MEBO 聯(lián)合微粒皮種植對(duì)糖尿病足創(chuàng)面組織中VEGF、 EGF 表達(dá)水平的影響

戚世玲 劉 清 何仁亮 朱定衡 馮 雷 謝志敏 方培炫 朱 璐

糖尿病足是糖尿病患者常見且嚴(yán)重的并發(fā)癥之一， 多由周圍神經(jīng)病變、 外周血管病變和感染等多種因素相互作用所致， 且機(jī)體長(zhǎng)期處于高糖環(huán)境引起的血管損傷、 組織細(xì)胞功能紊亂、 神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)水平降低、 生長(zhǎng)因子減少等還可導(dǎo)致創(chuàng)面遷延不愈， 治療難度較大， 給患者家庭和社會(huì)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［1］。 目前， 臨床治療糖尿病足的主要方法有藥物外用、 手術(shù)植皮、 富血小板血漿外敷、負(fù)壓封閉引流、 干細(xì)胞移植、 高壓氧療、 組織工程技術(shù)以及各種敷料外敷等， 其中干細(xì)胞移植、 負(fù)壓封閉引流以及銀離子凝膠等新型敷料的價(jià)格高昂［2－3］， 且部分治療方法治療周期較長(zhǎng)、 換藥次數(shù)頻繁， 臨床難以推廣。 因此， 探尋安全有效且價(jià)格低廉的糖尿病足創(chuàng)面治療方法仍是臨床研究的重點(diǎn)。 近年來有研究證實(shí)， 濕潤(rùn)燒傷膏（moist exposed burn ointment， MEBO） 聯(lián)合微粒皮種植治療糖尿病足創(chuàng)面的療效較好， 且價(jià)格相對(duì)低廉［4］。 基于此， 本研究筆者鑒于血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor， VEGF） 與表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor， EGF） 可間接反映創(chuàng)面的愈合情況［5］， 于本研究中觀察了MEBO 聯(lián)合微粒皮種植對(duì)糖尿病足創(chuàng)面組織中VEGF、 EGF 表達(dá)水平的影響， 以期為該療法的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 臨床資料

1.1 一般資料

本組患者共38 例， 均為2018 年1 月至2020年12 月廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院收治的Wagner 2 ～3 級(jí)糖尿病足患者， 其中男性21 例、 女性17例， 年齡（63.6 ±8.3） 歲， 糖尿病病程（9.3 ±2.2） 年， 糖尿病足病程（61.6 ±22.4） d， Wagner分級(jí)為2 級(jí)33 例、 3 級(jí)5 例， 糖化血紅蛋白（8.4 ±1.2）%。 本研究經(jīng)廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)， 且所有患者均簽署了知情同意書。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)： 符合2 型糖尿病及糖尿病足的診斷標(biāo)準(zhǔn)； Wagner 分級(jí)為2 ～3 級(jí)； 經(jīng)常規(guī)治療無明顯好轉(zhuǎn)或持續(xù)惡化， 且經(jīng)綜合治療后能承受微粒皮種植治療； 對(duì)本研究知情同意。 排除標(biāo)準(zhǔn)： 合并有嚴(yán)重心、 腦、 肺、 肝、 腎等重要器官功能障礙； 合并有惡性腫瘤； 合并有認(rèn)知功能障礙或精神類疾病，依從性較差； 入選前長(zhǎng)期接受糖皮質(zhì)激素、 免疫抑制劑及化療藥物治療； 對(duì)本研究所用藥物成分過敏或?yàn)檫^敏體質(zhì)； 妊娠期及哺乳期女性。

1.3 主要試劑與儀器

鼠抗人VEGF 及EGF 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒： 美國(guó)Cell Signaling Technology 生產(chǎn)； 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀： 德國(guó)Thermo Fisher Scientific 生產(chǎn)； 二喹啉甲酸（bicinchoninic acid， BCA） 蛋白定量試劑盒：北京雷根生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)； 超聲勻漿器： 美國(guó)Biospec 生產(chǎn)； 低溫離心機(jī)： 美國(guó)Beckman Coulter生產(chǎn)。

2 方法

2.1 基礎(chǔ)治療

所有患者入院后均積極予以調(diào)控血糖、 血壓、血脂， 抗感染， 改善微循環(huán)， 營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)， 調(diào)控飲食等對(duì)癥支持治療。

2.2 創(chuàng)面治療

局部創(chuàng)面于生理鹽水沖洗、 壞死組織清除后，均勻涂抹MEBO， 并依次覆蓋MEBO 藥紗及無菌敷料包扎， 每天換藥1 ～2 次； 待新生肉芽組織覆蓋創(chuàng)面后行微粒皮種植， 用眼科無齒鑷將微粒皮以間隔0.3 ～0.5 cm， 深0.2 ～0.3 cm 為準(zhǔn)種植于創(chuàng)面中； 繼而依次覆蓋MEBO 藥紗及無菌敷料加壓包扎， 每天換藥1 次（換藥時(shí)去除創(chuàng)面殘余藥膏、 液化物及壞死組織后再涂新藥）， 直至創(chuàng)面完全愈合。

微粒皮制作： 選擇自身大腿健康皮膚， 常規(guī)消毒麻醉后， 按供皮區(qū)面積與創(chuàng)面面積比例為1∶20 ～30切取刃厚皮片， 剪成0.1 ～0.2 cm 的矩形微粒置于無菌生理鹽水中備用［6］； 供皮區(qū)創(chuàng)面予以無菌紗布加壓包扎， 每天換藥1 次， 直至創(chuàng)面完全愈合。

2.3 標(biāo)本采集

分別于治療前及治療第7、 14 天測(cè)量創(chuàng)面面積， 并剪取0.1 cm ×0.1 cm 創(chuàng)面邊緣肉芽組織置于－80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 VEGF、 EGF 含量測(cè)定

嚴(yán)格按照試劑盒說明書采用BCA 法檢測(cè)創(chuàng)面組織中總蛋白含量、 采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)VEGF 及EGF 水平， 并以VEGF、 EGF 水平與總蛋白含量的比值表示每毫克組織中VEGF、 EGF 的含量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析， 符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以及非正態(tài)分布數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示， 采用重復(fù)測(cè)量方差分析； 創(chuàng)面面積與VEGF、EGF 含量的相關(guān)性采用Pearson 相關(guān)性分析； 均以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 創(chuàng)面愈合情況

治療前， 38 例患者創(chuàng)面面積為 （11.78 ±3.04） cm2； 治療過程中， 所有患者創(chuàng)面均逐漸縮小， 其中治療第7 天創(chuàng)面面積為（9.64±2.73） cm2，治療第14 天創(chuàng)面面積為（7.32 ±2.06） cm2； 治療2 個(gè)月后， 33 例患者創(chuàng)面完全愈合、 5 例患者創(chuàng)面明顯縮小。 典型病例圖片見圖1－2。

圖1 微粒皮種植治療前糖尿病足創(chuàng)面情況； 圖2 微粒皮種植治療3 個(gè)月后創(chuàng)面愈合Fig.1 The diabetic foot wound before micro?skin grafting； Fig.2 The wound was healed 3 months after the micro?skin grafting

3.2 治療前后VEGF、 EGF 含量對(duì)比

治療過程中， 38 例患者創(chuàng)面組織中VEGF 及EGF 含量均呈逐漸升高趨勢(shì)， 其中各時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面組織中VEGF 含量對(duì)比，P均＜0.001， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義； EGF 含量除治療前與治療第7 天對(duì)比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05） 外， 其余各時(shí)間點(diǎn)對(duì)比，P均＜0.001， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義， 詳見表1。

表1 治療前后糖尿病足創(chuàng)面組織中VEGF、 EGF 含量對(duì)比（pg／mg， ±s）Table 1 Comparison of levels of VEGF and EGF in diabetic foot wounds before and after treatment （pg／mg， ±s）

表1 治療前后糖尿病足創(chuàng)面組織中VEGF、 EGF 含量對(duì)比（pg／mg， ±s）Table 1 Comparison of levels of VEGF and EGF in diabetic foot wounds before and after treatment （pg／mg， ±s）

注： VEGF 為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子， EGF 為表皮生長(zhǎng)因子。 與治療前對(duì)比， aP ＜0.05， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義； 與治療第7 天對(duì)比， bP ＜0.05， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義Note： VEGF－vascular endothelial growth factor， EGF－epidermal growth factor. The differences were statistically significant compared with that before treatment （aP ＜0.05） and on day 7 of treatment （bP ＜0.05）

指標(biāo)Indicator例數(shù)Number of cases治療前Before treatment治療第7 天Day 7 of treatment治療第14 天Day 14 of treatment F 值F value P 值P value VEGF 38 79.38 ±9.48 99.65 ±12.39a 125.17 ±14.06ab 136.076 ＜0.001 EGF 38 7.91 ±2.03 9.11 ±3.52 15.95 ±5.86ab 42.172 ＜0.001

3.3 創(chuàng)面組織中VEGF、 EGF 含量與創(chuàng)面面積的相關(guān)性分析

Pearson 相關(guān)系數(shù)分析結(jié)果顯示， 創(chuàng)面組織中VEGF、 EGF 含量與創(chuàng)面面積無明顯相關(guān)性（r＝0.181、 0.205，P＝0.833、 0.094）。

4 討論

據(jù)統(tǒng)計(jì)， 我國(guó)現(xiàn)有糖尿病患者約1.3 億， 糖耐量受損者（糖尿病前期） 約3.5 億， 而糖尿病足作為糖尿病患者常見且嚴(yán)重的并發(fā)癥， 50 歲以上的發(fā)病率高達(dá)8.1%， 且極易因合并感染、 局部微循環(huán)障礙及神經(jīng)損害而使創(chuàng)面遷延不愈［7］。 糖尿病足是糖尿病患者致殘、 致死的主要原因之一， 如何快速高效修復(fù)糖尿病足創(chuàng)面一直是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域亟待解決的難題。

自體微粒皮種植是一種臨床常用的創(chuàng)面修復(fù)方法， 操作簡(jiǎn)便， 對(duì)手術(shù)設(shè)備及鎮(zhèn)痛要求較低， 易于推廣， 尤其適用于不能接受大面積皮膚移植或皮瓣移植的患者［8］。 自體微粒皮含有表皮、 真皮和皮下組織等皮膚全層結(jié)構(gòu)， 且皮粒微小， 能夠與邊緣新生組織快速融合， 迅速封閉創(chuàng)面， 可明顯降低并發(fā)癥發(fā)生率及病死率， 被廣泛應(yīng)用于臨床［9］。 MEBO是由黃芩、 黃柏、 黃連、 地龍、 罌粟殼等中草藥提取物制成的軟膏制劑， 具有清熱解毒、 祛腐生肌、活血化瘀等功效。 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實(shí)， MEBO 能夠?yàn)閯?chuàng)面創(chuàng)造立體式生理性濕潤(rùn)環(huán)境， 并在創(chuàng)面表層形成一層保護(hù)膜， 從而隔絕外界細(xì)菌對(duì)創(chuàng)面的侵襲； 黃芩甙、 小檗堿等成分能夠破壞細(xì)菌生存環(huán)境， 抑制細(xì)菌繁殖及毒性物質(zhì)釋放， 有效控制創(chuàng)面感染； 可與創(chuàng)面壞死組織發(fā)生水解、 酶解、 酸敗、皂化、 酯化和脂化等一系列生物化學(xué)反應(yīng)， 無損傷地液化排除壞死組織； 可激活創(chuàng)面組織中的潛能再生細(xì)胞， 并將其轉(zhuǎn)化為干細(xì)胞， 再在原位增殖、 分化為創(chuàng)面各層組織細(xì)胞， 再生修復(fù)創(chuàng)面［10］； 同時(shí)，其內(nèi)含有的碳水化合物、 脂肪酸、 氨基酸、 維生素等多種營(yíng)養(yǎng)成分可為創(chuàng)面的再生修復(fù)提供充足的營(yíng)養(yǎng)［11］。 本研究結(jié)果顯示， MEBO 聯(lián)合微粒皮種植治療2 個(gè)月后， 33 例糖尿病足患者創(chuàng)面完全愈合，5 例患者創(chuàng)面明顯縮小， 明顯短于李健等［12］研究顯示的前列地爾靜脈注射聯(lián)合潰瘍局部前列地爾經(jīng)皮超聲電導(dǎo)透入治療糖尿病足的創(chuàng)面愈合時(shí)間。 可見， MEBO 聯(lián)合微粒皮種植可促進(jìn)糖尿病足創(chuàng)面的愈合。 考慮與自體微粒皮種植術(shù)前使用MEBO 能夠促進(jìn)肉芽組織生長(zhǎng)， 為微粒皮的種植提供基礎(chǔ)， 以及自體微粒皮種植術(shù)后使用MEBO 能夠?yàn)槲⒘Ｆこ苫睢?擴(kuò)張?zhí)峁┏渥愕臓I(yíng)養(yǎng)有關(guān)。

創(chuàng)面愈合是一個(gè)復(fù)雜而有序的動(dòng)態(tài)生物學(xué)過程， 包括凝血、 炎癥反應(yīng)、 肉芽組織形成和組織重塑4 個(gè)階段， 其中肉芽組織形成對(duì)創(chuàng)面愈合至關(guān)重要， 而創(chuàng)面組織中相關(guān)生長(zhǎng)因子及其受體相對(duì)或絕對(duì)缺乏是導(dǎo)致創(chuàng)面肉芽組織難以形成的關(guān)鍵因素［13］。 近年來部分研究證實(shí)， 細(xì)胞外基質(zhì)可通過分泌VEGF、 EGF 等因子而調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞、 血管內(nèi)皮細(xì)胞、 角質(zhì)形成細(xì)胞的活化、 增殖， 從而促進(jìn)創(chuàng)面肉芽組織形成， 加快創(chuàng)面愈合。 VEGF 是特異性促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子， 具有多種生物活性，可有效促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、 遷移， 增加血管通透性， 從而誘導(dǎo)新生血管形成。 EGF 是人體分泌的一種重要細(xì)胞生長(zhǎng)因子， 可啟動(dòng)創(chuàng)面修復(fù)程序， 促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖及上皮細(xì)胞生長(zhǎng)， 增強(qiáng)表皮細(xì)胞活力， 加快創(chuàng)面再生修復(fù)［14］。 唐乾利等［15］的研究發(fā)現(xiàn)， MEBO 能夠通過提高大鼠創(chuàng)面組織中VEGF及EGF mRNA 的表達(dá)水平而促進(jìn)創(chuàng)面愈合。 本研究結(jié)果顯示， MEBO 聯(lián)合微粒皮種植治療后糖尿病足創(chuàng)面組織中VEGF、 EGF 含量均呈明顯升高的趨勢(shì)， 創(chuàng)面面積均呈明顯縮小的趨勢(shì)， 與以往研究結(jié)果一致［16］。 但Pearson 相關(guān)系數(shù)分析結(jié)果顯示， 創(chuàng)面組織中VEGF、 EGF 含量與創(chuàng)面面積無明顯相關(guān)性， 與VEGF、 EGF 及創(chuàng)面面積的變化趨勢(shì)不一致， 分析其原因可能與VEGF、 EGF 等相關(guān)生長(zhǎng)因子之間相互制約有關(guān)， 有待進(jìn)一步深入研究探討。

綜上所述， MEBO 聯(lián)合微粒皮種植促進(jìn)糖尿病足創(chuàng)面愈合的作用機(jī)制可能與VEGF、 EGF 表達(dá)水平的上調(diào)有關(guān)， 但外源性VEGF、 EGF 是否能促進(jìn)新生血管生成、 肉芽組織生長(zhǎng)而促進(jìn)創(chuàng)面愈合， 且其長(zhǎng)期安全性、 耐受性以及最佳用藥濃度、 用藥時(shí)間等問題仍有待進(jìn)一步深入研究探討。 另外， 糖尿病足的發(fā)病機(jī)制及創(chuàng)面修復(fù)過程還與多條信號(hào)傳導(dǎo)通路、多種細(xì)胞因子的共同參與有關(guān)， 因此， MEBO聯(lián)合微粒皮種植治療糖尿病足的作用機(jī)制還需大樣本、多中心的前瞻性研究進(jìn)一步驗(yàn)證， 以期為創(chuàng)面的臨床治療提供確切的理論依據(jù)以及新的思路和策略。