微生物產(chǎn)氣性能影響因素試驗研究

鄧溫妮 吳智威

(東南大學土木工程學院， 南京 211189)

地震災(zāi)害通常會引發(fā)一系列液化震害，不僅使地基失穩(wěn)、建筑物破壞，還會對災(zāi)后救援造成嚴重影響[1].我國地處環(huán)太平洋地震帶和歐亞地震帶之間，是一個地震多發(fā)國家.目前，我國處理可液化地基的方法主要有擠密砂樁法、碎石樁法、強夯法、注漿法、深層攪拌法、旋噴法等[2].但這些傳統(tǒng)方法往往成本較高且只能用在新建項目地基中，既有建筑地基的抗液化處理仍是一項重大難題.

近年來，國內(nèi)外學者嘗試將微生物技術(shù)用于處理可液化地基，該技術(shù)可利用微生物礦化作用誘導(dǎo)生成碳酸鈣等沉積膠結(jié)土體材料，從而提高土體強度和抗液化能力[3]；或利用微生物產(chǎn)氣降低土體飽和度，進而提高土體抗液化強度[4].目前已有不少研究人員對土體降飽和后的抗液化能力進行研究.Chaney[5]研究表明，當飽和度下降到90%時，土體抗液化強度可達飽和試樣的2倍.Yoshimi等[6]通過扭剪試驗測定不同飽和度下試樣的抗液化強度，結(jié)果表明當飽和度降低到70%時，其抗液化強度為飽和土樣的3倍.Xia等[7]和Okamura等[8]對完全飽和砂土進行液化分析試驗，發(fā)現(xiàn)在飽和砂土中僅引入少量氣體可以顯著提高抗液化強度.

Rebata-Landa等[12]開展不同土壤類型條件脫氮副球菌的產(chǎn)氣能力試驗，并研究了氮氣氣泡對土體力學特性的影響，研究指出土體中細粒含量越高，氮氣產(chǎn)生越早，能更好地保留在土體孔隙中，且提高了砂土在循環(huán)荷載下的抗液化能力.Wang等[13-14]研究微生物氣泡對級配不良砂土的力學性能影響，三軸試驗結(jié)果表明微生物氣泡能有效減少孔隙壓力積累.He[15]對脫氮假單胞菌開展脫氮能力和產(chǎn)氣效能的研究，并通過三軸試驗表明，隨著飽和度降低，砂土試樣剪切強度提高.He等[16]開展三軸試驗和振動臺試驗，證明反硝化微生物產(chǎn)氮氣泡降低砂土飽和度，可有效提高土體抗液化能力，當砂土的飽和度降低到95%以下時，砂土發(fā)生液化的可能性大大降低.Peng等[17]通過調(diào)整氮源濃度控制施氏假單胞菌反硝化反應(yīng)的產(chǎn)氣量，結(jié)果表明土體飽和度和硝酸根濃度成良好冪函數(shù)關(guān)系，并通過振動臺試驗研究和驗證了微生物氣泡處理可液化砂土模型地基的效果.彭爾興等[18]對施氏假單胞菌反硝化反應(yīng)影響因素和產(chǎn)氣效能開展了初步研究.但Li[19]研究指出，在滲流條件下，微生物反硝化反應(yīng)產(chǎn)生的氣泡并不穩(wěn)定，土體飽和度隨著滲流作用逐漸升高，降飽和效果較差.

因此，為了使得微生物氣泡法降飽和度方法能夠得到更好的應(yīng)用，亟需尋找提高微生物氣泡在土體中穩(wěn)定性的方法.表面活性劑能有效降低氣泡表面張力，起到穩(wěn)定氣泡作用[20]，但表面活性劑對微生物反硝化反應(yīng)有何影響尚不明確.本文選用對產(chǎn)氣性能無不良影響的表面活性劑，開展在溫度、反應(yīng)液pH值、微生物菌種濃度、氮源濃度、表面活性劑種類和摻量等因素下施氏假單胞菌產(chǎn)氣性能試驗研究，明確施氏假單胞菌產(chǎn)氣降低土體飽和度的效果和適用條件，并給出控制飽和度的方法.

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

施氏假單胞菌采購于德國微生物菌種保藏中心(DSMZ, 編號5190).菌種增殖培養(yǎng)基為Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基，組分為酵母提取物5 g、胰蛋白胨10 g、NaCl 10 g，混合加入去離子水定容至1 L，攪拌均勻后呈透明淡黃色.反硝化培養(yǎng)基組分MgSO4·7H2O為0.2 g、K2HPO4為1 g、Na3C6H5O7為5 g(碳源)、KNO3分別為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g(氮源)，混合加入去離子水定容至1 L，攪拌均勻后呈無色透明.

試驗用砂來自江蘇南京某沙場，對其進行顆粒分析和比重試驗，該砂土的相對密度為2.65，曲線見圖1，砂土有效粒徑d10、中值粒徑d30、限制粒徑d60分別為0.23、0.36、0.61 mm，不均勻系數(shù)Cu為2.65，曲率系數(shù)Cc為0.92.根據(jù)《土的工程分類標準》(GB/T 50145—2007)[21]，該砂粒為級配不良砂.

圖1 粒徑分布曲線

選用4種具有代表性的表面活性劑：松香酸鈉、三萜皂苷、十二烷基苯磺酸鈉、脂肪醇聚氧乙烯醚，其優(yōu)缺點見表1.

表1 表面活性劑優(yōu)缺點

1.2 試驗方法與內(nèi)容

使用LB培養(yǎng)基對施氏假單胞菌進行培育繁殖，對菌種進行平板劃線提純，并測定其生長曲線，得出其生長對數(shù)期時間，為后續(xù)試驗提供優(yōu)質(zhì)菌種.試驗過程如下：① 取適量對數(shù)期的菌液置于離心管中，使用離心機以5 000 r/min的速度離心5 min；② 離心結(jié)束后，去除上清液得到菌泥，將其與適量的反硝化培養(yǎng)基混合，調(diào)整菌液至所需光密度OD600；③ 以試樣體積為10 mL、孔隙比為0.5配置所需砂量，裝入20 mL的注射器中，并加入適量已配置完成的菌液，推動注射器活塞至10 mL處；④ 注射器活塞段使用502膠水密封并固定，注射器口端連接醫(yī)用PVC軟管，PVC軟管另一頭接在2 mL玻璃移液管口，各連接處用502膠水粘接并使用止水帶纏繞以保證其密閉性，PVC軟管及玻璃移液管細口端部均由液化石蠟填充(見圖2)；⑤ 將試樣放置在恒溫培養(yǎng)箱中，記錄液化石蠟端部在玻璃移液管上對應(yīng)的刻度.待微生物產(chǎn)氣后，每2 h記錄一次液化石蠟端部對應(yīng)的刻度，待石蠟液面停止變化，結(jié)束試驗，記錄最終刻度.

圖2 試驗裝置示意圖

本試驗探究施氏假單胞菌在6個因素影響下的產(chǎn)氣性能，每個因素5個水平，若進行全面試驗需要56=15 625組，為減少試驗規(guī)模，設(shè)計了正交試驗方案(見表2).其中，反硝化培養(yǎng)基初始pH值為7.6左右，通過滴入鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)至各組別所需pH值，由pH測量計測定；菌液光密度OD600通過分光光度計測定.每組試樣進行3個重復(fù)組以保證結(jié)果準確.分析試驗結(jié)果得出影響施氏假單胞菌產(chǎn)氣性能的主要因素，確定各影響因素的最優(yōu)水平，再單獨考慮各因素進行試驗，得出各因素產(chǎn)氣曲線，分析各因素對產(chǎn)氣性能的影響原因.

表2 正交試驗方案

2 試驗結(jié)果與分析

2.1 施氏假單胞菌培育

施氏假單胞菌多次平板劃線分離純化，微生物隨著多次劃線逐漸減少分散，在固體培養(yǎng)基上形成單一菌落形態(tài)，取出施氏假單胞菌菌落進行繁殖，并測定其生長曲線，見圖3.施氏假單胞菌的生長對數(shù)期約在1～8 h，培育8 h后進入生長平臺期，后續(xù)試驗使用對數(shù)生長期內(nèi)的菌種.

圖3 施氏假單胞菌生長曲線

2.2 正交試驗結(jié)果

采用表2試驗方案進行試驗，測得各組別施氏假單胞菌產(chǎn)氣的停滯時間(試樣放入培養(yǎng)箱至玻璃移液管刻度開始變化所需時間)、產(chǎn)氣時間(玻璃移液管刻度開始變化到停止變化所用時間)、產(chǎn)氣量，結(jié)果見表3.計算各因素對產(chǎn)氣性能的綜合平均值和極差，判斷影響施氏假單胞菌產(chǎn)氣性能的主要影響因素，具體計算方法如下：

(1)

(2)

表3 正交試驗結(jié)果

表4 各因素關(guān)于停滯時間的綜合平均值和極差

表5 各因素關(guān)于產(chǎn)氣時間的綜合平均值和極差

表6 各因素關(guān)于產(chǎn)氣量的綜合平均值和極差

表7 各因素關(guān)于產(chǎn)氣速率的綜合平均值和極差

2.3 溫度影響

本節(jié)除溫度為變量外，其他因素分別確定為：pH=8，OD600=0.10，氮源質(zhì)量濃度2.0 g/L，不添加表面活性劑.圖4(a)、(b)分別為不同溫度下產(chǎn)氣量和飽和度隨時間變化曲線圖，試樣飽和度Sr=(1-Vg/Vl)，Vg為產(chǎn)氣量、Vl為試樣中菌液體積.由圖可知，在4～30 ℃均能順利產(chǎn)氣，并且產(chǎn)氣量隨溫度升高而增加，產(chǎn)氣時間隨溫度升高而減少.

(a) 產(chǎn)氣曲線

由圖4(c)可知，每組試樣均存在停滯時間，溫度越低停滯時間越長，在4 ℃時停滯時間達148 h，而在30 ℃時停滯時間僅有62 h，但當溫度達到20 ℃后，溫度增長對停滯時間影響并不明顯.其原因有2點：① 由于施氏假單胞菌屬于兼性厭氧細菌，在試驗初期，砂土中反應(yīng)液存在少量溶解氧，該菌會先進行有氧呼吸作用，再開始反硝化反應(yīng)；② 過低的溫度會抑制微生物生長代謝活動，降低反硝化反應(yīng)所需酶類活性.

該菌的平均反硝化反應(yīng)速率為總產(chǎn)氣量與總產(chǎn)氣時間之比，結(jié)果如圖4(d)所示.溫度對產(chǎn)氣速率影響十分明顯，溫度為30 ℃時，產(chǎn)氣速率達到0.035 mL/h；而溫度為4 ℃時，產(chǎn)氣速率僅為0.007 mL/h，二者相差達到5倍.

2.4 pH影響

(a) 產(chǎn)氣曲線

2.5 微生物濃度影響

本節(jié)除微生物濃度為變量外，其他因素分別確定為：溫度20 ℃，pH=8，氮源質(zhì)量濃度2.0 g/L，不添加表面活性劑.圖6(a)為施氏假單胞菌在不同初始濃度下產(chǎn)氣量隨時間變化曲線.初始菌液光密度OD600在0.01～0.20內(nèi)均能產(chǎn)氣，當菌液濃度過低或過高時，最終產(chǎn)氣量略低.OD600=0.10時，產(chǎn)氣量達到最高.由圖6(b)可知，試樣飽和度最終降低至80%～85%之間，菌液濃度對降飽和度效果影響不大，但對產(chǎn)氣時間有一定影響，在OD600=0.10時降飽和度完成時間最短，僅為35 h.

由圖6(c)、(d)可知，當微生物濃度逐漸升高時，停滯時間和產(chǎn)氣速率都呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢，在OD600=0.10時停滯時間達到最短，反應(yīng)速率達到最大.原因在于：在確定的反應(yīng)物內(nèi)，存在一個微生物量飽和值.當加入的微生物量遠低于該值，微生物整體活性相對較低，代謝反應(yīng)效率較差.

(a) 產(chǎn)氣曲線

當不斷增加微生物量，微生物活性及代謝效率不斷提高，但超過該飽和值后繼續(xù)添加，會導(dǎo)致反硝化過程所需組分不足，微生物之間產(chǎn)生競爭，進而使微生物代謝效率和活性下降.

2.6 氮源濃度影響

本節(jié)除氮源質(zhì)量濃度為變量外，其他因素分別確定為：溫度20 ℃，pH=8，OD600=0.10，不添加表面活性劑.圖7(a)、(b)分別為施氏假單胞菌在不同氮源濃度下產(chǎn)氣量和飽和度隨時間變化曲線，可見氮源質(zhì)量濃度直接影響降飽和度效果和最終產(chǎn)氣量，但對產(chǎn)氣時間影響較小，各試樣完成降飽和度的時間在50～62 h之間.硝酸鉀質(zhì)量濃度為1.0 g/L時，飽和度下降至95%，而當硝酸鉀質(zhì)量濃度增加到3.0 g/L時，飽和度下降至75%；硝酸鉀質(zhì)量濃度在1.5、2.0、2.5、3.0 g/L時，產(chǎn)氣量分別是硝酸鉀質(zhì)量濃度1.0 g/L時的3.3、4.0、4.3、5.3倍.雖然氮源質(zhì)量濃度與產(chǎn)氣量之間呈非線性關(guān)系，但對5組試樣的碳氮質(zhì)量比與產(chǎn)氣量進行擬合分析，發(fā)現(xiàn)兩者成線性關(guān)系(見圖8)，文獻[25]也證實這一關(guān)系.因此在固定碳源情況下，可通過控制氮源濃度調(diào)節(jié)碳氮質(zhì)量比，進而控制最終產(chǎn)氣量，達到所需飽和度.

(a) 產(chǎn)氣曲線

圖8 碳氮質(zhì)量比與產(chǎn)氣量擬合線

從圖7(c)可知，氮源濃度對停滯時間沒有明顯影響，這表明在其他因素一致的情況下，菌液在開始反硝化反應(yīng)前的生長代謝活動消耗時間基本一致.由圖7(d)知，當硝酸鉀質(zhì)量濃度為1.0 g/L時，反應(yīng)速率遠低于其他幾組試樣.因為反硝化微生物還原硝酸根的過程受碳氮質(zhì)量比的影響[26]，本文中碳源濃度是固定的，硝酸鉀濃度過低，導(dǎo)致碳氮質(zhì)量比過大，抑制反硝化過程各種還原酶產(chǎn)生，使得反硝化過程不能順利進行.

2.7 表面活性劑種類影響

本節(jié)除表面活性劑種類為變量外，其他因素分別確定為：溫度20 ℃，pH=8，OD600=0.10，氮源質(zhì)量濃度2.0 g/L，表面活性劑質(zhì)量分數(shù)0.3%.圖9(a)、(b)分別為不同表面活性劑下產(chǎn)氣量和飽和度隨時間變化曲線.通過與無添加對照組對比可知，松香酸鈉對最終產(chǎn)氣量不會產(chǎn)生負面影響，但其他幾類表面活性劑對最終產(chǎn)氣量存在一定抑制作用，進而影響降飽和度效果.這可能是由于這幾類表面活性劑中的有機物能成為反硝化微生物的電子供體(碳源)，從而改變了碳氮質(zhì)量比.由2.6節(jié)可知，碳氮質(zhì)量比影響最終產(chǎn)氣量.摻入表面活性劑相當于增加碳源，使碳氮質(zhì)量比變大，導(dǎo)致產(chǎn)氣量下降.試樣完成降飽和度時間基本一致，幾乎不受表面活性劑影響.

圖9(c)、(d)表明各類表面活性劑對停滯時間影響較小.松香酸鈉對產(chǎn)氣速率有一定提高，而其他幾種表面活性劑則會限制產(chǎn)氣速率.綜上所述，可以選用松香酸鈉作為提高氣泡穩(wěn)定性的表面活性劑.

(a) 產(chǎn)氣曲線

(d) 平均產(chǎn)氣速率

2.8 表面活性劑摻量影響

本節(jié)除表面活性劑摻量為變量外，其他因素分別確定為：溫度20 ℃，pH=8，OD600=0.10，氮源硝酸鉀質(zhì)量濃度2.0 g/L，表面活性劑選用松香酸鈉.圖10(a)、(b)分別為施氏假單胞菌在不同表面活性劑摻量下產(chǎn)氣量和飽和度隨時間變化曲線.由圖可知，表面活性劑的摻量對最終產(chǎn)氣量、降低飽和度和產(chǎn)氣時間影響較小.

(a) 產(chǎn)氣曲線

圖10(c)、(d)表明表面活性劑摻量對停滯時間影響較小，最大差值僅為6 h.平均產(chǎn)氣速率隨表面活性劑摻量先增大后減小，當表面活性劑質(zhì)量分數(shù)為0.3%時，平均產(chǎn)氣速率最大.綜上所述，表面活性劑摻量對施氏假單胞菌產(chǎn)氣性能整體影響不大，但表面活性劑質(zhì)量分數(shù)為0.3%時平均產(chǎn)氣速率最優(yōu)，停滯時間與其他組別基本一致，故最優(yōu)表面活性劑質(zhì)量分數(shù)可選為0.3%.

3 結(jié)論

1) 施氏假單胞菌的產(chǎn)氣速率和停滯時間主要受溫度、pH值和微生物濃度影響.溫度環(huán)境處于4～30 ℃內(nèi)，產(chǎn)氣性能隨溫度升高而提高，30 ℃時產(chǎn)氣速率是4 ℃時的5倍；pH值在7～9時停滯時間明顯少于酸性環(huán)境，pH=9時停滯時間較pH=5時減少53 h；產(chǎn)氣性能隨微生物濃度升高先增大后減小，微生物光密度OD600最優(yōu)值為0.10，產(chǎn)氣時間僅為35 h.

2) 氮源濃度是影響施氏假單胞菌總產(chǎn)氣量和降飽和度效果的最主要因素.氮源質(zhì)量濃度在3.0 g/L時產(chǎn)氣量是氮源質(zhì)量濃度1.0 g/L時的5.3倍，產(chǎn)氣量與氮源濃度成非線性關(guān)系，但與碳氮質(zhì)量比成線性關(guān)系.

3) 4種表面活性劑中，三萜皂苷、十二烷基苯磺酸鈉和脂肪醇聚氧乙烯醚均對產(chǎn)氣速率有一定抑制，而松香酸鈉對產(chǎn)氣性能有一定提高.為提高氣泡穩(wěn)定且不影響施氏假單胞菌產(chǎn)氣過程，選用松香酸鈉作為表面活性劑，且質(zhì)量分數(shù)為0.3%為宜.