LIMD2基因表達(dá)對食管癌細(xì)胞增殖、凋亡及ERK/MAPK信號通路的影響

李險(xiǎn)波,張志強(qiáng),韓小勇,甄志鵬,李煥芬,趙 欽 (.保定市第一中心醫(yī)院胸外科，河北 保定 07000；.河北省人民醫(yī)院胸外科，河北 石家莊 05005)

食管癌是消化道系統(tǒng)最常見的腫瘤之一[1]，其病死率居世界第6位，是世界第八大癌癥[2]。食管癌的發(fā)生發(fā)展涉及遺傳、表觀遺傳、基因及蛋白異常表達(dá)等多種途徑的改變[3]，闡明食管癌的致癌分子機(jī)制對食管癌的靶向治療具有重要意義。LIM結(jié)構(gòu)域(LIM domain，LIMD)可廣泛存在于真核生物中，能調(diào)控細(xì)胞黏附、運(yùn)動(dòng)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等相關(guān)基因表達(dá)，從而參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長發(fā)育進(jìn)程[4]。LIMD家族中的LIMD2目前已被證實(shí)與人類癌癥的發(fā)生和進(jìn)展相關(guān)[5]，且LIMD2已被確定為甲狀腺乳頭狀癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)志物，成為了腫瘤進(jìn)展的新效應(yīng)器[6]。但LIMD2在食管癌中的作用尚未明確。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)磷酸化活化后，可從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，并激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)控細(xì)胞增殖、生長、分化、凋亡等生命活動(dòng)過程[7]。且ERK/MAPK信號通路活化已被證實(shí)參與食管癌、結(jié)腸癌、甲狀腺癌等多種癌癥的發(fā)展過程[8]。有研究顯示，LIMD2能夠通過調(diào)控ERK/MAPK信號通路而影響甲狀腺癌進(jìn)展[9]。本研究就LIMD2對食管癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響及分子機(jī)制展開分析，以期為食管癌的靶向治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源及細(xì)胞來源

選擇2019年3月至2020年6月于保定市第一中心醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)切除治療的食管癌患者10例，留取新鮮的癌組織及對應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本。患者術(shù)前均未接受化療或放療，10例患者中，男6例，女4例；年齡42～70歲；腫瘤最大徑3～8 cm；高分化2例，中分化6例，低分化2例；TNM分期：Ⅰ期1例，Ⅱ期5例，Ⅲ期4例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移7例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移3例。本研究經(jīng)保定市第一中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)執(zhí)行(2018-B-566)，患者均知情同意。

人食管癌細(xì)胞KYSE30、EC9706和人正常食管上皮細(xì)胞(HEEC)均購自寧波明舟生物科技有限公司,批號分別為18210615、18251481、18053217。

1.2 主要試劑與儀器

CCK-8試劑盒(批號8127165)購自福州飛凈生物科技有限公司；RNA提取試劑盒(批號15181036)購自北京博邁斯科技發(fā)展有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號0621181809)購自美國GeneCopoeia公司；一抗ERK1/2、p-ERK1/2、p38MAPK、p-p38MAPK、細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclin D1和CDK2、凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、整合素β1、黏著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)、整合素連接激酶(integrin-linked kinase，ILK)均購自Abcam公司,批號分別為1513812、0627143、0825641、1315703、2164215、5108514、1003052、02190418、1652025、0583521；Q1600型qRT-PCR儀購自廈門和譜儀器有限公司；SpectraMax i3x酶標(biāo)儀購自美谷分子儀器(上海)有限公司。

1.3 組織處理、細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理

各新鮮食管癌組織及癌旁組織標(biāo)本，剪取1 g置于-80 ℃冰箱保存，以備檢測LIMD2 mRNA及ERK1/2、p-ERK1/2、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表達(dá)，剩余組織置于4%多聚甲醛中固定24 h，隨后進(jìn)行石蠟包埋、切片，以備免疫熒光染色檢測LIMD2蛋白表達(dá)水平。

取人食管癌細(xì)胞(KYSE30、EC9706)和人正常食管上皮細(xì)胞(HEEC)常規(guī)復(fù)蘇，隨后用DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清及100 U/mL青霉素—鏈霉素)在恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)及傳代，待細(xì)胞達(dá)到90%融合度時(shí)收集，采用qRT-PCR及免疫熒光染色檢測各細(xì)胞中LIMD2 mRNA及蛋白表達(dá)，選擇LIMD2 mRNA及蛋白表達(dá)最高的EC9706細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

取EC9706細(xì)胞，按照1×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，并設(shè)置為：對照組、Si-LIMD2組、Si-NC組、PD98059組、ISO組、Si-LIMD2+ISO組，每組6個(gè)復(fù)孔。對照組常規(guī)培養(yǎng)；Si-LIMD2組及Si-NC組分別轉(zhuǎn)染含LIMD2干擾序列的腺病毒載體及不含LIMD2干擾序列的空腺病毒載體；PD98059組及ISO組參照文獻(xiàn)[10-11]分別在培養(yǎng)基中加入終濃度為50 μmol/L的ERK/MAPK通路阻斷劑(PD98059)及20 μmol/L的ERK/MAPK通路激活劑鹽酸異丙腎上腺素(isoproterenol hydrochloride，ISO)；Si-LIMD2+ISO組在Si-LIMD2組基礎(chǔ)上加入ISO溶液(20 μmol/L)進(jìn)行培養(yǎng)。各組培養(yǎng)24 h后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 qRT-PCR法檢測細(xì)胞及組織LIMD2 mRNA表達(dá)

取1.3項(xiàng)下于-80 ℃保存的癌組織及癌旁組織，4 ℃解凍，冰上勻漿分離，隨后用RNA提取試劑盒提取總RNA。取1.3項(xiàng)下的KYSE30細(xì)胞、EC9706細(xì)胞、HEEC細(xì)胞及各組EC9706細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，用RNA提取試劑盒分別提取總RNA。將提取的總RNA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以cDNA為模板，按照qRT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行PCR反應(yīng)(反應(yīng)體系：上下游引物各0.5 μL，2×SYBR mix 10 μL，10×cDNA模板1 μL，滅菌雙蒸水8 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性14 min、94 ℃變性33 s、67 ℃退火57 s，55個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸17 min)，以GAPDH為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法計(jì)算LIMD2 mRNA表達(dá)水平。各引物序列由大連寶生物公司合成，見表1。

表1 引物序列表

1.5 免疫熒光染色檢測細(xì)胞LIMD2蛋白表達(dá)

取1.3項(xiàng)下KYSE30細(xì)胞、EC9706細(xì)胞、HEEC細(xì)胞及各組EC9706細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞爬片，將爬片經(jīng)4%多聚甲醛固定，曲拉通透化、封閉，而后加入一抗(LIMD2，1∶200)4 ℃孵育過夜，避光加入熒光二抗(異硫氰酸熒光素，1∶200)，DAPI染核、甘油封片后于熒光顯微鏡下觀察拍照，用Image Pro Plus 5.0分析圖像，測定陽性表達(dá)的平均光密度值。

1.6 Western blot法檢測相關(guān)蛋白表達(dá)

取1.3項(xiàng)下-80 ℃保存的癌組織及癌旁組織，4 ℃解凍，冰上勻漿分離，用蛋白提取試劑盒提取總蛋白，并用BCA法檢測蛋白濃度。取1.3項(xiàng)下KYSE30細(xì)胞、EC9706細(xì)胞、HEEC細(xì)胞及各組EC9706細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，用蛋白提取試劑盒提取總蛋白，并用BCA法檢測蛋白濃度。各取25 μg蛋白樣品行電泳(濃縮膠80 V，分離膠120 V)及轉(zhuǎn)膜反應(yīng)200 mA，加入一抗(ERK1/2、p-ERK1/2、p38MAPK、p-p38MAPK、cyclin D1、CDK2、caspase-3、整合素β1、FAK、ILK抗體，1∶2 000；內(nèi)參抗體β-actin，1∶2 000)，4 ℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶二抗(1∶3 000)，室溫下孵育2 h。ECL顯影曝光后用化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)拍照并分析灰度值，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。其中癌組織及癌旁組織只檢測ERK/MAPK通路蛋白表達(dá)。

1.7 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活性

取1.3項(xiàng)下培養(yǎng)24 h后的各組EC9706細(xì)胞，加入10 μL CCK-8溶液繼續(xù)培養(yǎng)2 h，隨后用比色法在450 nm波長下檢測各組細(xì)胞OD值，以細(xì)胞培養(yǎng)液OD值為空白OD值，根據(jù)公式細(xì)胞生存率(%)=[(試驗(yàn)組OD值-空白OD值)/(對照組OD值-空白OD值)]×100%計(jì)算細(xì)胞生存率，以細(xì)胞生存率高低代表細(xì)胞增殖活性。

1.8 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期及凋亡率

收集1.3項(xiàng)下培養(yǎng)24 h后的各組EC9706細(xì)胞，加入100 μL結(jié)合緩沖液、10 μL FITC標(biāo)記的Annexin-V溶液，室溫避光孵育30 min，再加入5 μL碘化丙啶避光孵育5 min，隨后加入400 μL結(jié)合緩沖液，在流式細(xì)胞儀下檢測細(xì)胞周期和凋亡情況。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 食管癌組織中LIMD2 mRNA、蛋白及ERK/MAPK通路蛋白表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果顯示，癌組織中LIMD2 mRNA表達(dá)高于癌旁組織(P<0.05)，見表2。免疫熒光染色顯示，癌組織中LIMD2蛋白表達(dá)高于癌旁組織(P<0.05)，見圖1。Western blot結(jié)果顯示，癌組織中p-ERK1/2、p-p38MAPK蛋白表達(dá)高于癌旁組織(P<0.05)，見圖2、表2。

a：癌旁組織；b:癌組織圖1 食管癌組織中LIMD2免疫熒光圖片(×400)

表2 食管癌組織中LIMD2 mRNA、蛋白及ERK/MAPK通路蛋白表達(dá)比較

圖2 食管癌組織中ERK/MAPK通路蛋白表達(dá)免疫印跡圖

2.2 細(xì)胞中LIMD2表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果顯示，KYSE30、EC9706細(xì)胞中LIMD2 mRNA表達(dá)高于HEEC細(xì)胞(P<0.05)。免疫熒光染色顯示，KYSE30、EC9706細(xì)胞中LIMD2 蛋白表達(dá)高于HEEC細(xì)胞(P<0.05)，且EC9706細(xì)胞中LIMD2 mRNA、LIMD2蛋白表達(dá)高于KYSE30細(xì)胞，見表3、圖3。

表3 細(xì)胞中LIMD2 mRNA、LIMD2蛋白表達(dá)比較

a:HEEC細(xì)胞；b:KYSE30細(xì)胞；c：EC9706細(xì)胞圖3 細(xì)胞中LIMD2免疫熒光圖片(×400)

2.3 各組EC9706細(xì)胞LIMD2 mRNA、蛋白及ERK/MAPK通路蛋白表達(dá)

qRT-PCR及免疫熒光染色結(jié)果顯示，與對照組相比，Si-LIMD2組LIMD2 mRNA、LIMD2蛋白表達(dá)較低(P<0.05)，見圖4、表4。Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，Si-LIMD2組和PD98059組p-ERK1/2、p-p38MAPK蛋白表達(dá)較低(P<0.05)，ISO組p-ERK1/2、p-p38MAPK蛋白表達(dá)較高(P<0.05)；與Si-LIMD2組相比，Si-LIMD2+ISO組p-ERK1/2、p-p38MAPK蛋白表達(dá)較高(P<0.05)，見表4、圖5。

a：對照組；b：Si-LIMD2組；c：PD98059組；d：ISO組；e：Si-LIMD2+ISO組；f：Si-NC組圖4 各組EC9706細(xì)胞LIMD2免疫熒光圖片(×400)

圖5 各組EC9706細(xì)胞ERK/MAPK通路蛋白表達(dá)免疫印跡圖

表4 各組EC9706細(xì)胞LIMD2 mRNA、蛋白及ERK/MAPK通路蛋白表達(dá)比較

2.4 各組EC9706細(xì)胞增殖活性

與對照組相比，Si-LIMD2組和PD98059組細(xì)胞增殖活性較低(P<0.05)，ISO組細(xì)胞增殖活性較高(P<0.05)。與Si-LIMD2組比較，Si-LIMD2+ISO組細(xì)胞增殖活性較高(P<0.05)，見表5。

表5 各組EC9706細(xì)胞增殖活性比較

2.5 各組EC9706細(xì)胞周期及凋亡率

與對照組相比，Si-LIMD2組和PD98059組細(xì)胞G0/G1期比例較高，S期及G2/M期比例較低，凋亡率較高(P<0.05)；ISO組細(xì)胞G0/G1期比例較低，S期及G2/M期比例較高，凋亡率較低(P<0.05)；與Si-LIMD2組相比，Si-LIMD2+ISO組細(xì)胞G0/G1期比例較低，S期及G2/M期比例較高，凋亡率較低(P<0.05)，見表6、圖6。

表6 各組EC9706細(xì)胞周期及凋亡率比較

a：對照組；b：Si-LIMD2組；c：PD98059組；d：ISO組；e：Si-LIMD2+ISO組；f：Si-NC組圖6 各組EC9706細(xì)胞流式周期圖

2.6 各組EC9706細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

與對照組相比，Si-LIMD2組和PD98059組cyclin D1、CDK2蛋白表達(dá)較低，caspase-3蛋白表達(dá)較高(P<0.05)，ISO組cyclin D1、CDK2蛋白表達(dá)較高，caspase-3蛋白表達(dá)較低(P<0.05)；與Si-LIMD2組相比，Si-LIMD2+ISO組cyclin D1、CDK2蛋白表達(dá)較高，caspase-3蛋白表達(dá)較低(P<0.05)，見表7、圖7。

圖7 各組EC9706細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)免疫印跡圖

表7 各組EC9706細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較

2.7 各組EC9706細(xì)胞FAK、ILK、整合素β1蛋白表達(dá)

與對照組相比，Si-LIMD2組和PD98059組FAK、ILK、整合素β1蛋白表達(dá)較低(P<0.05)，ISO組FAK、ILK、整合素β1蛋白表達(dá)較高(P<0.05)；與Si-LIMD2組相比，Si-LIMD2+ISO組FAK、ILK、整合素β1蛋白表達(dá)較高(P<0.05)，見圖8、表8。

圖8 各組EC9706細(xì)胞FAK、ILK、整合素β1蛋白表達(dá)免疫印跡圖

表8 各組EC9706細(xì)胞FAK、ILK、整合素β1蛋白表達(dá)比較

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)，含LIMD的蛋白與人類多種腫瘤的生長及增殖密切相關(guān)，并逐漸受到腫瘤研究者的重視。Wang等[12]研究發(fā)現(xiàn)，LIMD家族的LIMD2可促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖及侵襲進(jìn)程。夏朝暉等[13]發(fā)現(xiàn)，LIMD2高表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移浸潤有關(guān)。LIMD2已在乳腺癌、膀胱癌、甲狀腺癌、黑色素瘤等人類癌癥中有較多研究，但LIMD2在食管癌中的作用尚未明確。本研究發(fā)現(xiàn)，LIMD2在食管癌組織及KYSE30、EC9706細(xì)胞中表達(dá)均較高，且在食管癌細(xì)胞中以EC9706細(xì)胞表達(dá)較高，提示LIMD2參與了食管癌的發(fā)生發(fā)展過程。本研究進(jìn)一步沉默EC9706細(xì)胞中LIMD2表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖活性降低，細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，細(xì)胞凋亡率增加，表明沉默LIMD2表達(dá)可顯著抑制EC9706細(xì)胞增殖，并促進(jìn)其凋亡，預(yù)示LIMD2可能成為治療食管癌的潛在靶分子，但其具體調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步探究。

據(jù)文獻(xiàn)資料研究顯示，LIMD2可在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核之間穿梭，并組裝蛋白，使原本無相互作用的蛋白產(chǎn)生級聯(lián)作用，進(jìn)而調(diào)控信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[14]。Pinheiro等[6]及Peng等[15]發(fā)現(xiàn)，LIMD2可直接與ILK結(jié)構(gòu)域結(jié)合，促進(jìn)ILK活化，引起細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和侵襲性相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活，參與癌細(xì)胞擴(kuò)散過程。另外，ILK與整合素β1結(jié)合活化后，可促進(jìn)整合素β1下游FAK/MAPK通路活化，從而調(diào)控細(xì)胞增殖、分化過程[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，沉默EC9706細(xì)胞中LIMD2表達(dá)后，ILK、整合素β1、FAK蛋白及ERK/MAPK通路p-ERK1/2、p-p38MAPK蛋白表達(dá)亦減少，提示沉默LIMD2表達(dá)抑制EC9706細(xì)胞增殖，并促進(jìn)其凋亡的作用可能與抑制ERK/MAPK通路有關(guān)。

MAPK與其通路中的重要分子ERK作用，將細(xì)胞外信號傳遞至細(xì)胞內(nèi)，并調(diào)控細(xì)胞周期，將增殖信號傳至細(xì)胞內(nèi)，促進(jìn)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclin D1及CDK2表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)癌細(xì)胞惡性增殖能力[18]。且ERK/MAPK通路已被證實(shí)是參與腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展的重要通路[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，ERK/MAPK通路p-ERK1/2、p-p38MAPK蛋白在食管癌組織中表達(dá)較高，用ISO激活EC9706細(xì)胞ERK/MAPK通路后，細(xì)胞增殖活性升高，G0/G1期比例較低，S期及G2/GM期比例較高，凋亡率較低，同時(shí)細(xì)胞周期蛋白cyclin D1及CDK2表達(dá)較高，凋亡相關(guān)蛋白caspase-3表達(dá)較低，反之用PD98059抑制EC9706細(xì)胞ERK/MAPK通路后，癌細(xì)胞顯示出較低的增殖活性，且凋亡率升高，提示ERK/MAPK通路激活可能是促進(jìn)食管癌惡性發(fā)展的誘因，這與以往文獻(xiàn)研究結(jié)果一致[9-10]。本研究在沉默LIMD2表達(dá)的基礎(chǔ)上用ISO激活ERK/MAPK通路，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沉默LIMD2表達(dá)抑制EC9706細(xì)胞增殖，并促進(jìn)其凋亡的作用被逆轉(zhuǎn)，證實(shí)LIMD2是通過調(diào)控ERK/MAPK通路參與食管癌的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，沉默LIMD2表達(dá)可能通過抑制ERK/MAPK通路而抑制食管癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡，這為闡明LIMD2參與食管癌發(fā)生發(fā)展的可能機(jī)制提供了一定理論依據(jù)。