瑞舒伐他汀對內(nèi)皮素1誘發(fā)肥大心肌細(xì)胞中[14C]苯丙氨酸結(jié)合的影響研究

王 新，錦見俊雄

他汀類藥物是限制膽固醇生物合成的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A，HMG-CoA)還原酶的特殊抑制劑。大量臨床干預(yù)試驗(yàn)表明將他汀類藥物作為一級和二級預(yù)防治療后，可以極大地改善冠心病的治療效果[1]。此外，研究還表明他汀類藥物可以降低心力衰竭的發(fā)病率[2]。盡管他汀類藥物對誘發(fā)的動脈粥樣硬化的改善與降低血清中膽固醇水平有關(guān)，最近的研究表明其對血管壁有直接影響——抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖并改變體外血管內(nèi)皮細(xì)胞的動脈粥樣化形成有關(guān)的基因表達(dá)[3]。但是，他汀類藥物對肥大心肌細(xì)胞直接作用的機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)的目的是確定瑞舒伐他汀[4]是否對體外內(nèi)皮素1誘發(fā)的肥大心肌細(xì)胞有直接抑制作用，并研究瑞舒伐他汀影響肥大心肌細(xì)胞的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與材料 新生Wistar大鼠(1～2 d)從SLC(日本靜岡縣)采購。瑞舒伐他汀和普伐他汀分別由魯南制藥集團(tuán)股份有限公司與三共理化學(xué)株式會社無償提供。甲羥戊酸、角鯊烯、法尼基-焦磷酸(FPP)及牛兒-焦磷酸(GGPP)從美國Sigma公司采購。肉毒桿菌C3胞外酶和Y27632 〔(R)-(+)-反式-氮-(4-吡啶基)-4-(1-氨乙基)-環(huán)己甲酰胺·2鹽酸〕從Calbiochem公司采購，[14C]苯丙氨酸(phenylalanine, Phe)從Amersham生命科學(xué)公司采購。內(nèi)皮素1從肽研究所(日本大阪)采購。甲羥戊酸、角鯊烯、FPP、GGPP、C3胞外酶、Y27632及內(nèi)皮素1溶解在杜氏培養(yǎng)基(DMEM)中。

1.2 心肌細(xì)胞培養(yǎng) 新生大鼠心肌細(xì)胞在之前報(bào)道方法[5]的基礎(chǔ)上加以改動[6]富集培養(yǎng)。分離心房、心室，將心室肌細(xì)胞分散在含有0.06%膠原酶Ⅱ(Worthington生物化學(xué)公司，紐約弗利霍德)的平衡鹽溶液中，37 ℃下攪拌6 min，然后用移液管轉(zhuǎn)移約20次。使用斷續(xù)Percoll梯度法進(jìn)行心肌細(xì)胞分化。使用純化的心肌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，心肌細(xì)胞加入內(nèi)皮素1(0、10-7mol/L)分別制備正常心肌細(xì)胞和肥大心肌細(xì)胞，培養(yǎng)24 h，取心肌細(xì)胞加入瑞舒伐他汀〔0(對照組)、10-9、10-8、10-7、10-6mol/L〕和普伐他汀〔0(對照組)、10-9、10-8、10-7、10-6mol/L〕培養(yǎng)24 h。

1.3 [14C]Phe結(jié)合率檢測 不同濃度藥物處理心肌細(xì)胞24 h后，向培養(yǎng)基中送氣，并在-80 ℃下貯存。培養(yǎng)基(0.5 μl)使用醋酸酸化，并煮沸使內(nèi)在蛋白酶失活并凍干。依照之前報(bào)道的方式[7]進(jìn)行[14C]Phe結(jié)合率檢測。

1.4 甲羥戊酸、角鯊烯、FPP、GGPP對心肌細(xì)胞[14C]Phe結(jié)合率的影響 心肌細(xì)胞接種在24孔板上，密度為6×104個(gè)/cm2。甲羥戊酸(10-6～10-4mol/L)、角鯊烯(10-6～10-4mol/L)、FPP(10-7～10-5mol/L)、GGPP(10-7～10-5mol/L)預(yù)培養(yǎng)6～12 h，再添加內(nèi)皮素1(0、10-7mol/L)和瑞舒伐他汀(10-6mol/L)。然再添加0.2 μCi的[14C]Phe。培養(yǎng)細(xì)胞24 h后，檢測[14C]Phe結(jié)合率。每種藥物設(shè)6組，甲羥戊酸設(shè)對照組、空瑞舒伐他汀組、空甲羥戊酸組、10-6mol/L組、10-5mol/L組、10-4mol/L組(見表1)，角鯊烯設(shè)對照組、空瑞舒伐他汀組、空角鯊烯組、10-6mol/L組、10-5mol/L組、10-4mol/L組(見表2)，F(xiàn)PP設(shè)對照組、空瑞舒伐他汀組、空FPP組、10-7mol/L組、10-6mol/L組、10-5mol/L組(見表3)，GGPP設(shè)對照組、空瑞舒伐他汀組、空GGPP組、10-7mol/L組、10-6mol/L組、10-5mol/L組(見表4)。

1.5 C3胞外酶和Y27632對心肌細(xì)胞[14C]Phe結(jié)合率的影響 心肌細(xì)胞接種在24孔板上，密度為6×104個(gè)/cm2。C3胞外酶(0、2.5、12.5、25.0 μg/ml)和Y27632(0、10-7、10-6、10-5mol/L)預(yù)培養(yǎng)6～12 h，再添加內(nèi)皮素1(10-7mol/L)。然后添加0.2 μCi的[14C]Phe。培養(yǎng)細(xì)胞24 h后，檢測[14C]Phe結(jié)合率。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料多組比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 甲羥戊酸各組藥物濃度(mol/L)Table 1 Drug concentration in mevalonate groups

表2 角鯊烯各組藥物濃度(mol/L)Table 2 Drug concentration in squalene groups

表3 FPP各組藥物濃度(mol/L)Table 3 Drug concentration in FPP groups

注：FPP=法尼基-焦磷酸

表4 GGPP各組藥物濃度(mol/L)Table 4 Drug concentration in GGPP groups

注：GGPP=牛兒-焦磷酸

2 結(jié)果

2.1 不同濃度瑞舒伐他汀組正常心肌細(xì)胞和肥大心肌細(xì)胞[14C]Phe結(jié)合率比較 對照組與不同濃度瑞舒伐他汀組正常心肌細(xì)胞[14C]Phe結(jié)合率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=21.58，P<0.05)；其中10-6mol/L組正常心肌細(xì)胞 [14C]Phe結(jié)合率較其他4組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖1)。對照組與不同濃度瑞舒伐他汀組肥大心肌細(xì)胞[14C]Phe結(jié)合率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=21.12，P<0.05)；其中10-6mol/L組肥大心肌細(xì)胞[14C]Phe結(jié)合率較其他4組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖2)。

2.2 不同濃度普伐他汀組正常心肌細(xì)胞和肥大心肌細(xì)胞[14C]Phe結(jié)合率比較 對照組與不同濃度普伐他汀組正常心肌細(xì)胞[14C]Phe結(jié)合率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=19.24，P>0.05，見圖3)。對照組與不同濃度普伐他汀組肥大心肌細(xì)胞[14C]Phe結(jié)合率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=18.65，P>0.05，見圖4)。

2.3 不同濃度甲羥戊酸、角鯊烯、FPP、GGPP預(yù)處理后瑞舒伐他汀對心肌細(xì)胞[14C]Phe結(jié)合率的影響 對照組、空瑞舒伐他汀組、空甲羥戊酸組、10-6mol/L組、10-5mol/L組、10-4mol/L組心肌細(xì)胞[14C]Phe結(jié)合率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=18.27,P=0.01)；其中對照組、空甲羥戊酸組、10-6mol/L組、10-5mol/L組、10-4mol/L組心肌細(xì)胞[14C]Phe結(jié)合率較空瑞舒伐他汀組降低，10-4mol/L組心肌細(xì)胞[14C]Phe結(jié)合率較對照組、空甲羥戊酸組、10-6mol/L組、10-5mol/L組升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖5)。

對照組、空瑞舒伐他汀組、空角鯊烯組、10-6mol/L組、10-5mol/L組、10-4mol/L組心肌細(xì)胞[14C]Phe結(jié)合率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=11.88,P=0.04)；其中對照組、空角鯊烯組、10-6mol/L組、10-5mol/L組、10-4mol/L組心肌細(xì)胞[14C]Phe結(jié)合率較空瑞舒伐他汀組降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖6)。

對照組、空瑞舒伐他汀組、空FPP組、10-6mol/L組、10-5mol/L組、10-4mol/L組心肌細(xì)胞[14C]Phe結(jié)合率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=10.07,P=0.14,見圖7)。

對照組、空瑞舒伐他汀組、空GGPP組、10-6mol/L組、10-5mol/L組、10-4mol/L組肥大心肌細(xì)胞中[14C]Phe結(jié)合率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=10.42,P=0.11,見圖8)。

2.4 不同濃度C3胞外酶和Y27632對肥大心肌細(xì)胞[14C]Phe結(jié)合率的影響 不同濃度C3胞外酶和Y27632組肥大心肌細(xì)胞中的[14C]Phe結(jié)合率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為13.12和15.36，P值分別為0.03和0.02)；其中25.0 μg/ml C3胞外酶和10-5mol/L Y27632肥大心肌細(xì)胞 [14C]Phe結(jié)合率下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖9A、B)。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)不同的他汀類藥物產(chǎn)生的作用不同：瑞舒伐他汀顯著抑制內(nèi)皮素1誘發(fā)心肌細(xì)胞肥大，但是普伐他汀沒有此作用。之前一項(xiàng)研究表明普伐他汀抑制肝細(xì)胞的甾醇合成，功效可能與其他親脂性他汀類藥物相同[8]。但是，在其他細(xì)胞中，如人體平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及肌原細(xì)胞中，普伐他汀對膽固醇合成的抑制作用要比其他親脂性他汀類藥物低，瑞舒伐他汀的抗增殖作用也比其他普伐他汀強(qiáng)[9]。

注：與10-6mol/L組比較，*P<0.05

圖1 不同濃度瑞舒伐他汀組正常心肌細(xì)胞[14C]Phe結(jié)合率比較

Figure1 Comparison of [14C]Phe combined rate of normal cardiac myocytes in different concentrations of rosuvastatin group

注：與10-6mol/L組比較，*P<0.05

圖2 不同濃度瑞舒伐他汀組肥大心肌細(xì)胞中[14C]Phe結(jié)合率比較

Figure2 Comparison of [14C]Phe combined rate of hypertrophic cardiac myocytes in different concentrations of rosuvastatin group

圖3 不同濃度普伐他汀組正常心肌細(xì)胞中[14C]Phe結(jié)合率比較

Figure3 Comparison of [14C]Phe combined rate of normal cardiac myocytes in different concentrations of pravastatin group

圖4 不同濃度普伐他汀組肥大心肌細(xì)胞中[14C]Phe結(jié)合率比較

Figure4 Comparison of [14C]Phe combined rate of hypertrophic cardiac myocytes in different concentrations of pravastatin group

注：與空瑞舒伐他汀組比較，*P<0.05；與10-4mol/L組比較，△P<0.05

圖5 不同濃度甲羥戊酸預(yù)處理后瑞舒伐他汀對心肌細(xì)胞[14C]Phe結(jié)合率的影響

Figure5 Effects of mevalonate different concentrations of [14C]Phe combined rate of cardiac myocytes

注：與空瑞舒伐他汀組比較，*P<0.05

圖6 不同濃度角鯊烯預(yù)處理后瑞舒伐他汀對心肌細(xì)胞[14C]Phe結(jié)合率的影響

Figure6 Effects of squalene different concentrations of [14C]Phe combined rate of cardiac myocytes

注：1：對照組，2：空瑞舒伐他汀組，3：空FPP組，4：10-6mol/L組，5：10-5mol/L組，6：10-4mol/L組

圖7 不同濃度FPP預(yù)處理后瑞舒伐他汀對心肌細(xì)胞[14C]Phe結(jié)合率的影響

Figure7 Effects of FPP different concentrations of [14C]Phe combined rate of cardiac myocytes

注：1：對照組，2：空瑞舒伐他汀組，3：空GGPP組，4：10-6mol/L組，5：10-5mol/L組，6：10-4mol/L組

圖8 不同濃度GGPP預(yù)處理后瑞舒伐他汀對心肌細(xì)胞[14C]Phe結(jié)合率的影響

Figure8 Effects of GGPP different concentrations of [14C]Phe combined rate of cardiac myocytes

注：A為C3胞外酶，B為Y27632；A1:0 μg/ml組,A2:5.0 μg/ml組,A3:12.5 μg/ml組,A4:25.0 μg/ml組；B1：0 mol/L組,B2:10-7mol/L組，B3：10-6mol/L組,B4：10-5mol/L組；與25.0 μg/ml組比較，*P<0.05;與10-5mol/L組比較，△P<0.05

圖9 不同濃度C3胞外酶組和Y27632組肥大心肌細(xì)胞[14C]Phe結(jié)合率比較

Figure9 Comparison of [14C]Phe combined rate of hypertrophic cardiac myocytes in different concentrations of C3 exoenzyme and Y-27631 group

甲羥戊酸新陳代謝產(chǎn)生一系列類異戊二烯化合物，其中包括角鯊烯、FPP、GGPP。角鯊烯是一種膽固醇先驅(qū)物，F(xiàn)PP、GGPP分別參與蛋白質(zhì)的法尼基化和牛兒化[10]。甲羥戊酸路徑在細(xì)胞生長和信號傳導(dǎo)中有重要的作用[11]。本研究結(jié)果顯示甲羥戊酸(10-4mol/L)降低瑞舒伐他汀對內(nèi)皮素1誘發(fā)[14C]Phe結(jié)合增加的抑制作用。這表明，甲羥戊酸參與了瑞舒伐他汀對內(nèi)皮素1誘發(fā)[14C]phe結(jié)合增加的抑制作用。甲羥戊酸還降低了瑞舒伐他汀對正常心肌細(xì)胞中[14C]Phe結(jié)合的抑制作用。此外，角鯊烯不影響瑞舒伐他汀對內(nèi)皮素1誘發(fā)[14C]Phe結(jié)合增加的抑制作用，這表明瑞舒伐他汀的作用與其降脂性質(zhì)無關(guān)。類似的，F(xiàn)PP、GGPP也不影響瑞舒伐他汀發(fā)揮作用。角鯊烯、FPP、GGPP自身不會影響基礎(chǔ)或內(nèi)皮素1誘發(fā)[14C]Phe結(jié)合。這些觀察結(jié)果表明瑞舒伐他汀抑制內(nèi)皮素1誘發(fā)[14C]Phe結(jié)合增加的作用與蛋白質(zhì)牛兒化有關(guān)，但是與蛋白質(zhì)法尼基變化無關(guān)。角鯊烯未能逆轉(zhuǎn)瑞舒伐他汀誘發(fā)的對心肌細(xì)胞肥大的抑制作用，這表明非甾族新陳代謝產(chǎn)物而不是甾族代謝物有重要的作用。

本研究證明了親水性瑞舒伐他汀具有直接抑制內(nèi)皮素1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的作用。另外，發(fā)現(xiàn)甲羥戊酸可以降低瑞舒伐他汀的抑制作用，但是角鯊烯、FPP、GGPP沒有此作用。此外，Rho是一種重要的牛兒蛋白質(zhì)。為了確定Rho的抑制作用是否與瑞舒伐他汀對內(nèi)皮素1誘發(fā)[14C]Phe結(jié)合增加的抑制作用有關(guān)，本研究采用C3胞外酶培養(yǎng)細(xì)胞，ADP核糖基化并失活Rho。此外，還評估了Y27632(一種特殊的Rho相關(guān)激酶抑制劑)的作用。C3胞外酶(一種Rho抑制劑)及Y27632對內(nèi)皮素1誘發(fā)的心肌細(xì)胞肥大有類似的抑制作用。瑞舒伐他汀減少內(nèi)皮素1誘發(fā)的Rho A蛋白表達(dá)的增加，且甲羥戊酸可以降低此影響。這些結(jié)果表明瑞舒伐他汀部分通過Rho蛋白/Rho激酶路徑來抑制內(nèi)皮素1誘發(fā)的心肌細(xì)胞肥大。

Rho蛋白是獨(dú)特的小GTP綁定蛋白，可以被C3胞外酶抑制[12-13]。在本研究中，C3胞外酶和Rho激酶抑制劑Y27632對內(nèi)皮素1誘發(fā)心肌細(xì)胞肥大有類似的抑制作用。這些結(jié)果表明Rho/ROCK路徑在肥大中發(fā)揮重要作用，在心肌細(xì)胞的活性生長中有重要作用。盡管本研究沒有證明Rho的抑制與瑞舒伐他汀抑制心肌肥大之間有直接的關(guān)系，但是本研究結(jié)果表明心肌細(xì)胞肥大受瑞舒伐他汀抑制，且部分是通過抑制Rho信號路徑實(shí)現(xiàn)的?？傊?，本研究證明了瑞舒伐他汀部分通過抑制Rho活性，抑制內(nèi)皮素1誘發(fā)的心肌細(xì)胞肥大。

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