液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀測定動物源性食品中 21種殺菌劑殘留量的方法研究

◎ 湯苗苗，郭良起，張曉莉，孫 晶，侯 賽

（河南廣電計量檢測有限公司，河南 鄭州 450000）

殺菌劑一般是指用于防治由各種病原微生物引起植物病害的農(nóng)藥。隨著現(xiàn)代殺菌劑的開發(fā)和大規(guī)模應(yīng)用，病害對殺菌劑的抗性越來越強(qiáng)，病害的抗性發(fā)展要求必須不斷開發(fā)殺菌活力更強(qiáng)，殺菌譜更廣的殺菌劑，殺菌劑已成為近年來農(nóng)藥研發(fā)的熱點(diǎn)之一。而隨著殺菌劑的開發(fā)及使用，其殘留物可隨著飼料的消耗轉(zhuǎn)移至動物組織中，繼而可能存在于生乳、動物肌肉等動物源產(chǎn)品中，最終通過食物鏈對人類產(chǎn)生危害。為此，有必要針對動物源性食品中殺菌劑殘留檢測方法進(jìn)行深入研究，對其殘留量進(jìn)行監(jiān)測，以確保消費(fèi)者的身體健康。

目前，對殺菌劑的研究多為植物源食品及土壤、水體中的殘留，針對動物源食品中各類殺菌劑的殘留研究較少，且對殺菌劑殘留研究也多為常規(guī)農(nóng)藥（有機(jī)磷、有機(jī)氯及擬除蟲菊酯等）[1-6]。針對目前研發(fā)及使用率較高的殺菌劑，如酰胺類殺菌劑（苯并烯氟菌唑、吡噻菌胺、吡唑萘菌胺和氟吡菌胺）、甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑（吡唑醚菌酯、醚菌酯、嘧菌酯）等殺菌劑在動物源性食品中均未見系統(tǒng)研究。本研究采用PSA+C18復(fù)合填料凈化結(jié)合高效液相色譜 - 串聯(lián)質(zhì)譜（High Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry，HPLC-MS/MS)建立了同時檢測動物源性食品中21種殺菌劑的檢測方法，可以為相關(guān)食品制定國家標(biāo)準(zhǔn)提供技術(shù)支持，同時為國家監(jiān)管相應(yīng)動物源性食品提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：從超市/農(nóng)貿(mào)市場購買的牛肉、生牛乳及乳粉，將牛肉樣品勻漿、生牛乳混勻后備用。

試劑：QuEChERS分散萃取填料為安捷倫科技有限公司生產(chǎn)；乙腈、甲醇、乙酸銨均為色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司生產(chǎn)。

21種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：嘧霉胺、2-苯胺基-4,6-二甲基嘧啶-5-羥基（嘧霉胺-5-羥基）、嗪氨靈、丙硫菌唑、脫硫丙硫菌唑、苯醚甲環(huán)唑、苯醚甲環(huán)唑醇、三唑醇、三唑酮、苯菌酮、苯并烯氟菌唑、吡唑萘菌胺、氟吡菌胺、嘧菌酯、醚菌酯、吡唑醚菌酯、氟硅唑、丙環(huán)唑、吡噻菌胺、咪鮮胺和嘧菌環(huán)胺，天津阿爾塔科技有限公司生產(chǎn)。

儀器：Waters TQ-S micro高效液相色譜-串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜儀配電噴霧離子源（ESI），美國Waters公司；ME204E/02分析天平，上海梅特勒-拖利多儀器有限公司；CT14RDП臺式高速冷凍離心機(jī)，上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司；MnltiReax振蕩器，德國Helidolph公司，AS系列超聲波清洗儀，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；Milli-Q Advantage A10純水機(jī)，美國Merck Millipore公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液配制

①混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。取一定量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于100 mL容量瓶中，用乙腈定容，配制成1.0 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液。②混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。吸取混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液1.0 mL混合于10 mL容量瓶中，用乙腈定容，配制成0.1 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。③基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。用空白基質(zhì)溶液配制成0.5～20.0 μg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 儀器條件

色譜條件：色譜柱ACQUITY UPLC? BEH C18，1.7 μm，2.1 mm×100 mm；柱 溫40 ℃；流 速：0.3 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL；流動相A為2 mmol·L-1乙酸銨（含0.1%甲酸），B為乙腈；洗脫程序：0～2 min，5%B；2～4 min，5%～100%B；4～7 min，100%B；7.0～7.1 min，100%～5%B；7.1～8.0 min，5%B。

質(zhì)譜條件：電噴霧正離子模式；多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）采集，毛細(xì)管電壓2.80 kV，離子源溫度150 ℃，脫溶劑溫度500 ℃，脫溶劑氣流量800 L·h-1。定性離子對、定量離子對、碰撞能量和錐孔電壓見表1。

表1 21種化合物質(zhì)譜檢測參數(shù)表

續(xù)表1

1.2.3 樣品前處理

（1）生牛乳、牛肉。①生牛乳樣品，混合均勻；牛肉樣品勻漿。②分別取5 g樣品于50 mL聚乙烯離心管中，加入10 mL 0.2%甲酸乙腈、5 g氯化鈉，渦旋振蕩提取，離心分層，轉(zhuǎn)移上清液，殘留物用10 mL 0.2%甲酸乙腈重復(fù)提取，離心后合并上清液備用。

（2）乳粉。①取5 g于50 mL聚乙烯離心管中，加入5 mL水混勻浸泡30 min，加入10 mL 0.2%甲酸乙腈、5 g氯化鈉，渦旋振蕩提取，離心分層，殘留物用10 mL 0.2%甲酸乙腈重復(fù)提取，離心后合并上清液備用。②凈化。取2.0 mL提取液于含100 mg C18和100 mg PSA的10 mL離心管中，渦旋1 min，離心5 min，取上清液過0.22 μm濾膜，供HPLC-MS/MS分析。

1.2.4 方法的準(zhǔn)確度和精密度

取牛肉、生牛乳及乳粉5 g，分別添加10 μg·kg-1、20 μg·kg-1、40 μg·kg-13個濃度水平，按“1.2.3”進(jìn)行前處理操作，每個濃度進(jìn)行3個樣本分析，24 h內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線同時進(jìn)行，計算24 h內(nèi)精密度。

1.2.5 方法適用性

隨機(jī)選取市場上生牛乳、純牛奶、乳粉和牛肉各5份，按“1.2.3”進(jìn)行前處理操作。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的準(zhǔn)確度和精密度

由表2知，21種殺菌劑的回收率范圍在70.0%～120.0%，精密度均小于10%，說明該方法準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性好。

表2 方法的精密度和回收率表（n=6）

續(xù)表2

2.2 方法的適用性

采用本實(shí)驗(yàn)建立的方法測定了采集市場上生牛乳、純牛奶、乳粉、牛肉各5份，均低于LOQ，檢出率和超出率為0。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍

在最低添加回收水平下，以3倍和10倍信噪比結(jié)合濃度外推法確定方法檢出限（LOD）和定量限（LOQ）。以滿足方法學(xué)要求的最低添加濃度作為定量限，在0.5～20.0 μg·L-1線性關(guān)系良好，r＞0.995，方法檢出限為0.7 μg·kg-1，方法定量限為2.0 μg·kg-1。滿足《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763—2021）的要求。

2.4 樣品提取劑選擇及優(yōu)化

本研究考察了乙腈、80%乙腈（含0.2%甲酸）、1%甲酸乙腈、0.1%甲酸乙腈和0.2%甲酸乙腈為提取液時對目標(biāo)物的提取效率。通過加標(biāo)回收法，在空白基質(zhì)中加入有代表性的7種殺菌劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，加標(biāo)水平均為20 μg·kg-1，靜置24 h后加入20 mL提取液，5種溶液在生牛乳、乳粉、牛肉的提取效率見圖1～圖3。由比對結(jié)果知，0.2%甲酸乙腈提取的回收率較高，因此選擇0.2%甲酸乙腈作為提取溶劑。同時考慮乳粉直接用溶劑提取會出現(xiàn)結(jié)塊現(xiàn)象，將奶粉用水浸泡溶解后提取，不再結(jié)塊，且提取效果提高約20%。

2.5 凈化方式的比較和選擇

考慮動物源性食品中存在磷脂、蛋白質(zhì)、脂肪干擾部分化合物分析定量，需要凈化去除干擾。常用的PSA吸附劑為弱陰離子交換填料，能有效去除基質(zhì)中糖類、脂肪酸等物質(zhì)；C18吸附劑為硅膠基質(zhì)鍵合十八烷基填料，具有比表面積大、吸附能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，能夠較好除去脂類、脂肪等非極性物質(zhì)的干擾。選擇PSA、C18、PSA和C18復(fù)合、Oasis PRiME HLB柱凈化，以監(jiān)測磷脂信息比較凈化效果，最終選擇PSA+C18（1+1）復(fù)合凈化方式。

2.6 基質(zhì)效應(yīng)的影響與校正

用不同的基質(zhì)按照前處理方法凈化后得到的上清液配制標(biāo)準(zhǔn)溶液為基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，用溶劑配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液作為溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過測定該21種殺菌劑在各基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液中校正曲線的斜率（A）及其在純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液中校正曲線的斜率（B），得到基質(zhì)效應(yīng)（Matrix Effect，ME），ME=（A-B）/B×100%。根據(jù)文獻(xiàn)[6-7]的研究，當(dāng)-50%≤ME＜-20%或20%＜ME≤50%時，為中等程度的基質(zhì)干擾效應(yīng)；當(dāng)ME＜-50%或ME＞50%，表示基質(zhì)干擾程度強(qiáng)烈。

21種殺菌劑基質(zhì)效應(yīng)如圖4所示，結(jié)果表明，不同農(nóng)藥基質(zhì)效應(yīng)不同，同種農(nóng)藥在不同基質(zhì)中基質(zhì)效應(yīng)也不同，大部分干擾為中等或者強(qiáng)烈程度，因此基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液定量非常重要。

3 結(jié)論

本項(xiàng)目建立了一種同時檢測動物源性食品中21種殺菌劑的檢測方法，該方法具有安全高效、快速準(zhǔn)確、易實(shí)現(xiàn)自動化等特點(diǎn)，對目標(biāo)化合物的加標(biāo)回收率達(dá)到70%～120%，24 h內(nèi)精密度和穩(wěn)定性測試RSD≤10%，方法重現(xiàn)性高，且檢出限能滿足國家標(biāo)準(zhǔn)中對牛肉、生牛乳及乳粉中殺菌劑限量的最低要求。