桑葚花色苷提取物對乙醇誘導(dǎo)的小鼠肝損傷和死亡率的影響

除了限制飲酒外， 目前， 對于酒精性肝病(ALD)的治療尚無特效藥。 特別是進展到后期， 更多是采取對癥治療的方法。 肝臟作為酒精代謝的主要器官， 過量酒精攝入會給肝臟帶來巨大負擔(dān)， 選擇一種安全有效副作用小的防治策略勢在必行。 來自于食物中的生物活性成分有望成為防治酒精性肝病的潛在療法。 矢車菊素-3-O-葡萄糖苷(Cy-3-G) 廣泛存在于深色蔬菜及水果中， 是膳食花青素中最具代表性及含量最豐富的一種食物活性成分， 具有強效的抗炎、 抗氧化作用。 Cy-3-G 對非酒精性脂肪肝、 肥胖、 動脈粥樣硬化及高血糖等代謝性疾病均具有保護作用

。 本課題組既往研究也發(fā)現(xiàn)， 在8w的酒精性肝炎及12w 的酒精性肝纖維化模型中， Cy-3-G補充可以改善高脂及酒精長期聯(lián)合喂養(yǎng)導(dǎo)致的小鼠肝損傷

， 但是Cy-3-G 對于急性酒精性肝損傷的保護作用仍不明確。 本研究通過構(gòu)建短期及長期NIAAA 模型(又稱Gao-Binge 模型) 來全面探討桑葚花色苷提取物Cy-3-G 對短期或長期過量飲酒小鼠的健康保護效應(yīng)， 為酒精性肝病的防治提供一個新思路。 此模型將慢性乙醇喂養(yǎng)與單次或多次大劑量乙醇灌胃相結(jié)合， 更好的模仿了大多數(shù)酒精性肝病患者的飲酒模式， 也是目前研究酒精性肝病較為公認且應(yīng)用較廣泛的動物模型。

1 材料與方法

1.1 試劑

Cy-3-G， 從桑葚中提取， 具體提取步驟參照[7]；95%乙醇(中國， 阿拉丁)； Lieber-DeCarli 標(biāo)準型酒精液體飼料、 Lieber-DeCarli 對照液體飼料， 中國， 南通特洛菲； 總膽固醇(TC) 檢測試劑盒， 中國， 普利來；天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶( AST) 、 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT) 檢測試劑盒， 中國， 南京建成； 內(nèi)毒素檢測鱟試劑盒(中國， 廈門鱟試劑)； Trizol， 美國， Invitrogen；cDNA 合成試劑盒、 SYBR Green Supermix 試劑盒， 日本， Takara。

1.2 動物分組與造模

所有動物實驗均獲得中山大學(xué)動物倫理委員會批準(2012-0080)。 SPF 級4W 齡雄性C57BL/6J 小鼠購自廣東省實驗動物中心， 飼養(yǎng)于在中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院的SPF 級動物房。 環(huán)境溫度維持在25℃， 每天接受照明時間為12 h。

1.2.1 短期NIAAA 模型 將8w 齡小鼠隨機分為3 組:對照液體飼料喂養(yǎng)組(CTRL 組， n ＝8)、 酒精液體飼料喂養(yǎng)組(EtOH 組， n ＝8)、 酒精液體飼料喂養(yǎng)加Cy-3-G 干預(yù)(EtOH+Cy-3-G 組， n ＝8)。 EtOH 組和EtOH+Cy-3-G 組給予Lieber-DeCarli 標(biāo)準型酒精液體模型飼料(5%

乙醇)， CTRL 組給予Lieber-DeCarli 對照液體飼料

。 使用液體飼料喂養(yǎng)3 組小鼠10d； 并于第11天清晨對EtOH 組和EtOH +Cy-3-G 組給予一次大劑量乙醇(5 g/kg BW) 灌胃， CTRL 組給予等熱量麥芽糊精灌胃， 8 h 后處死。 Cy-3-G 每天以200 mg/kg BW 進行灌胃， EtOH 組和CTRL 組用等體積生理鹽水進行灌胃。各組小鼠干預(yù)期間實行等熱量喂養(yǎng)， 依據(jù)EtOH 組進食情況來控制CTRL 組飼料給予量。

1.2.2 長期NIAAA 模型 將8w 齡小鼠隨機分為3 組:對照液體飼料喂養(yǎng)組(CTRL 組， n ＝9)、 酒精液體飼料喂養(yǎng)組(EtOH 組， n ＝12)、 酒精液體飼料喂養(yǎng)加Cy-3-G 干預(yù)(EtOH+Cy-3-G 組， n ＝12)。 EtOH 組和EtOH+Cy-3-G 組提供Lieber-DeCarli 標(biāo)準型酒精液體模型飼料(5%

乙醇)， CTRL 組給予Lieber-DeCarli 對照液體飼料

。 使用液體飼料喂養(yǎng)3 組小鼠共4w， 并于第7、 14、 21、 28 天清晨對EtOH 組和EtOH+Cy-3-G 組給予一次大劑量乙醇(5 g/kg BW) 灌胃， CTRL 組以灌胃方式給予等熱量麥芽糊精， 并于第28 天大劑量乙醇灌胃8h 后處死小鼠。 Cy-3-G 每天以200 mg/kg BW 通過灌胃方式給予EtOH+Cy-3-G 組小鼠， EtOH 組和CTRL 組小鼠用等體積生理鹽水進行灌胃。 各組小鼠干預(yù)期間實行等熱量喂養(yǎng)， 依據(jù)EtOH 組進食情況控制CTRL 組飼料給予量。

1.3 肝臟切片H＆E 染色

本研究通過綜合應(yīng)用短期和長期NIAAA 酒精模型來探討Cy-3-G 對乙醇誘導(dǎo)的小鼠酒精性肝損傷及死亡率的影響， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 補充Cy-3-G 可緩解短期過量乙醇攝入引起的小鼠肝臟脂肪變性及肝功能損傷， 減輕肝臟炎癥反應(yīng)， 并且可以有效預(yù)防長期過量乙醇攝入導(dǎo)致的小鼠死亡， 保護小鼠健康。

1.4 肝臟總膽固醇(TC) 檢測

小鼠使用戊巴比妥鈉麻醉后， 經(jīng)眼眶取血， 對小鼠實施脫臼處死后進行解剖， 收集肝臟樣本， 分裝并保存于-80℃冰箱中。 取分裝好的肝臟約30 mg， 按1 mg 組織20 μL 組織裂解液的比例加入試劑盒提供的專用裂解液，使用高通量組織研磨儀制備肝勻漿。 取肝勻漿嚴格按照普利來試劑說明對肝臟甘油三酯(TG)、 總膽固醇(TC) 進行檢測。

1.5 血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、 丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT) 檢測

在11d 的短期NIAAA 模型中， 3 組小鼠的平均體重與平均日攝食量在喂養(yǎng)期間沒有統(tǒng)計學(xué)差異(

＞0.05)(圖1A、 B)， 表明實驗過程中在3 組小鼠間嚴格執(zhí)行了等熱量喂養(yǎng)。

1.6 血清內(nèi)毒素(LPS) 檢測

小鼠用戊巴比妥鈉麻醉后， 經(jīng)眼眶取血， 用無菌EP 管收集血液， 室溫放置1 h 后于4 ℃， 3 000 r/min 條件下離心30 min， 取上清進行檢測。 具體檢測步驟嚴格按照廈門鱟試劑內(nèi)毒素檢測鱟試劑盒說明進行操作。

1.7 肝臟炎癥因子檢測

血清中ALT 和AST 活性是反映肝功能的可靠性指標(biāo)， 在正常情況下， ALT 和AST 主要分布在肝細胞的線粒體中。 當(dāng)受到外源性毒物的損害時， 這兩種轉(zhuǎn)氨酶會透過受損的肝細胞膜進入血液， 引起血清酶水平的升高

。 本實驗中血清ALT 和AST 水平增加提示肝功能受損。 然而， 補充Cy-3-G 可以預(yù)防乙醇喂養(yǎng)引起的肝臟脂質(zhì)蓄積及血清ALT 和AST 水平升高， 有效改善肝功能。 Cy-3-G 對于肝臟的保護作用在既往研究中已有報道， 其可以減輕高脂膳食誘導(dǎo)的小鼠肝臟氧化應(yīng)激和脂肪變性， 預(yù)防非酒精性脂肪肝的發(fā)生

。

1.8 統(tǒng)計分析

這節(jié)課的主題是“WHAT MAKES A GOOD QUESTION？”（怎樣能提出一個好問題？）。問題一出，同行的老師禁不住悄悄問：“這是歷史課嗎？”這時，老師假設(shè)情境：假如你遇到一位多年前來自中國的移民，你想問他些什么問題？什么樣的問題是一個好問題？老師要求每個學(xué)生寫出五個問題。寫完后，兩三人一組交流，再進行班級交流，學(xué)生踴躍舉手發(fā)言。至此，我們才反應(yīng)過來，原來這位老師是把歷史知識當(dāng)成了問題探究的素材，我們不禁暗自叫好。

2 結(jié)果與分析

2.1 短期NIAAA 模型中3 組小鼠體重及日攝食量

小鼠用戊巴比妥鈉麻醉后， 經(jīng)眼眶取血， 用無菌EP 管收集血液， 室溫放置1 h 后于4 ℃， 3 000 r/min 條件下離心30 min， 取上清嚴格按照南京建成試劑盒說明對血清中天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、 丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT) 的活性進行檢測。

2.2 短期NIAAA 模型中Cy-3-G 對小鼠肝臟組織的影響

肝臟組織病理切片的H＆E 染色結(jié)果顯示， 與CTRL組相比， EtOH 組小鼠的肝細胞表現(xiàn)出彌漫性脂肪變，內(nèi)部可見大小不等、 數(shù)量不一的脂滴， 并且肝細胞排列紊亂、 肝索紋理不清， 肝臟出現(xiàn)明顯的炎性細胞浸潤；而EtOH+Cy-3-G 組肝細胞內(nèi)脂滴數(shù)量顯著減少， 肝索紋理清晰呈放射狀排列， 肝臟炎性細胞浸潤明顯減輕，與CTRL 組結(jié)構(gòu)類似(圖2A)。 進一步對肝臟總膽固醇(TC) 水平進行檢測， 結(jié)果顯示， 同CTRL 組比， EtOH組小鼠肝臟TC 水平升高(

＜0.01)， 而EtOH+Cy-3-G組肝臟TC 水平較EtOH 組降低(

＜0.05) (圖2B)，表明補充Cy-3-G 對短期過量乙醇攝入引起的酒精性脂肪肝具有保護作用。

2.3 短期NIAAA 模型中Cy-3-G 對小鼠血清中AST、ALT 活性的影響

EtOH 組小鼠血清中AST 活性高于CTRL 組(

＜0.05)， 而EtOH+Cy-3-G 組血清中AST 活性較EtOH 組降低(

＜0.01) (圖3A)。 同樣， 乙醇喂養(yǎng)使得小鼠血清中ALT 活性增加(

＜0.05)， 而Cy-3-G 有預(yù)防乙醇喂養(yǎng)引起的血清ALT 活性增加的趨勢， 但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(

＞0.05) (圖3B)。 以上結(jié)果提示， 補充Cy-3-G在一定程度上可以預(yù)防急性酒精性肝功能損傷。

通過對歌詞內(nèi)容提問，讓學(xué)生在腦子里初步形成感知。通過實踐體驗給每一位體驗者大腦皮層留下深刻的印象。在體驗中，學(xué)生心靈更加放松，感悟也會在大腦中越來越清晰。層層遞進的問題引得學(xué)生對主題的感悟一步步深入、明晰。詩歌的跟進使班會達到了高潮，學(xué)生們內(nèi)心燃起了共鳴，達到了老師預(yù)期的教育效果！

2.4 短期NIAAA 模型中Cy-3-G 對小鼠血清LPS 的影響

過量飲酒會引起腸道功能損傷， 一方面導(dǎo)致腸道菌群紊亂， 另一方面使得腸道通透性增加， 促使LPS 等菌群副產(chǎn)物透過腸道屏障進入門靜脈， 加劇對肝臟的損傷

。 因此， 進一步對血清LPS 水平進行檢測。 對比CTRL 組， EtOH 組小鼠血清LPS 水平升高(

＜0.01)，EtOH+Cy-3-G 組小鼠的血清LPS 水平較EtOH 組降低(

＜0.01) (圖4)。

隨著惡性腫瘤治療手段的不斷發(fā)展，腫瘤患者的生存期逐漸延長，隨之轉(zhuǎn)移瘤的檢出率也越來越高。據(jù)統(tǒng)計，約有20%～54%的惡性腫瘤會在疾病的演變過程中發(fā)生肺部轉(zhuǎn)移[1]。因為肺存在龐大的毛細血管網(wǎng)且位于循環(huán)系統(tǒng)中樞，所以肺成為惡性腫瘤轉(zhuǎn)移最常見的器官之一[2]。肺轉(zhuǎn)移瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的時間早晚不一，無規(guī)律可循。肺轉(zhuǎn)移瘤是惡性腫瘤的晚期表現(xiàn)，外科治療是否可以提高患者生存率及生活質(zhì)量仍存在一定爭議。本文回顧性分析2007年1月至2017年1月大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胸外科收治行肺轉(zhuǎn)移瘤手術(shù)患者的臨床資料，擬探討肺轉(zhuǎn)移瘤手術(shù)切除適應(yīng)證及術(shù)式、肺轉(zhuǎn)移瘤診斷、術(shù)后療效及影響預(yù)后的相關(guān)因素。

對于航空制造業(yè)領(lǐng)域知識的分類，是通過對技術(shù)內(nèi)容的概括及某些特征的概念進行邏輯分類和系統(tǒng)排列而構(gòu)成，構(gòu)建航空技術(shù)分類模型，為使用者提供設(shè)計準則、技術(shù)支持及決策依據(jù)，能夠最大化利用航空制造業(yè)領(lǐng)域知識。對于航空技術(shù)多領(lǐng)域知識的分類，從航空技術(shù)的屬性、用途、學(xué)科及主題著手，需要多層次多維度的進行分類歸納，構(gòu)建描述預(yù)先定義好的屬性、學(xué)科或概念的分類規(guī)則，按照航空制造業(yè)領(lǐng)域知識的適用范圍和來源、原理和功能、描述對象等多個方向進行劃分，建立如圖1的航空制造業(yè)領(lǐng)域知識分類模型。

2.5 短期NIAAA 模型中Cy-3-G 對小鼠肝臟炎癥因子的影響

LPS 與Toll 樣受體4 (TLR4) 結(jié)合進一步激活Kupffer 細胞產(chǎn)生各種炎癥因子和趨化因子， 引起肝臟炎癥反應(yīng)。 EtOH 組小鼠肝臟

1

、

、

1 mRNA水平較對照組明顯升高(

＜0.05)， 而Cy-3-G 可以有效預(yù)防乙醇喂養(yǎng)引起的炎癥因子

1

、

、

1 mRNA 水平的升高(

＜0.05)。 圖5 結(jié)果表明， Cy-3-G補充可以明顯改善乙醇喂養(yǎng)引起的小鼠肝臟的炎癥反應(yīng)。

2.6 長期NIAAA 模型中Cy-3-G 對小鼠死亡率的影響

與CTRL 組相比， 長期過量乙醇攝入使得小鼠死亡率顯著增加， 而EtOH+Cy-3-G 組小鼠的死亡率明顯低于EtOH 組(表2)。 如圖6 所示， 經(jīng)log-rank 檢驗差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(

＜0.01)。 結(jié)果提示， 通過補充Cy-3-G 可以預(yù)防長期過量乙醇攝入導(dǎo)致的小鼠死亡。

怎么，竹韻結(jié)婚八年還是處女?此證一出，全場嘩然，旁聽席上的觀眾交頭接耳議論起來，審判臺上，包括原告、被告、審判人員都愕然了，過了好一會，審判長才說了聲安靜，接著宣布此鑒定有效，可以作為證據(jù)采信，請原告繼續(xù)陳述。

3 討論

小鼠使用戊巴比妥鈉麻醉后， 脫臼處死， 解剖取肝臟組織， 切取一小塊肝臟組織迅速放入裝有4% 多聚甲醛的EP 管中， 室溫保存。 對肝臟組織進行石蠟包埋后，切成5~8 μm 厚度均勻的薄片。 脫蠟后將切片浸泡入蘇木素染液中3 ~8 min 對細胞核進行染色， 清水沖洗15min。 接下來將石蠟切片浸泡到伊紅染液中1 ~3 min對細胞質(zhì)進行染色， 清水沖洗15 min。 脫水處理后， 在通風(fēng)櫥中使用中性樹膠進行封片。 使用顯微鏡進行切片觀察并拍照保存。

使用GraphPad Prism 8.3.0 和SPSS 26.0 進行統(tǒng)計分析和繪圖。 采用單因素方差分析分析各組間定量數(shù)據(jù)的統(tǒng)計差異。 使用卡方檢驗分析各組間定性數(shù)據(jù)的統(tǒng)計差異。 數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準誤，

＜0.05 被認為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

稱取20 mg 肝臟， 使用Trizol 從肝臟中提取總RNA。對提取的總RNA 濃度及純度進行檢測后， 使用cDNA 合成試劑盒將1 μg RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。 以

為內(nèi)參， 采用SYBR Green Supermix 試劑盒配置反應(yīng)體系進行實時熒光定量PCR， 檢測白介素-1β (

1

)、 腫瘤壞死因子-α (

) 和巨噬細胞趨化蛋白-1 (

1)的相對表達量， 并使用比較閾值周期(ΔΔCt) 方法量化相對倍數(shù)變化。 實驗所用引物見表1。

炎癥反應(yīng)在ALD 的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，減輕肝臟炎癥反應(yīng)可以顯著延緩ALD 進程。 Aditya等

發(fā)現(xiàn)， 使用cenicriviroc (CCR2/5 阻斷劑) 對乙醇喂養(yǎng)小鼠進行干預(yù)， 可以抑制肝臟巨噬細胞浸潤， 減輕炎癥反應(yīng)， 從而對酒精性肝損傷起到保護作用。 Jayachitra 等

認為， 柚皮苷通過降低促炎細胞因子表達減輕肝臟炎癥反應(yīng)對乙醇誘導(dǎo)的大鼠肝損傷起保護作用。Cy-3-G 作為花青素中最普遍且性質(zhì)穩(wěn)定的一種形式， 具有同花青素一樣高效的抗炎、 抗氧化的作用

。 本課題組先前的研究中也有報道， 在8w 的高脂加乙醇誘導(dǎo)的小鼠酒精性肝炎模型中， Cy-3-G 可以抑制NLRP3 炎癥小體活化和炎癥細胞因子在肝臟中的表達

， 保護肝臟健康。 本研究結(jié)果也顯示， Cy-3-G 補充顯著改善了肝臟炎細胞浸潤并降低促炎細胞因子

1

、

、

1 的表達， 減輕肝臟炎癥。 結(jié)果表明， Cy-3-G 的保肝作用可能與其降低酒精喂養(yǎng)小鼠肝臟炎癥水平有關(guān)。

越來越多的證據(jù)表明， 酒精性肝病的發(fā)病機制與腸-肝軸密切相關(guān)

。 飲酒會導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)， 破壞腸道屏障， 從而導(dǎo)致LPS 透過腸道由門靜脈到達肝臟

。 LPS 與TLR4 結(jié)合激活Kupffer 細胞產(chǎn)生各種促炎細胞因子和趨化因子， 例如

1

、

、

6、

8、 巨噬細胞趨化蛋白-1 (

1) 等， 促進ALD 的發(fā)生發(fā)展

。 研究發(fā)現(xiàn)， 通過補充益生菌或維生素D 可以減少酒精誘導(dǎo)的LPS 釋放入血， 進而減緩ALD 的進程

。 因此， 保護腸道健康防止LPS 釋放入血對預(yù)防肝損傷具有十分重要的意義。 Cy-3-G 對腸道菌群的調(diào)節(jié)和腸道屏障的保護作用在先前的研究中已有報道

。本實驗中我們也觀察到， 乙醇喂養(yǎng)使得小鼠血清中LPS水平增加， 而Cy-3-G 可以預(yù)防乙醇喂養(yǎng)引起的小鼠血清LPS 水平增加， 表明Cy-3-G 對酒精性肝損傷小鼠腸道功能損傷具有一定修復(fù)作用， 從而減少了LPS 的滲漏， 這可能是其減輕肝臟炎癥反應(yīng)改善肝功能的作用機制之一。

3.離子交換法。用無機或有機物組成一混合凝膠，形成交換劑核，四周包圍兩層不同電荷的雙電層，水通過后可發(fā)生離子交換。陽離子交換劑：含H+、Na+固體與Ca2+、Mg2+交換；陰離子交換劑：含堿性基因，能與水中陰離子交換。經(jīng)過離子交換后，硬水得到軟化。

進一步使用4w 的長期NIAAA 模型構(gòu)建更嚴重的酒精性肝損傷模型來進一步探討Cy-3-G 的保護作用， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 在長期NIAAA 模型中EtOH 組小鼠的死亡率明顯增加。 這一現(xiàn)象與H.W.等

的研究結(jié)果一致。 然而Cy-3-G 補充可以有效預(yù)防長期乙醇攝入引起的小鼠死亡， 但其保護機制是否與肝損傷有關(guān)尚不可知。 因此，在未來， 我們將選擇更合適的模型來進一步探討Cy-3-G對長期過量乙醇攝入小鼠的肝損傷的影響。

本研究選用日常乙醇喂養(yǎng)加單次或多次大劑量乙醇灌胃的NIAAA 模型， 更好地模擬了大多數(shù)酒精性肝病患者的飲酒模式， 這些患者一般具有多年長期飲酒和近期過度飲酒的病史

， 并通過結(jié)合短期和長期模型來綜合探討Cy-3-G 對酒精性肝損傷和小鼠健康的保護作用。 本研究首次報道了Cy-3-G 能顯著改善短期過量乙醇攝入引起的小鼠肝損傷并且可以有效預(yù)防長期過量乙醇攝入造成的小鼠死亡。 但本研究也存在一定的缺點，本研究觀察到Cy-3-G 補充可以有效預(yù)防長期乙醇攝入引起的小鼠死亡， 但未進一步其相關(guān)機制進行探討。

將該養(yǎng)殖場病死的5只羊全部解剖，發(fā)現(xiàn)5只羊身體嚴重消瘦，皮下脂肪消失，出現(xiàn)嚴重貧血癥狀；病死羊體內(nèi)血液稀薄如水，呈現(xiàn)粉紅色，但能正常凝固；腸系膜病變嚴重，高度充血水腫，腸系膜淋巴結(jié)外觀呈現(xiàn)灰色，各個臟器普遍存在貧血癥狀；打開病死羊的真胃和小腸，發(fā)現(xiàn)內(nèi)部存在長度1.5～3 cm的線蟲，外觀呈現(xiàn)淡紅色；在病死羊的腸壁粘膜上，還能發(fā)現(xiàn)存在大量白色的結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)內(nèi)部存在干酪狀的物質(zhì)。

綜上所述， 桑葚花色苷提取物Cy-3-G 對短期過量乙醇攝入造成的小鼠肝損傷具有保護作用， 其保護機制可能是通過抑制LPS 釋放從而減輕肝臟炎癥反應(yīng)實現(xiàn)的。 此外Cy-3-G 可以有效預(yù)防長期過量乙醇攝入導(dǎo)致的小鼠死亡。 研究結(jié)果提示， 桑葚花色苷提取物Cy-3-G有望作為膳食補充劑應(yīng)用于防治酒精性健康損害。

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