樞經(jīng)推拿對慢性神經(jīng)病理性疼痛大鼠VGLUT2及炎癥因子表達的影響

王雄將，梁英業(yè)，盧棟明，唐宏亮，夏 天*

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023；3.防城港市中醫(yī)醫(yī)院，廣西 防城港 538000）

神經(jīng)病理性疼痛（neuropathic pain，NPP）是由于軀體感覺神經(jīng)系統(tǒng)的損傷或疾病而直接造成的疼痛［1］，因其常引起自發(fā)性疼痛、痛覺過敏和痛覺異常等［2］，傳統(tǒng)藥物難以徹底消除疼痛，且長期口服藥物容易產(chǎn)生各種不良反應(yīng)［3-4］。推拿產(chǎn)生的刺激由神經(jīng)傳導(dǎo)［5］，本課題組前期研究證實推拿具有較好的鎮(zhèn)痛效果，推拿組大鼠經(jīng)10 d 推拿干預(yù)后，細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）水平明顯低于L5 脊神經(jīng)結(jié)扎（SNL）造模組，表明推拿可以下調(diào)ERK的水平［6-7］。另有研究發(fā)現(xiàn)，疼痛的發(fā)生和傳遞可由脊髓背角的ERK通路調(diào)控，一旦ERK信號通路被抑制，脊髓背角神經(jīng)元內(nèi)囊泡谷氨酸轉(zhuǎn)運體（vesicular glutamate transporters，VGLUTs）的表達水平也明顯下降［8-9］。谷氨酸（Glu）作為一種興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，可以感知、傳導(dǎo)和調(diào)控外周疼痛信息，與神經(jīng)病理性疼痛密切相關(guān)，VGLUTs 作為Glu 轉(zhuǎn)運體參與Glu 能神經(jīng)傳遞過程，與疼痛密切相關(guān)［10］；目前已知VGLUTs2型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運體（VGLUT2）表達更為活躍，可通過介導(dǎo)谷氨酸的釋放來參與疼痛傳導(dǎo)［11-13］。本實驗研究樞經(jīng)推拿對SNL大鼠脊髓背角VGLUT2的影響，為探討推拿的鎮(zhèn)痛機制提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 動物 SPF 級SD 大鼠72 只，雄性，體質(zhì)量250～300 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0004；使用許可證：SYXK（桂）2019-0001。飼養(yǎng)環(huán)境：單籠喂養(yǎng)，溫度為20～25 ℃，光照時間：8:00～20:00；空氣濕度：35%～45%。予自由飲用自來水，飼用普通清潔鼠飼料，保持環(huán)境清潔。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后進行實驗。

1.2 試劑 兔抗鼠VGLUT2（批號：ab217943，英國Abcam）；兔抗p-actin（批號：ab209857，1∶1 000，英國Abcam）；慢病毒HBLV-r-Slc17a6 shRNA1-GFP-PURO［漢恒生物科技（上海）有限公司］。

1.3 儀器 熱板痛覺測試儀（型號：Hot Plate Analgesia test；美國IITC Life Science）；von Frey 纖維絲（美國Stoelting）；二氧化碳恒溫孵育箱（型號：Form311；美國Forma）；組織包埋機（型號：HistoStar；美國Thermo）；石蠟切片機（型號：RM2135；德國Leica）；酶標(biāo)儀（型號：1691130A；美國Bio-Rad）；ImageQuant LAS 4000mini凝膠成像系統(tǒng)（型號：ImageQuant LAS 4000mini，美國GE）；電泳儀（型號：powerpad系列；美國Bio-Rad）。

2 方 法

2.1 動物分組與造模 將72 只SD 大鼠隨機分為空白組、假手術(shù)對照組、SNL 模型組各16 只及慢病毒干擾組、假推拿組、樞經(jīng)推拿組各8只。參照課題組前期研究的結(jié)扎L5 脊神經(jīng)致神經(jīng)病理性痛的造模方法［14］，分別對SNL模型組、慢病毒干擾組、假推拿組和樞經(jīng)推拿組大鼠進行造模處理。按4 ml/kg 體質(zhì)量給予10%的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，將第6 腰椎脊椎左側(cè)橫突分離暴露出來，使用咬骨鉗將橫突和錐體切斷，分離筋膜軟組織即可見到兩根平行走向的脊神經(jīng)，將內(nèi)側(cè)支分離出來并用5-0的縫合線（廣州博達醫(yī)療用品有限公司）雙層結(jié)扎，最后縫合皮膚。造模后的大鼠出現(xiàn)術(shù)側(cè)后肢外翻狀及不敢著地，在無任何刺激的情況下，可以觀察到大鼠出現(xiàn)自發(fā)性的抬足、跛行、趾間距變窄等現(xiàn)象［15］，再結(jié)合大鼠機械痛域及熱痛域檢測，可以判斷SNL 模型是否成功。假手術(shù)對照組大鼠參照SNL 造模方法僅找到兩根平行走向的脊神經(jīng)后暴露創(chuàng)面數(shù)分鐘，并不予分離和結(jié)扎脊神經(jīng)，最后同造模組操作縫合皮膚。

2.2 干預(yù)方法 樞經(jīng)推拿組、假推拿組及慢病毒干預(yù)組在造模7 d 后開始干預(yù)，空白組、假手術(shù)對照組和SNL模型組不進行干預(yù)，正常喂養(yǎng)及觀察10 d。

2.2.1 樞經(jīng)推拿組 選用布袋束縛大鼠，暴露大鼠的雙后肢。操作儀器為推拿手法模擬儀（專利號：ZL 200710187403.1），選用直徑10 mm 的圓形按摩頭，手法選用點、撥、揉法；刺激力量為4 N，作用于大鼠雙側(cè)環(huán)跳、風(fēng)市、陽陵泉；每種手法每個穴位干預(yù)時長為1 min，每只大鼠總計干預(yù)18 min，連續(xù)干預(yù)10 d。

2.2.2 假推拿組 采用大鼠固定器固定假推拿組大鼠，操作人員用手指輕撫大鼠后背，每鼠每日干預(yù)18 min，連續(xù)10 d。

2.2.3 慢病毒干擾組 參照課題組前期研究［16］，將大鼠麻醉后，定位大鼠兩側(cè)髂前上棘，在兩點連線的中點作一縱行切口，長約2 cm，充分暴露椎間隙，然后使用22G 針頭緩慢插入椎間隙，同時觀察該大鼠尾巴是否有搖尾現(xiàn)象，若有，則立即拔出針頭，然后將PE-10 導(dǎo)管從椎間隙插入約3 cm，若出現(xiàn)腦脊液從導(dǎo)管流出，即確認(rèn)注射位置。用微量注射吸取0.5 μl 的慢病毒試劑，從PE-10 導(dǎo)管緩慢注射慢病毒。慢病毒試劑僅注射1次。

2.3 觀察指標(biāo)及檢測方法

2.3.1 行為學(xué)檢測 行為學(xué)檢測包括熱痛覺閾值測定、機械痛覺閾值測定和運動功能測定。在造模7 d后分別對空白組、假手術(shù)對照組和SNL 模型組進行第一次行為學(xué)檢測，干預(yù)10 d 后對全部組劑進行第二次行為學(xué)檢測。使用熱板痛覺測試儀記錄大鼠熱痛縮足反應(yīng)潛伏期（TWL）［17］；使用不同粗細(xì)的von-Frey纖維絲刺激大鼠左后足的中央部足底，觀察大鼠是否出現(xiàn)縮足反應(yīng)，以此來記錄大鼠的機械性刺激痛閾值［18］；采用斜板實驗［7］觀測各組大鼠的運動功能情況。行為學(xué)檢測后均參照課題組前期研究的方法［16］，予過量的10%水合氯醛腹腔注射麻醉對大鼠實施安樂死，腹主動脈采血，收集其脊髓腰膨大段以備用。

2.3.2 免疫組化法檢測VGLUT2 表達水平 將大鼠脊髓背角組織使用酒精逐級脫水，透明，浸蠟包埋，切片處理。然后將切片浸入環(huán)保型透明液Ⅰ、Ⅱ各30 min進行脫蠟，再用酒精進行水化。先后用3%過氧化氫、EDTA 修復(fù)液修復(fù)抗原，5%BSA 封閉液在室溫下封閉孵育，滴加兔抗鼠VGLUT2（一抗，1∶500）4 ℃過夜。加入二抗37 ℃孵育30 min，依次使用SABC試劑、DAB顯色液滴加到組織上顯色，蘇木素染液復(fù)染。最后切片酒精逐級脫水、透明、封片處理。

2.3.3 Western blot 法檢測VGLUT2 的表達水平 提取大鼠脊髓背角組織的總蛋白，測定蛋白濃度。電泳分離蛋白質(zhì)樣品（25 μg）后轉(zhuǎn)移至0.45 μm PVDF 膜。將PVDF 膜與一抗在4 ℃下孵育過夜：兔抗鼠VGLUT2（1∶1 000），兔抗p-actin（1∶1 000）；再加入相應(yīng)的二抗（1∶1 000）孵育1 h。使用BeyoEcl plus發(fā)光液進行顯影。

2.3.4 ELISA法檢測IL-6及TNF-α水平 按照ELISA試劑盒說明書檢測各組大鼠血清中IL-6及TNF-α的水平。

2.3.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用方差分析，均數(shù)間多重比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 各組大鼠干預(yù)前后行為學(xué)比較

3.1.1 各組大鼠熱痛覺閾值比較 見表1。造模7 d 后，與空白組比較，SNL 模型組大鼠熱痛覺閾值明顯降低（P＜0.05），而假手術(shù)對照組無顯著差異（P＞0.05）。干預(yù)10 d 后，SNL 模型組大鼠熱痛覺閾值較空白組明顯降低（P＞0.05）；與SNL 模型組比較，假手術(shù)對照組、樞經(jīng)推拿組、慢病毒干擾組大鼠熱痛覺閾值顯著升高（P＜0.05）。

表1 各組大鼠熱痛覺閾值比較 （s，±s）

表1 各組大鼠熱痛覺閾值比較 （s，±s）

注：與空白組比較，①P＜0.05；與SNL模型組比較，②P＜0.05

組 別空白組SNL模型組假手術(shù)對照組假推拿組樞經(jīng)推拿組慢病毒干擾組n 8 8 8 8 8 8熱痛覺閾值造模7 d后5.13±0.79 4.18±0.41①5.56±0.78—____干預(yù)10 d后5.56±0.72 3.51±0.40①5.54±0.51②3.72±0.20 5.04±0.62②4.91±0.25②

3.1.2 各組大鼠機械刺激痛閾值比較 見表2。造模7 d 后，與空白組比較，SNL 模型組大鼠機械刺激痛閾值明顯降低（P＜0.05），而假手術(shù)對照組無顯著差異（P＞0.05）。干預(yù)10 d 后，SNL 模型組大鼠機械刺激痛閾值較空白組明顯降低（P＜0.05）；與SNL 模型組比較，假手術(shù)對照組、樞經(jīng)推拿組、慢病毒干擾組大鼠機械刺激痛閾值顯著升高（P＜0.05）。

表2 各組大鼠機械刺激痛閾值比較 （g，±s）

表2 各組大鼠機械刺激痛閾值比較 （g，±s）

注：與空白組比較，①P＜0.05；與SNL模型組比較，②P＜0.05

組 別空白組SNL模型組假手術(shù)對照組假推拿組樞經(jīng)推拿組慢病毒干擾組n 8 8 8 8 8 8機械刺激痛閾值造模7 d后51.41±11.65 21.90±4.90①51.79±14.20—— —— ——干預(yù)10 d后48.75±12.32 23.25±3.79①52.58±14.97②24.67±5.24 45.54±16.05②51.38±8.32②

3.1.3 各組大鼠運動功能結(jié)果 見表3。造模7 d后，與空白組比較，SNL 模型組和假手術(shù)對照組大鼠斜板角度顯著降低（P＜0.05）。干預(yù)10 d 后，各組斜板角度比較無顯著性差異（P＞0.05）。

表3 各組大鼠運動功能結(jié)果 （度，±s）

表3 各組大鼠運動功能結(jié)果 （度，±s）

注：與空白組比較，①P＜0.05

組 別空白組SNL模型組假手術(shù)對照組假推拿組樞經(jīng)推拿組慢病毒干擾組n 8 8 8 8 8 8斜板角度造模7 d后45.67±1.13 34.31±3.65①35.31±2.32①————干預(yù)10 d后45.54±2.43 44.00±3.23 45.86±1.88 43.13±3.29 46.67±2.22 44.88±2.51

3.2 各組大鼠干預(yù)前后VGLUT2的表達水平比較

3.2.1 免疫組化結(jié)果 見圖1、圖2 和表4。檢測結(jié)果顯示，VGLUT2 的表達位置為脊髓組織中間帶神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)（漿），表現(xiàn)為棕黃色顆粒，顯色的深淺代表的是VGLUT2 表達量的高低。按照免疫組化試劑盒說明書，采用半定量分析法，通過顯色深淺將VGLUT2 的蛋白水平分為弱陽性（±）、陽性（+）、較強陽性（++）、強陽性（+++）四個等級。

圖1 各組造模7 d后脊髓神經(jīng)元內(nèi)VGLUT2免疫組化圖

圖2 各組干預(yù)10 d后脊髓神經(jīng)元內(nèi)VGLUT2免疫組化圖

表4 各組干預(yù)前后脊髓神經(jīng)元內(nèi)VGLUT2的表達情況（只）

3.2.2 Western blot檢測結(jié)果 見圖3、圖4和表5。

圖3 各組造模7 d后脊髓神經(jīng)元內(nèi)的VGLUT2表達

圖4 各組干預(yù)10 d后脊髓神經(jīng)元內(nèi)的VGLUT2表達

表5 各組大鼠VGLUT2的蛋白表達量 （±s）

表5 各組大鼠VGLUT2的蛋白表達量 （±s）

注：與空白組比較，①P＜0.05；與SNL 模型組比較，②P＜0.05

組 別空白組SNL模型組假手術(shù)對照組假推拿組樞經(jīng)推拿組慢病毒干擾組n 8 8 8 8 8 8灰度比值（VGLUT2/β-actin）造模7 d后0.45±0.12 1.23±0.18①0.82±0.23①②————干預(yù)10 d后0.43±0.02 1.18±0.17①0.44±0.14②1.09±0.18 0.45±0.04②0.26±0.11②

表4結(jié)果顯示，與空白組造模7 d及干預(yù)10 d后比較，SNL 模型組大鼠VGLUT2 的蛋白表達量明顯升高（P＜0.05）；干預(yù)10 d 后，與SNL 模型組比較，假手術(shù)對照組、樞經(jīng)推拿組及慢病毒干擾組的VGLUT2 的蛋白表達量均明顯降低（P＜0.05）。

3.3 各組大鼠血清IL-6及TNF-α水平比較 見表6。與空白組造模7 d 后及干預(yù)10 d 后比較，SNL 模型組大鼠血清IL-6及TNF-α水平均顯著升高（P＜0.05）；干預(yù)10 d 后，與SNL 模型組比較，假手術(shù)對照組、樞經(jīng)推拿組和慢病毒干擾組IL-6 及TNF-α 水平均顯著降低（P＜0.05）；樞經(jīng)推拿組和慢病毒干擾組IL-6及TNF-α的水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表6 各組大鼠血清中IL-6、TNF-α的水平比較 （pg/mg，±s）

表6 各組大鼠血清中IL-6、TNF-α的水平比較 （pg/mg，±s）

注：與空白組比較，①P＜0.05；與SNL模型組比較，②P＜0.05；與慢病毒干擾組比較，③P＞0.05

組 別空白組SNL模型組假手術(shù)對照組假推拿組樞經(jīng)推拿組慢病毒干擾組n 8 8 8 8 8 8 IL-6水平造模7 d后30.91±0.57 86.73±5.06①53.46±2.30①②————干預(yù)10 d后31.25±0.43 90.59±4.68①46.31±1.96②83.51±1.20 59.06±4.88②③62.14±3.58②TNF-α水平造模7 d后130.75±2.02 206.04±4.27①155.37±8.28①②————干預(yù)10 d后129.74±2.18 225.77±5.80①137.55±6.32②202.67±6.56 162.85±4.89②③168.49±4.34②

4 討 論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，疼痛的病因不外乎“不通則痛”及“不榮則痛”。“不通則痛”是外感邪毒、氣滯、痰阻、血瘀等致經(jīng)脈閉阻不通，陰陽之氣相搏，氣血逆亂，攻沖經(jīng)脈而出現(xiàn)疼痛；“不榮則痛”是各種原因?qū)е碌臍?、血、陰、陽虛損，使臟腑、經(jīng)脈失于溫煦、滋潤、濡養(yǎng)而發(fā)生的疼痛。推拿可通過疏通瘀阻、補益氣血以達到氣血調(diào)和、止痛的目的?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》中最早提出“開闔樞”理論，樞之本義為軸，為關(guān)鍵，重點之意。樞經(jīng)主開合一身氣血陰陽，使得氣機舒暢。對于氣血不通導(dǎo)致的疼痛，樞經(jīng)推拿通過干預(yù)足少陽膽經(jīng)，可以樞轉(zhuǎn)氣機、行氣活血，以達通則不痛之功效［19］。其中，經(jīng)穴陽陵泉為八脈交會穴之筋會，為筋氣聚集之所，具有通經(jīng)活絡(luò)、舒筋壯骨的效果。環(huán)跳穴為膽經(jīng)腧穴，屬足少陽、太陽經(jīng)交會穴，可同時疏通太陽、少陽兩經(jīng)之氣，氣行則瘀血消散，通則不痛。風(fēng)市穴同為膽經(jīng)腧穴，其解剖位置在坐骨神經(jīng)干分布區(qū)，神經(jīng)病理性疼痛多以神經(jīng)干分布區(qū)出現(xiàn)疼痛為主，刺激該穴能疏經(jīng)止痛。故樞經(jīng)推拿干預(yù)足少陽膽經(jīng)，基于“樞統(tǒng)開闔”之理論，通過樞轉(zhuǎn)表里之氣，使氣暢血行，全身經(jīng)絡(luò)通暢，痛癥自除。

NPP 造成的疼痛往往難以有效緩解，有研究表明，NPP 的產(chǎn)生機制包括離子通道的改變、外周敏化、中樞敏化等［20］，研究其疼痛的產(chǎn)生機制有助于指導(dǎo)臨床治療。谷氨酸是一種能感知、傳導(dǎo)和調(diào)控外周疼痛信息的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，參與疼痛信息的傳遞［21］。當(dāng)機體受到傷害性刺激后，谷氨酸大量釋放并與受體結(jié)合，激活相關(guān)的離子通道、信號通路，將疼痛信號傳入中樞，使得脊髓背角神經(jīng)元內(nèi)發(fā)生中樞敏化，從而產(chǎn)生痛覺［22］。然而谷氨酸從神經(jīng)元轉(zhuǎn)運到囊泡膜釋放出去，必須要借助特定的轉(zhuǎn)運體［23］，VGLUTs 正是此類轉(zhuǎn)運體蛋白［24］。VGLUTs 有VGLUTs1、VGLUTs2、VGLUTs3 三種，其中廣泛存在于神經(jīng)系統(tǒng)中的VGLUTs1、VGLUTs2 主要轉(zhuǎn)運谷氨酸能神經(jīng)元。在丘腦中VGLUT2 轉(zhuǎn)運絕大多數(shù)的興奮性突觸，在疼痛的產(chǎn)生和維持中起到關(guān)鍵的傳遞作用［25-26］。

在本項研究中，與空白組比較，假手術(shù)對照組大鼠的VGLUT2 表達水平在造模后出現(xiàn)一過性的增高，運動功能明顯降低，而IL-6、TNF-α 水平顯著升高，但隨著大鼠皮膚組織的愈合，其運動功能以及VGLUT2、IL-6、TNF-α 表達水平也基本恢復(fù)至正常水平，表明皮膚組織損傷造成的疼痛同樣可以使VGLUT2 表達增高，但其持續(xù)時間遠(yuǎn)遠(yuǎn)短于神經(jīng)病理性疼痛。造模成功后大鼠的機械刺激痛域、熱覺痛域值降低，并出現(xiàn)運動異常，分子生物學(xué)檢測顯示大鼠脊髓背角的VGLUT2 及血清中的IL-6、TNF-α 水平顯著上升；在經(jīng)過10 d 的推拿干預(yù)后，模型大鼠的運動功能逐漸恢復(fù)，表明脊神經(jīng)結(jié)扎不影響大鼠運動功能，但機械刺激痛域、熱痛覺域值仍維持較低水平。慢病毒干擾組大鼠通過鞘內(nèi)注射慢病毒試劑后，VGLUT2 的表達水平受到靶向抑制，其血清中的IL-6、TNF-α 水平也隨之下調(diào)，大鼠的疼痛行為學(xué)也得到恢復(fù)。假推拿組大鼠在經(jīng)過后背撫摸后，其脊髓背角的VGLUT2 水平表達無明顯變化，說明撫摸大鼠后背可能通過其他途徑發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。樞經(jīng)推拿組大鼠經(jīng)過推拿干預(yù)后，其脊髓背角的VGLUT2 和血清中的IL-6、TNF-α 水平均顯著下降，疼痛行為學(xué)表現(xiàn)也得到恢復(fù)。

本研究證明，樞經(jīng)推拿可能通過下調(diào)VGLUT2 的表達，減少釋放炎癥因子，從而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。