標(biāo)記，另一人用1 ml注射器垂直于皮膚表面刺入，深度3 mm，然后緩慢推注5%的SF 溶液0.4 ml；在小型豬麻醉情況下在相同標(biāo)記的注射點（麻醉對照組）用相同的注射手法在相同深度注射相同劑量的SF溶液作為對照。

1.3.3 小型豬麻醉、清醒原地運動和清醒節(jié)律運動三種狀態(tài)下的處置

小型豬注射SF 溶液，原地組在注射SF 后，將小型豬放置于特制的豬籠中，小型豬在籠中有一定的自由活動空間，存在輕微的原地運動。注射后50 分鐘時，將小型豬麻醉后放置于試驗臺上準(zhǔn)備拍照。節(jié)律組在注射SF后，將小型豬放置于動物跑步機(jī)上（圖1），將跑步機(jī)參數(shù)設(shè)定為0.8 km/h。小型豬以此參數(shù)在跑步機(jī)上行走3分鐘后，關(guān)閉機(jī)器，間歇休息1分鐘；重復(fù)此操作2 次后，將跑步機(jī)參數(shù)設(shè)定為1.0 km/h，小型豬再以此參數(shù)行走3 分鐘，關(guān)閉機(jī)器，間歇休息1 分鐘。重復(fù)此操作2 次，結(jié)束運動。將小型豬麻醉后放置于實驗臺準(zhǔn)備拍照。麻醉組注射SF后，在實驗臺上直接拍攝。3組均使用熒光照相法采集注射后60 min時的體表SF遷移軌跡圖像。

圖1 大型動物跑步機(jī)與小型豬運動圖

1.3.4 成像環(huán)境

環(huán)境溫度為25℃± 1℃，相對濕度30%～60%，室內(nèi)外通風(fēng)隔絕。在熒光劑注射及拍照過程中，室內(nèi)無陽光照射、無燈光，保持暗室狀態(tài)。

1.3.5 熒光照相法

小型豬放置于實驗臺上。在注射SF溶液后，使用Canon 5D2 數(shù)碼相機(jī)采集SF 的體表遷移軌跡圖像，鏡頭上安裝窄帶濾色鏡。相機(jī)鏡頭垂直對準(zhǔn)被觀察部位，距離0.5～1 m，手動調(diào)節(jié)焦距和曝光量。采用閃光燈組（1 個主控閃光燈+1 個從屬閃光燈）作為激發(fā)光源，主從閃光燈的燈頭均加裝藍(lán)色濾光紙。主控閃光燈與從屬閃光燈之間通過無線電傳輸進(jìn)行同步閃光。覆蓋有藍(lán)色濾光紙的3 個LED 燈放置于觀察部位周圍，用于輔助激發(fā)SF 以及照相機(jī)取景和對焦時的照明。見圖2。

圖2 熒光照相裝置示意圖

1.4 觀察指標(biāo)

麻醉組分別在注射前和注射后2、5、10、15、20、30、40、50、60 min 時，對小型豬四肢注射點部位一帶進(jìn)行熒光照相，觀察SF 體表遷移的動態(tài)軌跡；節(jié)律組待小型豬運動完并麻醉后，采集注射后60 min 時的熒光圖像；原地組待小型豬被麻醉后，采集注射后60 min 時的熒光圖像。測量60 min時前、后肢外側(cè)SF體表遷移軌跡的長度。用聽診器分別測量三種狀態(tài)下注射SF 20 min時的小型豬心率。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，計量資料用平均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用方差齊性檢驗，方差齊時，采用單因素方差分析；若數(shù)據(jù)為非正態(tài)分布或方差不齊時，采用Kruskal-Wallis H 檢驗。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 小型豬在麻醉、原地運動、節(jié)律運動三種狀態(tài)下的心率比較

三種狀態(tài)下的心率結(jié)果如表1所示，原地組比麻醉組的心率顯著升高（P<0.05），但升高幅度不大，其差異率的均值為18.31%（95%CI：13.02%，23.60%）。節(jié)律組比麻醉組的心率極顯著升高（P<0.001），其差異率均值高達(dá)66.90%（95%CI：61.49%，72.31%）；節(jié)律組比原地組的心率極顯著升高（P<0.001），其差異率均值為41.07%（95%CI：35.22%，46.92%）。參照人體有氧運動心率為最大心率的65%～85%之間，節(jié)律組的心率屬于輕度有氧運動，原地組與麻醉組的心率都屬于正常心率。

表1 小型豬三種狀態(tài)下心率的比較（ ± s）

表1 小型豬三種狀態(tài)下心率的比較（ ± s）

* P<0.05，*** P<0.001，與麻醉組比較；＃＃＃P<0.001，與原地組比較。

組別麻醉組原地組節(jié)律組例數(shù)8 8 8心率（bpm）71.00 ± 7.33 84.00 ± 12.28 *118.5 ± 9.3 ***＃＃＃

2.2 麻醉、原地運動、節(jié)律運動三種狀態(tài)下熒光素鈉遷移軌跡的比較

在小型豬前肢外側(cè)中部LILM 的腕踝處注射SF 溶液后，原地組、節(jié)律組及麻醉組均可觀察到以注射點為中心沿LILM方向出現(xiàn)的線狀遷移軌跡，其遷移長度如表2 所示。結(jié)果表明，與麻醉組比較，原地組與節(jié)律組SF 遷移軌跡長度均極顯著延長（P<0.001）。原地組與麻醉組的差異率均值為80.0%（95%CI：69.22%，90.64%），節(jié)律組與麻醉組的差異率均值為86.6%（95%CI：74.28%，98.97%）。原地組與節(jié)律組SF遷移軌跡的長度無顯著性差異。測量小型豬前肢的平均長度（從腕橫紋到腋橫紋）為14.2 cm，麻醉組平均遷移長度占前肢長度的百分比為21.1%；節(jié)律組平均遷移長度占前肢長度的百分比39.2%；原地組平均遷移長度占前肢長度的百分比為37.9%。典型圖像見圖3。

表2 前肢外側(cè)麻醉組、原地組與節(jié)律組SF遷移軌跡長度的比較（ ± s）

表2 前肢外側(cè)麻醉組、原地組與節(jié)律組SF遷移軌跡長度的比較（ ± s）

*** P<0.001，與麻醉組比較。

組別麻醉組原地組節(jié)律組例數(shù)8 8 8長度（cm）2.99 ± 0.61 5.38 ± 0.66 ***5.58 ± 0.94 ***

圖3 小型豬前肢外側(cè)麻醉、原地運動、節(jié)律運動三種狀態(tài)下SF遷移軌跡圖像

在后肢外側(cè)中部LILM 的腕踝處注射SF 液后，麻醉狀態(tài)下此處并未觀察到SF線狀遷移軌跡，但是在原地運動和節(jié)律運動情況下能觀察到SF 軌跡有一定的遷移趨勢（圖4）。原地組與節(jié)律組SF遷移軌跡的長度無顯著性差異。其遷移長度如表3所示。

表3 后肢外側(cè)原地組、節(jié)律組與麻醉組遷移長度的比較（ ± s）

表3 后肢外側(cè)原地組、節(jié)律組與麻醉組遷移長度的比較（ ± s）

組別麻醉組原地組節(jié)律組例數(shù)7 7 7長度（cm）0（未能觀測到線狀遷移軌跡）2.65 ± 0.74 2.51 ± 0.61

圖4 小型豬后肢外側(cè)麻醉、原地運動、節(jié)律運動三種狀態(tài)下SF遷移軌跡圖像

3 討論

觀察外周組織中的組織液（interstitial fluid，ISF）流動情況尚無成熟的方法，李學(xué)義和王偉等[19]采用注射磁顯葡胺于相對封閉的腦區(qū)，然后用磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）觀察磁示蹤劑信號隨時間的衰減，間接推斷組織液的流動。SF 與水有高度親和，是理想的組織液示蹤劑。本實驗采用皮下注射SF，通過特定波長的激發(fā)光激發(fā)SF 發(fā)出熒光，再使用含窄帶濾波的照相機(jī)顯示SF在體表的流動特征，這種活體組織液可視化技術(shù)是組織液研究的一個方法學(xué)創(chuàng)新。本實驗主要觀測對象是肢體外側(cè)的熒光遷移軌跡，主要原因是操作的限制，小型豬需在清醒狀態(tài)下注射SF 溶液，受限于小型豬保定技術(shù)，只能注射在小型豬肢體外側(cè)面。

本研究發(fā)現(xiàn)，在清醒狀態(tài)下，無論是原地運動還是節(jié)律運動，SF 的遷移軌跡均比麻醉狀態(tài)的軌跡明顯延長，提示動物的麻醉狀態(tài)對組織液的定向流動有抑制作用，其機(jī)制可能與麻醉狀態(tài)下肌肉活動度降低以及呼吸的減弱有關(guān)。外周的組織液多存在于肌肉與肌肉或肌肉與皮膚的間隙中，肌肉的緊張收縮可導(dǎo)致間隙的變化，進(jìn)而產(chǎn)生推動組織液流動的壓力梯度。又因為動物在清醒站立時，肌肉除了產(chǎn)生維持姿勢的等長收縮外，還會因原地走動而產(chǎn)生間歇的運動興奮，形成脈沖式的壓力波，推動組織液流動，而麻醉下的動物，不具備上述兩種肌肉興奮，故SF的遷移路線較短[20]。

動物在清醒情況下做節(jié)律性地跑步，雖然是在跑步機(jī)上，但可認(rèn)為與實際的移動式跑步效果相當(dāng)。因此，動物的肌肉特別是腿部的肌肉會出現(xiàn)節(jié)律性的收縮，產(chǎn)生推動組織液流動的動力，其SF 遷移軌跡長度顯著長于麻醉組。但本研究發(fā)現(xiàn)，雖然節(jié)律組與原地組在心率變化上已經(jīng)有了極顯著的差異，表明節(jié)律組的肌肉活動強(qiáng)度應(yīng)該遠(yuǎn)高于原地組，但是節(jié)律組的SF遷移軌跡長度并沒有比原地組顯著增加。此結(jié)果提示，組織液的長程定向流動并不完全取決于肌肉活動的強(qiáng)度，可能還與毛細(xì)血管濾出量、間質(zhì)流阻甚至呼吸等多種因素有關(guān)，有待深入研究。

本研究還發(fā)現(xiàn)，原地組在與麻醉組的心率差異不大的情況下，SF遷移軌跡有極顯著增加，而節(jié)律組的心率極顯著高于原地組，但SF 的遷移長度卻幾乎相等，說明心臟“泵”的作用主要作用于脈管內(nèi)的血液，對脈管外的組織液流動沒有明顯影響，心臟的節(jié)律性收縮不是組織液長程定向流動的主要動力。

另外在前期的實驗中發(fā)現(xiàn)[9]，麻醉狀態(tài)下的小型豬在其后肢外側(cè)面體表難以觀測到SF遷移軌跡，但本實驗?zāi)苡^察到在運動后后肢外側(cè)面SF 軌跡有遷移的趨勢（圖4），雖然沒有典型的線狀遷移，但是說明運動能在一定程度上促使后肢的SF軌跡遷移延長。

研究表明，肢體的主動和被動收縮或運動可以促進(jìn)組織液的流動。讓麻醉的狗做被動的蹬車運動，可以確切地觀察到從后爪流出較多的并且是相對穩(wěn)定的組織液[16]。對于肢體的主動收縮，骨骼肌的收縮可以對集合淋巴管產(chǎn)生一個直接的擠壓效果。為了支持這一假說，Reed 等[17]觀察到，將放射性標(biāo)記的白蛋白注射到皮下或肌肉中，正?；顒拥那逍训拇蟀资?，其白蛋白清除率比麻醉狀態(tài)下高3 到4 倍。白蛋白的清除率反映了白蛋白順著組織液通道從組織間隙進(jìn)入淋巴管，再通過淋巴循環(huán)被代謝掉的過程，清除率的提高對應(yīng)局部淋巴流量的增加。這一增加可能反映了對淋巴流推動的一個刺激，但比起毛細(xì)血管凈濾出液（組織液）的增加來說，它可能還是次要的，正如在皮膚和肌肉中標(biāo)記的白蛋白從血漿到間質(zhì)中的運輸出現(xiàn)類似的增加那樣[18]。與24 小時臥床相比，人在每天進(jìn)行2 小時身體鍛煉的情況下，同樣可以使白蛋白在脛骨前皮膚的清除率增加20%[17]。這些均提示運動能促進(jìn)組織液量的增加。本實驗觀察到的運動使SF 遷移軌跡延長的作用，也反過來說明運動可促使組織液流量的增加。

王偉等[21]觀察到，大鼠運動后，其興奮腦區(qū)的組織液流動加速，提示運動不僅可以促進(jìn)運動肢體的組織液流動，還能對其它部位產(chǎn)生影響。整個人體的間質(zhì)通道都富含流動的組織液，組織液的流動與人體的生理和病理狀態(tài)顯著相關(guān)。有研究顯示，體外痛覺刺激及帕金森病、阿爾茲海默癥等疾病均可導(dǎo)致組織液流動發(fā)生顯著改變，流速減緩[22]。李宏彥等[23]觀察到針刺補法可以促進(jìn)局部組織液壓升高，增加組織液向局部的匯聚，促進(jìn)組織液的流動，達(dá)到補虛的作用。

運動是維護(hù)人體健康的主要方式之一。本研究發(fā)現(xiàn)，輕微原地運動和節(jié)律性運動與麻醉狀態(tài)下的不運動相比，對四肢組織液的循經(jīng)流動均有明顯的促進(jìn)作用，從經(jīng)絡(luò)健康和組織液流變學(xué)的角度說明了生命運動的重要性。但如何運動才能最好地促進(jìn)健康？跑步是很多人采用的保健方式，其特點在于腿部肌肉以節(jié)律性等張收縮的方式拉動關(guān)節(jié)的屈張，進(jìn)而形成推動身體水平運動的動力。由于肌肉長度發(fā)生了變化，力與力移動的距離相乘所代表的作功需通過心率和呼吸加快提供相應(yīng)的能量，但其骨骼肌和心肌活動的加強(qiáng)可產(chǎn)生乳酸等代謝物，堵塞經(jīng)絡(luò)間質(zhì)通道[24]。中國傳統(tǒng)體育不太強(qiáng)調(diào)肌肉的節(jié)律性運動，太極拳和八段錦等傳統(tǒng)體育多為原地的小范圍慢速運動，運動頻率和幅度遠(yuǎn)小于跑步，其肌肉的收縮方式多為維持姿勢的等長收縮，需要的能量較少，產(chǎn)生的代謝廢物也相應(yīng)較少。本實驗表明，這兩種運動都可推動組織液定向流動，使SF 遷移加長，而原地運動的心率遠(yuǎn)低于節(jié)律運動，對保護(hù)心臟、減少代謝廢物的形成更加有利。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，輕微的原地運動和節(jié)律性運動與麻醉狀態(tài)下的不運動相比，均可以促進(jìn)組織液長程的定向流動，從中醫(yī)養(yǎng)生和組織液流變學(xué)的角度說明了運動對生命健康的重要性；心臟的節(jié)律性收縮不是組織液長程定向流動的主要動力，為如何挑選合適的運動來促進(jìn)健康作出了提示。