哺乳動(dòng)物受精前性別控制研究進(jìn)展

石 詠，王楚端*，邢 凱，韓 余，劉怡冰，劉華濤

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100094；2.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，北京 102206；3.宣化區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河北張家口 075000）

哺乳動(dòng)物性別控制可以提高生產(chǎn)效率，讓公畜和母畜發(fā)揮各自的生產(chǎn)性能優(yōu)勢(shì)。當(dāng)前利用奶牛性控精液生產(chǎn)性別后代的準(zhǔn)確率可達(dá)90% 以上，但流式細(xì)胞儀作為分選動(dòng)物X/Y 精子的主流手段，其在豬和羊上因成功率和分選效率低而應(yīng)用較少。目前，利用基因編輯技術(shù)或免疫學(xué)方法分選性控精液具備各自優(yōu)勢(shì)，但仍處在試驗(yàn)階段。通過(guò)對(duì)X/Y 精子的差異基因和差異蛋白探索得到影響X/Y 精子分選的候選基因和蛋白，是目前研究的趨勢(shì)。

性別決定機(jī)制研究經(jīng)歷了漫長(zhǎng)的過(guò)程。性別調(diào)控基因及通路研究為性控方法的產(chǎn)生打下基礎(chǔ)，很多性控方法與性別相關(guān)基因蛋白有直接聯(lián)系，或從性別相關(guān)基因與蛋白受到啟發(fā)得到。性控基因不能完全被用于生產(chǎn)性控后代，原因是性別由多種基因決定，性別決定通路復(fù)雜，僅靠對(duì)性控基因改造（比如基因編輯）做不到產(chǎn)生大量性控后代，更做不到生產(chǎn)應(yīng)用。性別決定調(diào)控機(jī)制對(duì)于新技術(shù)開(kāi)發(fā)有著重要的參考意義，現(xiàn)有的性控技術(shù)主要分為受精前和受精后，其中，受精后要達(dá)到后代性別控制付出的代價(jià)較大，且需要對(duì)不是預(yù)期性別的后代做處理，造成資源浪費(fèi)，操作不易。根據(jù)哺乳動(dòng)物的生殖特點(diǎn)，在受精前對(duì)精子進(jìn)行處理使X/Y 精子分離是最高效的方法。本文綜述了哺乳動(dòng)物受精前以分離X/Y精子為主的性控技術(shù)及其在畜禽上的應(yīng)用，為揭示性別產(chǎn)生的調(diào)控機(jī)理、性控技術(shù)在生產(chǎn)中更高效地應(yīng)用提供參考。

1 性別決定的基因調(diào)控機(jī)制

1.1 雄性性別發(fā)育 性染色體在哺乳動(dòng)物性別和分化中起著決定性作用。1900 年McClung 在蚱蜢和其他直翅目昆蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)了一種可以決定性別的染色體，隨后于1902 年提出著名的性別染色體理論。Muller 于1914年提出異質(zhì)性性染色體進(jìn)化理論，即哺乳動(dòng)物的性染色體對(duì)是從不同的普通常染色體對(duì)進(jìn)化得來(lái)，這些常染色體對(duì)就是性別決定位點(diǎn)上具有差異的等位基因。Jacobs 等在1959 年提出了Y 染色體對(duì)于哺乳動(dòng)物中的雄性性別決定和分化有重要意義和作用，是重要的性別發(fā)育因子。1987 年P(guān)age 等發(fā)現(xiàn)了1 個(gè)性別決定候選基因（Zinc-Finger Y）即鋅指蛋白，但隨后被Palmer 等證明在哺乳動(dòng)物中（Sex-determination Region on Y）是Y 染色體上決定雄性的基因?；虮磉_(dá)啟動(dòng)了雄性性征表達(dá)，的功能區(qū)是（High Mobility Group Box），氨基酸排列順序在HMG box 內(nèi)保持著很高的保守性，DNA 與非組蛋白質(zhì)的結(jié)合就發(fā)生在這里；是調(diào)節(jié)基因的上游靶點(diǎn)，可調(diào)節(jié)性腺中支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的形成，和基因的產(chǎn)物激活的表達(dá)，從而介導(dǎo)早期性腺發(fā)育途徑。的下游靶點(diǎn)有等，SRY 蛋白激活了表達(dá)，和可配合上調(diào)，在2 種性別中都是最初形成繆勒氏管發(fā)育所必需的，而在有睪丸的雄性胚胎上，睪丸的支持細(xì)胞會(huì)自然地分泌一種物質(zhì)抑制繆勒氏管，使繆勒氏管退化，沃夫氏管分化為輸精管和精囊等。

1.2 雌性性別發(fā)育 抑制雄性基因表達(dá)是卵巢發(fā)育的特點(diǎn)，促進(jìn)的表達(dá)，同時(shí)抑制表達(dá)，調(diào)控卵巢發(fā)育。X 染色體上的基因與雌性性別決定相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)，在人類自我復(fù)制的過(guò)程中，出現(xiàn)了性別逆轉(zhuǎn)，提示其可能是抗睪丸形成的因子。基因與基因在小鼠上互為拮抗，通過(guò)抑制和阻礙生殖嵴向雄性分化，使小鼠朝著雌性方向發(fā)育，最終繆勒氏管頭部發(fā)育后會(huì)成一條輸卵管，其中段分化為子宮的底部和體部，兩側(cè)的繆勒氏管會(huì)逐漸合并成為子宮頸及一部分的陰道。

2 受精前X/Y 精子的分離

通過(guò)性別控制技術(shù)生產(chǎn)哺乳動(dòng)物后代，一方面可以用于保護(hù)珍惜動(dòng)物，另一方面可以提高養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益，當(dāng)下生產(chǎn)中多采用性控精液的方法。當(dāng)雄性哺乳動(dòng)物性成熟時(shí)，一些精原細(xì)胞于睪丸里的曲細(xì)精管內(nèi)分化，首先形成初級(jí)精母細(xì)胞，減數(shù)分裂2 次以后，精子細(xì)胞數(shù)量增加，單倍體精子細(xì)胞經(jīng)過(guò)形態(tài)變化形成具有完整結(jié)構(gòu)的成熟精子，在這個(gè)過(guò)程中，含X 染色體的精子和含Y 染色體的精子的比例為1:1，在精卵結(jié)合時(shí)后代的性別就已確定。受精前采用性控技術(shù)包括流式細(xì)胞儀法、X/Y 精子運(yùn)動(dòng)分離法和免疫學(xué)方法。

2.1 流式細(xì)胞儀分離法 流式細(xì)胞儀最初是在20 世紀(jì)60 年代為醫(yī)學(xué)研究和診斷而開(kāi)發(fā)，目前廣泛用于分析或分選單個(gè)細(xì)胞。Daniel Pinkel 開(kāi)發(fā)的流式細(xì)胞儀將精子定位，以便使用精子頭的扁平側(cè)面進(jìn)行DNA 含量的精確測(cè)量。哺乳動(dòng)物攜帶X、Y 染色體的精子DNA含量有明顯差異，X 精子的DNA 含量較Y 精子多出3.0%～4.5%，如家畜牛X 精子比Y 精子的DNA 含量多出約3.8%，豬含X 染色體的精子比含Y 染色體的精子的DNA 含量多出3.6%。在不損傷精子活力和受精能力的情況下，對(duì)動(dòng)物精子細(xì)胞的DNA 進(jìn)行特異性結(jié)合的熒光染色是流式細(xì)胞儀分離法的重要步驟。常用的染色劑為Hoechst33342，在經(jīng)波長(zhǎng)大約為350 nm 的紫外光激光照射后，不同DNA 含量的精子產(chǎn)生有差別的熒光強(qiáng)度，含X 染色體的精子會(huì)明顯強(qiáng)于含Y 染色體的精子。流式細(xì)胞儀根據(jù)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱，使X 精子攜帶上正電，Y 精子攜帶上負(fù)電，當(dāng)精子通過(guò)電場(chǎng)時(shí)就會(huì)發(fā)生偏移，進(jìn)入不同的收集管，從而使X/Y 精子分離。

Johnson 等于1989 年使用流式細(xì)胞儀把兔子的精液分離為攜帶X 染色體的精子和Y 染色體的精子，攜帶X 染色體的性控精液授精后得到后代為雌性兔子的比例是94%，攜帶Y 染色體的性控精液授精后的后代為雄性兔子比例是81%。Seidel 等用流式細(xì)胞儀分離優(yōu)秀種公牛精液并對(duì)母牛進(jìn)行人工授精，含X 染色體的精子授精的母牛生產(chǎn)的后代母犢的準(zhǔn)確率大約為83%，用含Y 染色體的精子授精的母牛生產(chǎn)的后代公犢的準(zhǔn)確率大約為90%。常生寶等用性別控制凍精經(jīng)人工授精后得到母犢的比例為68%，證明了性控凍精的有效性。曾有權(quán)等使用流式細(xì)胞儀成功分離精子后，輸含Y 染色體精子的母豬生產(chǎn)的6 只仔豬都為雄性，輸含X 染色體精子生產(chǎn)的12 只仔豬中有11 只為雌性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)流式細(xì)胞儀的分離過(guò)程并沒(méi)有影響X/Y 精子的核酸含量。利用新的技術(shù)受精也可以避免冷凍精液量過(guò)少和受胎率低等問(wèn)題，流式細(xì)胞儀生產(chǎn)牛性控凍精商用現(xiàn)在已有近20 年，在豬、羊、犬類等也都順利分離了X/Y 精子，但沒(méi)有實(shí)現(xiàn)商業(yè)化應(yīng)用。

在分離X/Y 精子研究中，流式細(xì)胞儀具有較高的分離效率，分選速度可以達(dá)20 000 個(gè)細(xì)胞/s，準(zhǔn)確率可以達(dá)到90%以上，是現(xiàn)在最為可靠的分離辦法，但仍存在對(duì)精子有不可逆損傷、分選后精子不易儲(chǔ)存等缺點(diǎn)。對(duì)于豬來(lái)說(shuō)，鑒于豬獨(dú)特的子宮解剖結(jié)構(gòu)，母豬最佳受孕率所需的精子數(shù)量很高，一次受精需要活精子數(shù)達(dá)到15 億～20 億個(gè)。分離出相應(yīng)數(shù)量的精子需要時(shí)間較長(zhǎng)，試驗(yàn)中一般采用手術(shù)的方法進(jìn)行。與普通精子授精的母豬相比，用性控精子授精的母豬妊娠早期流產(chǎn)率更高。對(duì)于牛來(lái)說(shuō)，采用每管精子數(shù)為2×10個(gè)的性控凍精對(duì)母牛進(jìn)行人工授精，其受孕率只有常規(guī)凍精的60%～80%。Winters 等研究發(fā)現(xiàn)，分選減少了豬精子與輸卵管細(xì)胞聚集體周?chē)鷱?fù)雜基質(zhì)的結(jié)合，可能導(dǎo)致精子生育能力下降。呂小青等檢測(cè)發(fā)現(xiàn)3 頭種公牛經(jīng)流式細(xì)胞儀分離后精液的活率與鮮精未出現(xiàn)差異，但冷凍4 h 后，解凍后活率差異顯著，證明了冷凍保存對(duì)于分離后公牛的精液活率的影響更大。張斌等發(fā)現(xiàn)豬精子凍融后在能量代謝以及受精和抗氧化能力等方面均受到影響。流式分選過(guò)程中對(duì)精子的機(jī)械損傷也是要關(guān)注的問(wèn)題之一，Nakao 等采用微流控芯片技術(shù)的細(xì)胞分選儀對(duì)小鼠精子進(jìn)行分選，降低了細(xì)胞分選過(guò)程中小鼠精子的損傷。利用改進(jìn)的流式分選方法在分選過(guò)程中創(chuàng)造一個(gè)破壞性較小的環(huán)境也可以保持精子的完整性。

流式細(xì)胞儀是分選精子的有效工具，其在奶牛上的應(yīng)用已經(jīng)相對(duì)成熟，目前有90% 左右的牧場(chǎng)使用性控精液，實(shí)際使用中的效果有所差距，理想情期受胎率可達(dá)60%～80%，但也有受胎率較低的情況。產(chǎn)生性控后代的準(zhǔn)確率都在90% 以上，流式細(xì)胞儀產(chǎn)生的性控精液還存在機(jī)械損傷，密度不高和價(jià)格偏高等問(wèn)題，并且需要專業(yè)的輸精技術(shù)，仍有很多不足需要優(yōu)化。

2.2 精子的運(yùn)動(dòng)分離法 通過(guò)控制或者改變X/Y 精子的運(yùn)動(dòng)活力，使X/Y 精子到達(dá)受精地點(diǎn)（如子宮或輸卵管）出現(xiàn)時(shí)間差，就可以改變后代的性別。Umehara 等發(fā)現(xiàn)小鼠精子X(jué) 染色體編碼的Toll 樣受體7/8 和精子的運(yùn)動(dòng)有關(guān)，表達(dá)定位于X 精子尾部，而表達(dá)定位于X 精子中段；在不改變精子的生存能力或頂體形成的情況下，的配體R848，的配體R837 的激活選擇性地抑制了攜帶X 染色體的精子運(yùn)動(dòng)，但沒(méi)有抑制Y 精子運(yùn)動(dòng)，試驗(yàn)證明位于精子中部的激活抑制了線粒體活性，從而使ATP 減少，而位于精子尾部的的激活抑制了細(xì)胞質(zhì)糖酵解也減少了ATP 產(chǎn)生，而ATP 是精子前進(jìn)的動(dòng)力來(lái)源；進(jìn)一步人工授精試驗(yàn)得到胚胎的結(jié)果表明，上層精子中雄性胚胎的比例為89.6%，下層精子中雌性胚胎的比例為69.8%。在此基礎(chǔ)上，Umehara 等用R848 處理公牛精子，用上層的精子通過(guò)體外受精獲得了77 個(gè)胚胎，雄性胚胎的比例為91.3%，下層精子中雌性胚胎的比例為84.2%。周正娜探索得到的R848 最佳濃度0.3 μmol/L，可以用來(lái)處理老鼠精子。以上結(jié)果都說(shuō)明了從精子的運(yùn)動(dòng)性去分離X/Y 精子是可行的，但還存在準(zhǔn)確率不高的問(wèn)題。

Oyeyipo 等在基于不同環(huán)境下人類X 和Y 精子之間的生存力差異來(lái)分離X 和Y 精子，試驗(yàn)證明了精子處于不同的酸堿度（pH 為5.5、6.5、7.5、8.5 和9.5）下，pH 為5.5 時(shí)導(dǎo)致攜帶X 染色體的精子大量富集；在不同溫度（37、41、45℃）孵育25 min 后，與37℃標(biāo)準(zhǔn)溫度下的對(duì)照組相比，41℃含X 染色體精子的發(fā)生率增加7%，在45℃時(shí)，與對(duì)照組相比攜帶X 染色體精子的發(fā)生率增加2%；當(dāng)精子處于不同濃度（50、750、1 000 μmol/L）的HO，在濃度為750 μmol/L 時(shí)攜帶X 染色體精子的發(fā)生率增加了3%。Park 等研究發(fā)現(xiàn)，與原始條件（pH 為7.2）相比，在酸性環(huán)境（pH 為6.2）下，儲(chǔ)存2 d 的豬活精子的X/Y 比值達(dá)到最大（1.2:1），但沒(méi)有影響精子的功能和與生育力有關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)；此外，在使用acidic BTS 保存前2 d 的豬精子對(duì)母豬進(jìn)行授精會(huì)增加雌性幼崽數(shù)量。

以上研究說(shuō)明在處于低pH，高溫和高氧化應(yīng)激條件下，X/Y 精子運(yùn)動(dòng)活性出現(xiàn)差異，可以利用這種現(xiàn)象進(jìn)行性控精子的分離，利用精子的運(yùn)動(dòng)性分離X/Y 精子是目前興起的研究方向，該技術(shù)在使小鼠、奶牛（）和奶山羊（）的試驗(yàn)中已經(jīng)得到驗(yàn)證。該技術(shù)操作方便，更利于在生產(chǎn)中應(yīng)用，具有發(fā)展?jié)摿Α?/p>

2.3 基因缺失、沉默、剪切法 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Sly 通過(guò)調(diào)節(jié)減數(shù)分裂后的性染色質(zhì)（PMSC）抑制單倍體精子細(xì)胞中性染色體的整體轉(zhuǎn)錄水平，Y 染色體（Yq）的部分缺失減少了拷貝數(shù)，導(dǎo)致精子細(xì)胞中性連鎖基因過(guò)度表達(dá)，在Y 染色體缺失的雄性小鼠中，含Y 的精子比含X 的精子在形態(tài)上扭曲得更嚴(yán)重，會(huì)影響Y 精子通過(guò)生殖道到達(dá)受精部位的能力。Alvssa 等研究發(fā)現(xiàn)X 連鎖基因缺失的雄性小鼠生育更多的雄性后代。通過(guò)對(duì)性別染色體處理也能達(dá)到產(chǎn)生性控后代的目的。

Zhang通過(guò)沉默精子發(fā)生過(guò)程中的同源基因（鋅指X/Y 染色體轉(zhuǎn)錄因子）來(lái)改變小鼠后代性別比例；構(gòu)建了4 個(gè)重組載體PRZ1、PRZ2、PRZ3 和PRZ4（RNAi-Ready-PSiren-retroq-zSgreen）用于阻斷基因，重組載體Psilencer/Zfy-shRNA 用于阻斷基因，注射PRZ1、PRZ3 和PRZ4 后mRNA 表達(dá)顯著低于對(duì)照組，PRZ4 組78.7% 的后代為雄性，顯著高于對(duì)照組；相反，注射Psilencer/Zfy-shRNA 后，基因的表達(dá)極顯著降低，31.0%的后代為雄性，顯著低于對(duì)照組。Wei 等通過(guò)構(gòu)建3 種重組基因表達(dá)的載體pLL3.7/A、pLL3.7/B 和pLL3.7/C 沉默基因來(lái)改變馬鹿后代性別比例，與對(duì)照組相比，pLL3.7/A顯著抑制了基因的表達(dá)，pLL3.7/A 組生產(chǎn)94 只馬鹿，包括68 只雄性和26 只雌性，雄性比率（72.34%）極顯著高于對(duì)照組。在犬類上，紀(jì)俊明在細(xì)胞水平上篩選出對(duì)基因干擾效果較好的表達(dá)質(zhì)粒載體pLL3.7-xa，進(jìn)行犬體內(nèi)RNAi 試驗(yàn)，與預(yù)期不同，后代性別比例出現(xiàn)了反向偏移，雌性比例顯著升高，還需進(jìn)一步探究原因。袁立崗等運(yùn)用干擾基因載體對(duì)公牛的睪丸進(jìn)行處理，采集精液成功受精后，母犢率達(dá)到70% 以上。在對(duì)人類的不育患者研究中發(fā)現(xiàn)，如果缺失基因會(huì)減少生殖細(xì)胞的產(chǎn)生，李崇選取小鼠Y 染色體上的作為靶基因，對(duì)小鼠受精卵注射了抗Dby 的siRNA，出生的小鼠雌雄性別比例與對(duì)照組相比并沒(méi)有顯著差異，但是雄性小鼠繁殖后代出現(xiàn)了睪丸發(fā)育不全現(xiàn)象。

Kato 等通過(guò)在原核期卵母細(xì)胞中微注射TALEN RNA，產(chǎn)生了1 只SRY 敲除小鼠，這只被敲除的老鼠有雌性的外生殖器和內(nèi)生殖器，敲除小鼠表現(xiàn)出發(fā)情周期，并出現(xiàn)雌性交配行為，但不育。Van Eenennaam在牛的基因改良項(xiàng)目中使用基因組編輯，以期產(chǎn)生全雄性后代，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果仍然不清楚基因是否是所有雄性哺乳動(dòng)物發(fā)育所需的唯一基因。Kurtz 等使用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了基因敲除，產(chǎn)生了基因HMG 結(jié)構(gòu)域5'部分上游約72 bp 缺失的豬后代，更進(jìn)一步的結(jié)果表明，其中一個(gè)后代基因產(chǎn)生了移碼突變，但沒(méi)有發(fā)生雌雄性別逆轉(zhuǎn)。目前的研究證明基因與性別調(diào)控有關(guān)，缺乏多梳基團(tuán)蛋白的小鼠在性腺，腎上腺和脾臟發(fā)育中表現(xiàn)出缺陷，白米雪改進(jìn)多種CRISPR/Cas9 體系對(duì)基因敲除，用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)成功得到了Cbx2KO HEK293T 單克隆細(xì)胞系，并在基因水平和蛋白水平上進(jìn)行了效率驗(yàn)證。是位于決定性別的Y 染色體上多拷貝基因，其編碼的核蛋白與精子發(fā)生有關(guān)，李崇以小鼠的基因作為研究對(duì)象，利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)對(duì)基因多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行了切割，通過(guò)檢測(cè)熒光效率證明了sgRNA6 的52.64%切割率為最佳，可以破壞Y 染色體，證明了其可用于對(duì)雄性Y 染色體的切割。

利用鋅指核酸酶（ZFN）、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（TALEN）和 CRISPR/Cas 等基因編輯技術(shù)可以對(duì)性別精子做基因?qū)用娴母脑?，使X/Y 精子的部分基因缺失，以達(dá)到對(duì)X/Y 精子功能的影響。先前的研究表明，在小鼠和兔子中敲除基因會(huì)抑制胎兒性腺嵴的睪丸發(fā)育，從而導(dǎo)致雌性表型。這些新技術(shù)為確定豬的性別提供了巨大的機(jī)會(huì)，還需要進(jìn)一步研究以充分發(fā)揮其在實(shí)際應(yīng)用中的潛力。

2.4 免疫學(xué)方法 免疫學(xué)方法分離X/Y 精子是利用X/Y精子表面特異的蛋白制出特異抗體，抗原抗體結(jié)合后，影響X/Y 精子的運(yùn)動(dòng)性或者影響X/Y 精子與卵子結(jié)合的能力，X/Y 精子出現(xiàn)分層現(xiàn)象，再分離X/Y 精子。免疫學(xué)分離X/Y 精子方法建立的理論基礎(chǔ)主要是不同動(dòng)物精子中的基因組DNA 差異導(dǎo)致精子表面的蛋白產(chǎn)生差異。Chen 等在牛上鑒定得到X 和Y 精子中31 個(gè)表達(dá)有著顯著差異的基因，其中有27 個(gè)基因在攜帶X 染色體的精子中顯著性上調(diào)，有4 個(gè)在攜帶Y 染色體的精子中顯著性上調(diào)。鄭永富在牛的X、Y 精子鑒定到了25 個(gè)特異性表達(dá)的蛋白的位點(diǎn)，其中10 個(gè)蛋白位于X 精子上，15 個(gè)蛋白位于Y 精子上。

H-Y 抗 原（Histocompatibility Y Antigen）是Y 染色體上的抗原，為雄性動(dòng)物所特有且無(wú)器官或者組織的特異性，因?yàn)镠-Y 抗原由多個(gè)抗原表位組成，每個(gè)抗原表位具有8～11 個(gè)氨基酸的小肽，所以抗原特異性較弱。王乃東等發(fā)明了一種血清學(xué)H-Y 抗原基因DBY抗體制備的方法，得到的單克隆抗體對(duì)小鼠X/Y 精子進(jìn)行免疫分選，可以得到高純度的Y 精子。Soleymani等制備了一種針對(duì)牛的Y 染色體的山羊多克隆抗體（Bovine Sex Determining Region Y Chromosome），結(jié)果表明anti-bSRY pAb 與牛的Y 精子的結(jié)合力很高，并且不結(jié)合X 精子；在此基礎(chǔ)上，他們制備和純化了SRY2mAb 抗體，證實(shí)了SRY2mAb 具有與Y 染色體精子結(jié)合的能力。李蓉等利用Y 精子上的特異性基因研制了單克隆抗體的納米顆粒，對(duì)山羊和牛的X/Y 精子分離準(zhǔn)確率均達(dá)到85%。劉卓用不同濃度的SRY 抗體處理牛精液，選用的抗體是鼠源的單克隆抗體，其作用目標(biāo)為人SRY 蛋白，經(jīng)檢驗(yàn)該SRY 蛋白分子量為27 ku，在經(jīng)體外受精后對(duì)所得胚胎進(jìn)行性別鑒定，0 μg/L 對(duì)照組雌性比例為56%，200 μg/L 實(shí)驗(yàn)組為75%，400 μg/L 實(shí)驗(yàn)組為82%，提示了該種類型SRY 抗體在不同濃度下，處理牛精液后與對(duì)照組相比均極顯著影響了所得胚胎為雌性的比例，且對(duì)受精率和早期胚胎的發(fā)育沒(méi)有顯著影響。沈丹通過(guò)對(duì)荷斯坦種公牛的X/Y 精子蛋白組進(jìn)行測(cè)序發(fā)現(xiàn)，與含Y 染色體的精子組相比，8 個(gè)蛋白在含X 染色體的精子組中的表達(dá)量顯著上調(diào)，23 個(gè)蛋白在含X 染色體的精子組中的表達(dá)量顯著下調(diào)；并且找到了只在X 精子組中特異性表達(dá)的151 個(gè)蛋白，有88 個(gè)蛋白只在Y 精子組中特異性表達(dá)，經(jīng)驗(yàn)證其中CLRN3、SCAMP1 蛋白可作為特異性候選抗原進(jìn)行進(jìn)一步研究。

免疫學(xué)方法分離X/Y 精子具有很大的潛力，通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究動(dòng)物 X/Y 精子間的蛋白表達(dá)差異，篩選出性別特異性候選抗原蛋白，可以為利用免疫學(xué)方法生產(chǎn)性控精液提供參考。目前此方面的研究還集中于差異特異蛋白的篩選，對(duì)于找到的候選抗原蛋白也存在抗原性較弱，配體難以尋找或是價(jià)格高昂等限制因素，還需進(jìn)一步探索。

3 小 結(jié)

總的來(lái)說(shuō)，性別控制技術(shù)在生物學(xué)理論和科技進(jìn)步下逐步完善，能有效地控制動(dòng)物后代的性別，但性別控制的效果受多種因素影響，當(dāng)下的技術(shù)還存在諸多不足。如流式細(xì)胞儀法作為主流分選X/Y 精子的方法，在奶牛中得到商業(yè)應(yīng)用，生產(chǎn)出準(zhǔn)確率在90% 以上的性控凍精細(xì)管，但儀器昂貴、分離成本較高，對(duì)于豬等家畜還不適用；運(yùn)動(dòng)分離法操作簡(jiǎn)易，但尋找產(chǎn)生條件困難，準(zhǔn)確性有限；調(diào)節(jié)基因的方法需專業(yè)技術(shù)，包括免疫學(xué)方法分離X/Y 精子還停留在試驗(yàn)階段等。除了分離的效率和準(zhǔn)確率問(wèn)題，今后研究中還應(yīng)關(guān)注精液在分離過(guò)程中的損傷問(wèn)題、性控精液的保存、運(yùn)輸和授精方法等，同時(shí)從生理學(xué)和技術(shù)角度出發(fā)，探索動(dòng)物性別決定的關(guān)鍵基因和步驟，為性別控制技術(shù)的進(jìn)步提供重要材料。