LC-MS/MS測定乳粉中高氯酸鹽的不確定度影響因素的探討

朱建新

上海德諾產(chǎn)品檢測有限公司， 上海 200436

高氯酸鹽是一種化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、潛在毒性大的有毒物質(zhì)，主要用于各種工業(yè)和軍事應(yīng)用，包括硝酸鹽肥料、固體火箭燃料、彈藥、炸藥、煙花、道路照明彈和安全氣囊[1]。接觸高氯酸鹽的主要途徑是攝入受污染的飲用水或用受污染的水種植的食物[2]。高氯酸鹽最終通過食物鏈進(jìn)入人體，抑制人體對碘化物甲狀腺的攝取[3],持續(xù)吸入導(dǎo)致甲狀腺功能退化，影響人體發(fā)育。高氯酸鹽已在多種食物中檢測到，包括水果、蔬菜和谷物，以及乳制品和母乳[4]，奶粉中含有高氯酸鹽，主要來源可能是在加工過程中使用了含氯的自來水或消毒劑以及包裝材料的遷移。目前，加拿大衛(wèi)生部只規(guī)定了“飲用水中高氯酸鹽的篩選值為0.004 mg/L (4 μg/L)”[5]。歐盟委員會(huì)在2020年5月20日發(fā)布(EC)2020/685號(hào)條例，補(bǔ)充規(guī)定了五類食品的高氯酸鹽限量，其中嬰兒幼兒配方奶粉、特殊醫(yī)學(xué)用途嬰幼兒配方食品為0.01 mg/kg；嬰兒食品為0.02 mg/kg；加工谷類食品為0.01 mg/kg[6]。雖然我們國家還未制訂食品中的高氯酸鹽限量標(biāo)準(zhǔn), 但監(jiān)測奶粉中的高氯酸鹽含量仍然十分必要。

測量不確定度作為測量結(jié)果的一部分，合理表征了被測量量值的分散性，對測量結(jié)果的可信性、可比性和可接受性都有重要影響，是評價(jià)測量活動(dòng)質(zhì)量的重要指標(biāo)[7]。測量不確定度的大小反映了測量結(jié)果的質(zhì)量高低，不確定度越小，表明測量結(jié)果與被測量的真值愈接近，使用價(jià)值越高；反之，其使用價(jià)值也越低。測量結(jié)果的完整性應(yīng)包括測量不確定度，對不確定度分量進(jìn)行計(jì)算并評定，確定測定乳粉中高氯酸鹽的方法中不確定度的主要影響因素，從而為提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈(CH3CN)、甲醇(CH3OH)、甲酸(HCOOH)(色譜純，默克)；乙酸(CH3COOH)(色譜純)；甲酸銨(HCOONH4)、乙酸銨(CH3COONH4)(液質(zhì)聯(lián)用級)；超純水(H2O)(電阻率為18.2 MΩ·cm)；高氯鈉鹽標(biāo)準(zhǔn)品(1 000 μg/mL)；高氯酸鹽內(nèi)標(biāo)(100 μg/mL，美國劍橋提供，CILOLM-7310-1.2)；PRiMEHLB固相萃取柱(Waters公司)；全脂乳粉。

1.2 儀器與設(shè)備

G7120A-G6470B液-質(zhì)聯(lián)用儀(安捷倫公司)；渦旋混合器(其林貝爾儀器公司)；勻漿機(jī)(Fluko)；離心機(jī)(Joucun)；電子天平(METTLER TOLEDO)；恒溫水浴振蕩器(泰仕特儀器(中國)有限公司)。

1.3 儀器條件

色譜條件：色譜柱：AcclaimTrinity P1離子交換柱(50 mm×2.1 mm，3 μm)；流動(dòng)相：A為乙腈，B為20 mmol/L乙酸銨溶液；流速：0.5 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：5.0 μL。質(zhì)譜條件：離子源：ESI源；檢測方式：MRM；掃描方式：負(fù)離子模式；毛細(xì)管電壓：200 V；錐孔壓：60 V；溶劑脫溫：500 ℃；脫溶劑氣流量：1000 L/h；錐孔氣流量：150 L/h；用MRM模式采集數(shù)據(jù)；高氯酸鹽定性離子85.0、99.0、101.0，定量離子83.0；內(nèi)標(biāo)高氯酸根定性離子107.0，定量離子89.0。

1.4 樣品測定

1.4.1稱樣：稱取乳粉試樣2 g(精確至0.000 1 g)于50 mL離心管中，加入150 μL內(nèi)標(biāo)溶液。

1.4.2提取：上述樣品中加入5.0 mL 0.1%乙酸水溶液，迅速混勻，于45 ℃水浴超聲20 min，振蕩5 min，再加入10.0 mL甲醇，混勻，10 000 r/min離心10 min，吸取上清液，凈化。

1.4.3凈化：吸取約3.0 mL上述上清液，過固相萃取柱及0.22 μm再生纖維素濾膜，棄去約1 mL流出液，收集續(xù)濾液，供上機(jī)測定。

1.4.4配制標(biāo)準(zhǔn)曲線：取0.1 mL高氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1 000 μg/mL)，于100 mL容量瓶中，超純水定容，制成1.0 μg/mL高氯酸鹽使用液。

吸取0 μL、10 μL、25 μL、50 μL、75 μL、100 μL、250 μL、500 μL、750 μL、1 000 μL高氯酸鹽使用液(1.0 μg/mL)，分別加入100 μL高氯酸鹽內(nèi)標(biāo)溶液(200 ng/mL)，制成的高氯酸鹽濃度依次為：0.0 ng/mL、1.00 ng/mL、2.5 ng/mL、5.0 ng/mL、7.5 ng/mL、10.0 ng/mL、25.0 ng/mL、50.0 ng/mL、75.0 ng/mL、100.0 ng/mL，標(biāo)準(zhǔn)工作液中高氯酸鹽-18O4濃度為2.0 ng/mL。

1.4.5上機(jī)測定：在相同試驗(yàn)條件下，分別測定標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，以內(nèi)標(biāo)校正后的響應(yīng)值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按下式(1)計(jì)算出試樣中高氯酸鹽的含量。以試樣的兩次測定平均值給出結(jié)果。

1.5 結(jié)果計(jì)算

試樣中高氯酸鹽的含量，按式(1)計(jì)算：

(1)

式中：X表示試樣中高氯酸鹽含量，μg/kg；c表示從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出的試液中高氯酸鹽含量，ng/mL；V表示試樣溶液最終定容體積，單位為毫升(mL)；f表示試樣的稀釋倍數(shù)；m表示稱樣質(zhì)量，g。

計(jì)算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。

2 結(jié)果與討論

2.1 測定條件的優(yōu)化

2.1.1流動(dòng)相考察

標(biāo)準(zhǔn)流動(dòng)相：A為乙腈，B為20 mmol/L甲酸銨溶液；改進(jìn)后流動(dòng)相：A為乙腈，B為20 mmol/L乙酸銨溶液，其他條件相同。上機(jī)后高氯酸鹽的出峰時(shí)間提前，提高分析效率,高氯酸鹽的響應(yīng)值(從2 906.8變?yōu)? 594.2)幾乎提高了一倍，詳見圖1和圖2；氯酸鹽(RT: 1.030 min)與高氯酸鹽(RT: 2.624 min)的分離效果好，能消除測定過程中氯酸鹽的干擾，詳見圖3，故選用20 mmol/L乙酸銨溶液作為B流動(dòng)相。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)流動(dòng)相甲酸銨的高氯酸鹽MRM圖

圖2 標(biāo)準(zhǔn)流動(dòng)相乙酸銨的高氯酸鹽MRM圖

圖3 氯酸鹽和高氯酸鹽的TIC圖

2.1.2提取液的考察

準(zhǔn)確稱取2 g乳粉，加入150 μL混合同位素內(nèi)標(biāo)液，分別加入5.0 mL 0.1%甲酸水溶液、5.0 mL 0.1%甲酸水溶液、5.0 mL 0.1%乙酸水溶液、5.0 mL 0.1%乙酸水溶液，混勻，水浴超聲，渦旋振蕩，再分別加入10.0 mL甲醇、10.0 mL乙腈、10.0 mL甲醇、10.0 mL乙腈，經(jīng)混勻、凈化、上機(jī)測定，測得樣液中高氯酸鹽的濃度分別為1.79 ng/mL、1.71 ng/mL、2.48 ng/mL、1.85 ng/mL，說明在相同條件下，5.0 mL 0.1%乙酸水溶液和10.0 mL甲醇，提取效果最好，故選擇之。

2.1.3檢出限的考察

空白樣品(乳粉)中添加50 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)高氯酸鹽溶液40 μL于2 g空白樣品(即加標(biāo)濃度為1.0 μg/kg)，使用優(yōu)化后的樣品處理方法和流動(dòng)相，上機(jī)測定，測得高氯酸鹽的信噪比S/N為39.5、36.4、36.2、27.3、33.3和35.3均≥3，即檢出限可降低至1.0 μg/kg，該方法具有較高的靈敏度。

2.2 不確定度來源

根據(jù)CNAS-CL01: 2018《檢測和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力認(rèn)可準(zhǔn)則》要求，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)分析和評定測量結(jié)果的不確定度。根據(jù)GB/T 27418—2017《測量不確定度評定和表示》[8]規(guī)范，合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度由A類和B類組成。采用A類評定方法的有樣品重復(fù)性的測定；采用B類評定方法的有標(biāo)準(zhǔn)品的定值、標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合、移液槍、容量瓶、溫度波動(dòng)、電子天平和LC-MS/MS儀器等。

2.2.1不確定度分量評定

2.2.1.1A類標(biāo)準(zhǔn)不確定度uA評定[9]

稱取乳粉樣品2.013 5 g和2.033 3 g兩份，經(jīng)充分混合均勻、處理后上機(jī)測定，測得高氯酸鹽含量為23.53 μg/kg、23.68 μg/kg，其平均含量為23.6 μg/kg。

采用貝塞爾公式，單次測量的標(biāo)準(zhǔn)差為：

故高氯酸鹽含量測定重復(fù)性帶入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度uA為：

2.2.1.2B類標(biāo)準(zhǔn)不確定度uB評定

(1) 體積的標(biāo)準(zhǔn)不確定度評定uB(V)

uB-3(V)=1.15%

(2) 標(biāo)準(zhǔn)品定值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度uB(B)評定

(3) 擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)不確定度uB(Q)評定

① 配制六點(diǎn)質(zhì)量濃度分別為1.0 ng/mL、2.5 ng/mL、5.0 ng/mL、10.0 ng/mL、50.0 ng/mL與100 ng/mL的高氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)使用液，每個(gè)質(zhì)量濃度平行測量2次，用最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度-內(nèi)標(biāo)校正后的響應(yīng)值曲線，標(biāo)準(zhǔn)溶液的測定結(jié)果見表1。

表1 高氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液測定結(jié)果

得出，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：

y=0.334x+0.097 6，r=0.999 95

乳粉樣品加標(biāo)6次后，經(jīng)測定由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到測試液中高氯酸鹽的質(zhì)量濃度分別為0.979 ng/mL、0.938 ng/mL、0.947 ng/mL、0.956 ng/mL、0.966 ng/mL、0.963 ng/mL，其平均質(zhì)量濃度c為 0.958 ng/mL 。

由擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線求c時(shí)產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度按下式計(jì)算。

式中：SR為從標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的內(nèi)標(biāo)校正后的響應(yīng)值Y與相應(yīng)測得的內(nèi)標(biāo)校正后的響應(yīng)值Yi之差所求出的標(biāo)準(zhǔn)偏差；m為樣品溶液的測定總次數(shù)，此處m為6；n為標(biāo)準(zhǔn)溶液的測定總次數(shù)，此處n為12；c為樣品中高氯酸鹽質(zhì)量濃度的平均值；c0為標(biāo)準(zhǔn)溶液中高氯酸鹽質(zhì)量濃度的平均值；ci為標(biāo)準(zhǔn)溶液中高氯酸鹽的質(zhì)量濃度。將數(shù)據(jù)代入計(jì)算公式得出：

② 配制九點(diǎn)高氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)濃度，增加7.5 ng/mL、25.0 ng/mL、75.0 ng/mL三個(gè)濃度點(diǎn)，經(jīng)上機(jī)測定結(jié)果見表2。

表2 三點(diǎn)高氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液測定結(jié)果

結(jié)合1中的六個(gè)點(diǎn)的結(jié)果得出，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：

y=0.333 8x+0.131 7，r=0.999 95

同樣，乳粉樣品加標(biāo)6次經(jīng)測定后，其平均質(zhì)量濃度(c)為 0.958 ng/mL。此處m為6；n為18，將數(shù)據(jù)代入計(jì)算公式得出：

由此可見，增加標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度點(diǎn)，會(huì)降低擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線求C時(shí)帶入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

(4) 設(shè)備的標(biāo)準(zhǔn)不確定度uB(s)評定

② LC-MS/MS帶入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度uB-2(s)：由LC-MS/MS檢定證書可知，取k=2 時(shí)，LC-MS/MS的相對擴(kuò)展不確定度為4%，由此帶入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度uB-2(s)為：

2.2.2標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量匯總

本實(shí)驗(yàn)中不確定的來源有A類和B類分量，其數(shù)值分布大小，詳見表3。

表3 各不確定度分量分布

因此，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線過程中的不確定度是主要影響因素，通過增加標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度點(diǎn)可最有效地降低本實(shí)驗(yàn)的不確定度。

2.3 加標(biāo)回收試驗(yàn)

稱取乳粉樣本，進(jìn)行3.0 μg/kg、15 μg/kg、75 μg/kg三個(gè)水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)(n=6)，其回收率在90.0%～108.0%之間，RSD范圍為1.50%～2.39%，結(jié)果詳見表4。

表4 乳粉中高氯酸鹽加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

2.4 其他樣品中高氯酸鹽的測定結(jié)果

通過本方法檢測，乳粉中高氯酸鹽的含量為23.6 μg/kg。同時(shí)，檢測了其他類型的食品，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)樣品中均有高氯酸鹽的檢出，其檢出的具體數(shù)據(jù)詳見下表5。雖然我國目前還未制訂食品中高氯酸鹽的限量標(biāo)準(zhǔn)，但根據(jù)歐盟委員會(huì)在2020年5月20日發(fā)布(EC)2020/685號(hào)條例，補(bǔ)充規(guī)定了五類食品的高氯酸鹽限量，部分產(chǎn)品超出了其限值，因此，食品中的高氯酸污染問題應(yīng)引起有關(guān)部門的關(guān)注。

表5 其他樣品中高氯酸鹽的檢出數(shù)據(jù)

3 結(jié)論

本文采用LC-MS/MS法測定乳粉中的高氯酸鹽含量，經(jīng)過優(yōu)化方法，檢測結(jié)果為23.6 μg/kg，檢出限可達(dá)到1.0 μg/kg。對稱樣、樣品處理、配制標(biāo)準(zhǔn)溶液、上機(jī)測定等各個(gè)步驟帶入的不確定度分量進(jìn)行了評定，其中，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線過程中帶入的不確定度是最主要的影響因素，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為6點(diǎn)時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)不確定度uB(Q)=0.118；標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為9點(diǎn)時(shí)，uB(Q)=0.103。因此，建議在日常檢測過程中加強(qiáng)檢測人員的技能培訓(xùn)，規(guī)范他們的基本操作，通過增加標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度點(diǎn)降低標(biāo)準(zhǔn)不確定度，從而提高最終檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。