利用全基因組關(guān)聯(lián)分析鑒定豬生長(zhǎng)性狀相關(guān)的遺傳變異及候選基因

吳姿儀，陳健梅，程博文，雷澤凱，王獻(xiàn)偉，王克君，喬瑞敏，韓雪蕾，李新建，李秀領(lǐng)*

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南鄭州 450046；2.河南省畜牧總站，河南鄭州 450046）

豬生長(zhǎng)性狀是影響豬生產(chǎn)力的重要經(jīng)濟(jì)性狀，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益有重要影響，也是養(yǎng)殖者和育種生產(chǎn)者最關(guān)心的性狀之一。豬育種中多個(gè)生長(zhǎng)指標(biāo)均可反映豬的生長(zhǎng)性能，例如：生長(zhǎng)速度、背膘厚、飼料轉(zhuǎn)化率、眼肌深度和眼肌面積等。豬的生長(zhǎng)性狀是由多基因控制的較為復(fù)雜的數(shù)量性狀。了解調(diào)控這些性狀的遺傳決定因素對(duì)提高豬生產(chǎn)效益和遺傳進(jìn)展具有決定性意義。

目前，全基因組關(guān)聯(lián)分析（Genome-Wide Association Study，GWAS）已廣泛用于檢測(cè)與豬重要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的SNP，然而，由于基因分型成本高，一個(gè)群體中只有少數(shù)個(gè)體進(jìn)行基因分型，因此，大部分個(gè)體的表型信息和系譜信息在GWAS 分析中并未得到充分應(yīng)用。Wang等提出了一種基于單步基因組最佳線性無(wú)偏預(yù)測(cè)（Single-step Genomic Best Linear Unbiased Prediction，ssGBLUP）的GWAS 方法，并將其稱之為單步全基因組關(guān)聯(lián)分析（ssGWAS），它可以將基因分型和非基因分型個(gè)體的信息整合在一個(gè)簡(jiǎn)單的步驟中。ssGWAS 方法已經(jīng)應(yīng)用在豬的生長(zhǎng)和采食量等性狀，并發(fā)現(xiàn)了新的位點(diǎn)。

在本研究中，利用中芯一號(hào)50K SNP 芯片對(duì)296頭豬進(jìn)行基因分型，使用ssGWAS 來(lái)鑒定與背膘厚、眼肌深度和眼肌面積相關(guān)的遺傳標(biāo)記及候選基因，從而為生長(zhǎng)性狀分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)、關(guān)鍵基因的功能驗(yàn)證及后續(xù)的育種提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物群體與表型測(cè)定 本研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為來(lái)源于河南省新大牧業(yè)股份有限公司一豬場(chǎng)的296 頭母豬，其中234 頭杜洛克豬和62 頭大白豬。所有豬種體質(zhì)健康，按照飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制飼料，自由飲水，定時(shí)飼喂，并及時(shí)進(jìn)行科學(xué)管理及免疫防治。296 頭豬的記錄信息包括個(gè)體ID、父親ID、母親ID、場(chǎng)代碼、品種、初生重、結(jié)測(cè)重、起始測(cè)量年月日、結(jié)束測(cè)量年月日、飼養(yǎng)時(shí)間、背膘厚、眼肌深度、眼肌面積等。其中，具有表型數(shù)據(jù)的296 頭母豬均有基因型和系譜，從而選擇ssGWAS的方法整合系譜信息以提高研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。本實(shí)驗(yàn)將296 頭母豬的背膘厚（Backfat Thickness，BF）、眼肌深度（Loin Muscle Depth，LMD）和眼肌面積（Loin Muscle Area，LMA）作為研究性狀。利用背膘測(cè)定儀測(cè)定豬活體背膘厚、B 超測(cè)定眼肌深度和眼肌面積。其中，為得到100 kg 體重時(shí)的BF 和LMA，對(duì)測(cè)定BF（單位：mm）和LMA（單位：cm）原始數(shù)據(jù)進(jìn)行校正，公式如下：

使用Excel 對(duì)表型數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)整理，并用R 軟件進(jìn)行一般統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，包括表型數(shù)據(jù)的最大值、最小值、平均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差以及變異系數(shù)。

1.2 DNA 提取與基因分型 使用組織基因組DNA 提取試劑盒提取豬耳組織樣本的DNA，提取的DNA 使用NanoDrop2000 微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)樣本濃度及質(zhì)量。將濃度>50 ng/μL、A260/280 在1.8 和2.1 之間、A260/230>1.8 的樣本DNA，通過(guò)1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)拍攝DNA 膠圖，鑒定樣本DNA的質(zhì)量。質(zhì)量合格的DNA 樣本使用中芯一號(hào)芯片進(jìn)行基因分型。

使用Beagle v5.2進(jìn)行缺失基因型的填充，且在填充前后均使用Plink v1.9軟件進(jìn)行SNP 數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制，質(zhì)控條件如下：

①刪除SNP 缺失率高于0.10 的SNP 位點(diǎn)；

②刪除個(gè)體缺失率0.10 的個(gè)體；

③刪除最小等位基因頻率（Minor Allele Frequency，MAF）小于0.01 的SNP 位點(diǎn)；

④刪除哈迪-溫伯格平衡（Hardy-weiberg Equilibr ium，HWE）卡方檢驗(yàn)值小于1×10的SNP 位點(diǎn)；

⑤刪除Y 染色體上的SNP 位點(diǎn)。

基因型數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)質(zhì)量控制后，篩選掉18 774 個(gè)SNP 標(biāo)記，最終共得到296 個(gè)個(gè)體，32 541 個(gè)SNP 用于后續(xù)分析。

1.3 遺傳參數(shù)估計(jì) 本研究使用AIREMLF90對(duì)杜洛克和大白豬的生長(zhǎng)性狀進(jìn)行遺傳參數(shù)評(píng)估，其模型如下：

1.4 單步全基因組關(guān)聯(lián)分析 ssGWAS 是根據(jù)Wang等和Aguilar 等使用BLUPF90系列軟件進(jìn)行的。表型和系譜數(shù)據(jù)使用RENUMF90進(jìn)行處理；使用POSTGSF90將基因組估計(jì)育種值（Genomic Estimated Breeding Values，GEBV）效應(yīng)轉(zhuǎn)化為SNPs效應(yīng)，并計(jì)算相鄰窗口的解釋方差。本實(shí)驗(yàn)采用單性狀動(dòng)物模型進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)模型寫成：

其中，是根據(jù)等位基因頻率編碼的標(biāo)記矩陣（aa=0，Aa=1，AA=2），D 為SNP 方差的權(quán)值對(duì)角矩陣（最初=），為權(quán)重因子。根據(jù)SNP 可以推導(dǎo)出權(quán)重因子。

按照以下步驟①～⑥計(jì)算SNP 效應(yīng)值和權(quán)重：

在第1 次迭代中使=；

計(jì)算=；

使用ssGBLUP 計(jì)算整個(gè)數(shù)據(jù)的GEBV；

使SNP 權(quán)重標(biāo)準(zhǔn)化以保持總遺傳方差不變；

重新回到第②步計(jì)算。

通過(guò)步驟②～ ⑥循環(huán)迭代計(jì)算SNP 權(quán)重，迭代增加具有較大影響的SNPs 的權(quán)重，并吸收了那些具有較小影響的SNPs。該程序基于精度進(jìn)行了不同的迭代，本研究選擇了一次迭代。第個(gè)SNP 窗口解釋的遺傳方差百分比計(jì)算如下：

Beissinger 等人曾報(bào)道，與較大的窗口尺寸相比，5 或10 個(gè)SNPs 的滑動(dòng)窗口識(shí)別出的QTL 和假陽(yáng)性的比率是所有方法中的誤報(bào)最少的，所以本實(shí)驗(yàn)計(jì)算了由5 個(gè)相鄰SNPs 的滑動(dòng)窗口解釋的加性遺傳方差的比例。

1.5 候選區(qū)域注釋 利用豬參考基因組數(shù)據(jù)庫(kù)SScrofa11.1（https://www.animalgenome.org/cgi-bin/QTLdb/）尋找顯著SNP 位點(diǎn)附近的基因是否與生長(zhǎng)性狀有關(guān)的QTL。以Susscrofa11.1 為參考基因組，在Ensembl（http://asia.ensembl.org/index.html）數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定全基因組顯著SNPs 附近的基因，之后通過(guò)GeneCards（https://www.genecards.org/）和NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）公共網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)確認(rèn)候選基因。使用KOBAS（http://kobas.cbi.pku.edu.cn/genelist/）對(duì)候選基因進(jìn)行Gene Ontology（GO）功能注釋和KEGG 信號(hào)通路分析。

2 結(jié)果

2.1 性狀表型統(tǒng)計(jì) 該研究對(duì)豬群體型性狀數(shù)據(jù)進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)分析，分析內(nèi)容包括：最大值、最小值、平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、變異系數(shù)、遺傳力（表1）。描述性統(tǒng)計(jì)分析體現(xiàn)了表型性狀的基本特征，從表1 中得知，BF的平均值為15.80，但變異系數(shù)較高，達(dá)到22.34%；LMD 的平均值為54.34，標(biāo)準(zhǔn)差為5.79，變異系數(shù)較??；LMA 的平均值為45.17，標(biāo)準(zhǔn)差為6.02。性狀的頻率分布圖顯示均基本符合正態(tài)分布（圖1），可進(jìn)行后續(xù)的關(guān)聯(lián)分析。

表1 表型性狀的描述性統(tǒng)計(jì)分析

圖1 3 個(gè)性狀的頻率分布圖

2.2 遺傳參數(shù)分析結(jié)果 利用AIREMLF90 軟件對(duì)遺傳方差、殘差方差和遺傳力進(jìn)行了估算。遺傳力為遺傳方差除以遺傳方差和殘差方差之和。所有估計(jì)的遺傳參數(shù)見(jiàn)表2。由表2 可知，3 個(gè)性狀均屬于中等遺傳力，BF、LMA 和LMD 的遺傳力分別為0.48、0.49 和0.56。

表2 3 個(gè)性狀所估計(jì)的遺傳參數(shù)

本研究中豬的3 個(gè)生長(zhǎng)性狀的表型相關(guān)系數(shù)和遺傳相關(guān)性分析結(jié)果見(jiàn)表3。由表3 可知，BF、LMD、LMA 3 個(gè)生長(zhǎng)性狀的遺傳相關(guān)。其中LMD 與LMA 的相關(guān)系數(shù)最高，達(dá)到0.94，而BF 與其他2 個(gè)性狀之間的相關(guān)系數(shù)較低。

表3 生長(zhǎng)性狀表型相關(guān)系數(shù)和遺傳相關(guān)性

2.3 單步全基因組關(guān)聯(lián)分析結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)選擇由5 個(gè)連續(xù)的SNPs 劃分為一個(gè)窗口，用于后續(xù)單步全基因組關(guān)聯(lián)分析的共有32 541 個(gè)窗口。如圖2 所示，x 軸表示染色體窗口的位置，y 軸表示每個(gè)窗口解釋的遺傳變異百分比，每個(gè)點(diǎn)代表1 個(gè)由5 個(gè)相鄰的SNPs 構(gòu)成的窗口，水平線表示顯著性水平（本研究中為遺傳變異比例=1%）。確定了26、29、43 個(gè)相關(guān)的5-SNP 窗口，分別解釋了BF、LMD 和LMA 總遺傳方差的1%及以上。共有35 個(gè)基因組區(qū)域與生長(zhǎng)性狀相關(guān)，分別包括BF、LMD 和LMA 的10、11、14 個(gè)區(qū)域（表4）。其中BF顯著SNPs 窗口主要分布于染色體1、2、4、5、10、12 和16 上的10 個(gè)基因組區(qū)域且最高區(qū)域解釋了5.030%的遺傳變異；LMD 顯著SNPs 窗口主要分布于染色體1、2、5、7、11、13、14 和17 上的11 個(gè)基因組區(qū)域且最高區(qū)域解釋了8.190%的遺傳變異；LMA 顯著SNPs 窗口主要分布于染色體1、4、5、8、9、10、11、13、14和15 上的14 個(gè)基因組區(qū)域且最高區(qū)域解釋了4.698%的遺傳變異。

表4 生長(zhǎng)性狀相關(guān)基因組區(qū)域

圖2 生長(zhǎng)性狀單步全基因組關(guān)聯(lián)分析曼哈頓圖

本研究利用Ensembl 數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)關(guān)聯(lián)分析所篩選出的顯著位點(diǎn)進(jìn)行比對(duì)和分析，最終確定該位點(diǎn)開(kāi)始至結(jié)束的物理信息、距該位點(diǎn)最近或與生長(zhǎng)性狀有關(guān)的候選基因以及該候選基因與SNP 的距離。

2.4 GO 和KEGG 富集分析 為探究候選基因的生物學(xué)功能以及與其他基因或分子之間的聯(lián)系，對(duì)候選基因進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析，結(jié)果顯示，BF 富集顯著的GO 條目主要包括：細(xì)胞群增殖的調(diào)節(jié)（Regulation of Cell Population Proliferation）、組織發(fā)育（Tissue Development）和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)（Regulation of Cell Cycle）等，KEGG 通路主要包括：代謝途徑（Metabolic Pathways）、脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路（Adipocytokine Signaling Pathway）和甲狀旁腺激素的合成、分泌和作用（Parathyroid Hormone Synthesis，Secretion and Action）等（<0.05）；LMD 富集顯著的GO 條目主要包括：有絲分裂細(xì)胞周期相變的調(diào)節(jié)（Regulation of Mitotic Cell Cycle Phase Transition）、脂肪酸-氧化（Fatty Acid Beta-Oxidation）和微管組織中心（Microtubule Organizing Center）等（<0.05），KEGG 通路主要包括：脂肪酸降解（Fatty Acid Degradation）、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的降解（Valine，Leucine and Isoleucine Degradation）和脂肪酸代謝（Fatty Acid Metabolism）等；LMA 富集顯著的GO 條目主要包括：跨膜受體蛋白酪氨酸激酶接頭活性（Transmembrane Receptor Protein Tyrosine Kinase Adaptor Activity）、胚胎骨骼系統(tǒng)發(fā)育（Embryonic Skeletal System Development）和神經(jīng)元分化（Neuron Differentiation）等，KEGG 通路主要包括：丙酸酯新陳代謝（Butanoate Metabolism）、-丙氨酸新陳代謝（Beta-Alanine Metabolism）和脂肪酸代謝（Fatty Acid Metabolism）等（<0.05）。表5 為部分候選基因與生長(zhǎng)性狀相關(guān)的富集通路。

表5 候選基因的顯著SNPs 窗口相關(guān)的GO 和KEGG 通路

3 討 論

生長(zhǎng)性狀和家畜的骨骼生長(zhǎng)及肌肉發(fā)育等多種過(guò)程直接相關(guān)，在生豬產(chǎn)業(yè)中通常是直接衡量豬產(chǎn)肉能力及生長(zhǎng)發(fā)育能力的標(biāo)志，影響豬的生產(chǎn)效率和經(jīng)濟(jì)效益。GWAS 是檢測(cè)與目標(biāo)性狀相關(guān)的候選基因最有效的方法之一。本實(shí)驗(yàn)采用ssGWAS 的方法對(duì)296 頭豬BF、LD、LEA 性狀的遺傳變異進(jìn)行研究，然后通過(guò)GO 和KEGG分析進(jìn)一步探索了生長(zhǎng)相關(guān)的基因及其參與途徑。

本研究在BF 性狀中檢測(cè)到10 個(gè)基因組區(qū)域分別解釋了超過(guò)1%的遺傳變異，在所確定的這些區(qū)域中，鑒定出了12 個(gè)相關(guān)候選基因（和基 因）。其中，BF 性狀富集到的顯著GO 條目：組織發(fā)育（Tissue Development）（GO：0009888，=0.012），調(diào)節(jié)細(xì)胞群增殖（Regulation of Cell Population Proliferation）（GO：0042127，=0.001）這可能與生長(zhǎng)性狀有關(guān)。這2 個(gè)GO 條目包含和STAT3 基因。值得注意的是，位于上皮細(xì)胞分化（Epithelial Cell Differentiation）（GO:0030855）的GO 條目中，基因據(jù)研究可以增加神經(jīng)元分化和促進(jìn)軸突生長(zhǎng)，調(diào)節(jié)發(fā)育、分化相關(guān)過(guò)程，可能是胚胎發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子?；蚓幋a促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子家族的一個(gè)成員，被認(rèn)為在哺乳動(dòng)物的生長(zhǎng)和發(fā)育中起重要作用。Seong 等表明可能是胴體性狀的候選基因并表明和原皮黑皮質(zhì)素（POMC）之間的相互作用強(qiáng)烈影響牛的胴體性狀。因此，基因可能在豬中有相同的作用，影響豬的生長(zhǎng)發(fā)育。有研究證明的肝臟過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致顯著的肝臟脂肪變性和血壓升高。此外，位于細(xì)胞群增殖的負(fù)調(diào)節(jié)（Negative Regulation of Cell Population Proliferation）（GO：0008285）的GO 條目中，信號(hào)傳感器和轉(zhuǎn)錄激活劑3（）是一種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞增殖、存活和分化中起著至關(guān)重要的作用。這些基因與BF 直接相關(guān)，也可能是BF 的潛在基因。

本研究在LMD 性狀中檢測(cè)到11 個(gè)基因組區(qū)域解釋了超過(guò)1%的遺傳變異，在所確定的這些區(qū)域中共鑒定出13 個(gè)候選基因（和基因）。LMD 性狀富集到的顯著GO 和KEGG 條目：脂肪酸-氧化（Fatty Acid Beta-Oxidation）（GO:0006635，=0.014），脂肪酸降解（Fatty Acid Degradation）（ssc00071，=0.020），纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解（Valine，Leucine and Isoleucine Degradation）（ssc00280，=0.024）和脂肪酸代謝（Fatty Acid Metabolism）（ssc01212，=0.028），這些條目中共同包含的基因?yàn)?。除此之外，代謝途徑（Metabolic Pathways）（ssc01100）和脂肪酸伸長(zhǎng)（Fatty Acid Elongation）（ssc00062）這2 個(gè) 條目中也包含基因，推斷與生長(zhǎng)性狀相關(guān)。其中基因?qū)儆贜EK 基因家族，NEK 基因家族成員在細(xì)胞周期控制中具有重要作用，據(jù)報(bào)道與 DNA 損傷反應(yīng)有關(guān)。例如，Sabir 等研究表明耗竭會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞活力的長(zhǎng)期喪失。此外，據(jù)報(bào)道基因在體外和體內(nèi)結(jié)腸直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲中發(fā)揮刺激作用。此外，另一個(gè)候選基因，葡糖胺基（N-乙?；┺D(zhuǎn)移酶3（）在研究中被證明促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移，因此該基因可能與生長(zhǎng)發(fā)育等過(guò)程相關(guān)。

本研究在LMA 性狀中檢測(cè)到14 個(gè)基因組區(qū)域解釋了超過(guò)1%的遺傳變異，在這些區(qū)域中還確定了14 個(gè)相關(guān)的候選基因（和基 因），其中LMA 富集到的顯著GO 和KEGG 條目：神經(jīng)元分化（Neuron Differentiation）（GO：0030182，=0.036）和脂肪酸代謝（Fatty Acid Metabolism）（ssc01212，=0.028），其中，大腦皮層發(fā)育（Cerebral Cortex Devel opment）（GO：0021987）條目也包含基因?；蛭挥谥舅嵘扉L(zhǎng)（ssc00062）、脂肪酸降解（ssc00071）和代謝途徑（ssc01100）的KEGG 條目中，可以推測(cè)是一個(gè)與生長(zhǎng)性狀相關(guān)的候選基因。例如跨膜前后轉(zhuǎn)化1（），據(jù)推測(cè)是的下游效應(yīng)器，它可能通過(guò)在發(fā)育過(guò)程中轉(zhuǎn)導(dǎo)或傳輸軸向骨骼圖案形成所需的細(xì)胞外信息來(lái)發(fā)揮作用。此外，Liang 等研究發(fā)現(xiàn)人類中運(yùn)輸?shù)鞍踪|(zhì)顆粒復(fù)合物亞基 9（9）中的功能喪失突變導(dǎo)致一種罕見(jiàn)的神經(jīng)發(fā)育綜合征，其特征是小頭畸形和肥胖，Bodnar 等也表明在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和疾病中的作用正在得到新的揭示。ST8-N-乙酰神經(jīng)氨酸-2，8-唾液酸轉(zhuǎn)移酶6（）被證明可能與脂質(zhì)代謝過(guò)程和肌肉脂肪含量有關(guān)。對(duì)接蛋白2（）基因參與細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖，但它們?cè)诩∪獍l(fā)育和脂肪沉積中的作用機(jī)制尚不清楚。因此，有必要進(jìn)一步研究這些基因在豬生長(zhǎng)中的作用，為后續(xù)研究提供相應(yīng)參考依據(jù)。

4 結(jié) 論

本研究對(duì)豬場(chǎng)的296 頭母豬進(jìn)行了ssGWAS 分析，共鑒定到35 個(gè)候選基因。其中BF 有12 個(gè)，分別為和基因；LMD 有13 個(gè)，分別為和基因；LMA 有14 個(gè)，分別為和基因。使用注釋基因進(jìn)行GO 和KEGG 分析，主要參與MP、ESSD 和FAD 等通路。本研究篩選出了一些與生長(zhǎng)有關(guān)的基因，為豬生長(zhǎng)性狀的分子標(biāo)記輔助選擇育種提供參考。但很多基因還沒(méi)有在畜禽中報(bào)道，這些候選基因的功能有待進(jìn)一步探索。