一株日化產(chǎn)品污染菌及其特性分析

孫廷麗， 楊秀茳， 李彩玲， 李 東， 周少璐， 劉永龍， 謝小保*

1.廣東省科學(xué)院微生物研究所，廣東省微生物分析檢測(cè)中心， 華南應(yīng)用微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室，廣州 510070; 2.廣東迪美生物技術(shù)有限公司，廣州 510663

隨著生活水平的提高，人們對(duì)于日化產(chǎn)品的要求也不斷提高。安全、綠色及多功能等要求，都對(duì)日化產(chǎn)品的微生物控制提出了更高的挑戰(zhàn)。為滿足這些要求，一方面，要嚴(yán)格控制防腐劑的種類(lèi)及添加量[1-2]，另一方面，越來(lái)越多的生物活性物質(zhì)被應(yīng)用到日化產(chǎn)品的配方中。這些生物源性的物質(zhì)如脂類(lèi)、蛋白質(zhì)、水溶性聚合物質(zhì)等，富含微生物生長(zhǎng)繁殖所需的營(yíng)養(yǎng)，使得這些產(chǎn)品特別容易產(chǎn)生微生物的污染。此外，日化產(chǎn)品生產(chǎn)工藝大都比較簡(jiǎn)單，生產(chǎn)環(huán)境也不會(huì)進(jìn)行嚴(yán)格的微生物控制，加上日化產(chǎn)品大多數(shù)為反復(fù)使用的產(chǎn)品，因此極易產(chǎn)生微生物的污染，從而造成經(jīng)濟(jì)損失和對(duì)消費(fèi)者的健康產(chǎn)生影響[3]。因此，充分了解日化產(chǎn)品中污染微生物的特性，豐富日化產(chǎn)品污染菌種資源信息，對(duì)該類(lèi)產(chǎn)品的防腐體系構(gòu)建及污染治理具有積極的作用。

本文通過(guò)對(duì)某日化產(chǎn)品廠的污染產(chǎn)品進(jìn)行分析，確定了污染的優(yōu)勢(shì)菌及其群落構(gòu)成，并對(duì)優(yōu)勢(shì)菌的耐藥性及產(chǎn)品的防腐體系對(duì)此類(lèi)微生物的抵抗力進(jìn)行了分析，以對(duì)此類(lèi)污染的治理提供理論支持和科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)樣品

樣品為洗潔精，主要成分包括水、AES、磺酸、片堿、礦物油、鹽、香精及防腐劑。防腐劑為卡松，總甲基異噻唑啉酮含量95 mg/kg～100 mg/kg。共選取10個(gè)樣品，其中5個(gè)樣品發(fā)臭、明顯異味或疑似帶有異味，另外5個(gè)樣品為正常樣品。所有樣品均為同一工廠提供，配方一致，來(lái)源于不同生產(chǎn)批次，隨機(jī)抽樣。將上述樣品按順序分別編碼為S01～S10。防腐劑樣品CJ-5由廣東迪美生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基(PCA)，營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA)，大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(TSA)等微生物分析試劑購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；DNA提取試劑盒等分子生物學(xué)分析試劑購(gòu)自上海生工生物有限公司；其它生化試劑購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠；標(biāo)準(zhǔn)菌種購(gòu)自廣東省微生物菌種保藏中心。

1.3 儀器設(shè)備

生化培養(yǎng)箱、生物安全柜等常規(guī)微生物分析設(shè)備(廣東環(huán)凱生物科技有限公司)；高效液相色譜儀(安捷倫)；凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-rad公司)；Nano Drop超微量核酸定量?jī)x(美國(guó) Thermo 公司)；臺(tái)式高速離心機(jī)(湖南湘儀)；瓊脂糖凝膠電泳儀(北京六一生物科技有限公司)。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1微生物菌落總數(shù)計(jì)數(shù)及分離

使用GB4789.2—2016《食品微生物菌落總數(shù)的測(cè)定》規(guī)定的方法測(cè)定樣品中的微生物菌落總數(shù)，并對(duì)培養(yǎng)后有菌生長(zhǎng)的樣品進(jìn)行單菌落的純化分離[4]。

1.4.2菌種鑒定及污染樣品群落分析

對(duì)污染樣品的優(yōu)勢(shì)菌種使用16SrRNA基因測(cè)序的方法進(jìn)行菌種鑒定，即分別提取污染菌的總DNA，利用細(xì)菌的通用引物16sRNAF:5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′ 16sRNAR:5 ′-TAGGGTTACCT TGTTACGACTT-3′進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為:預(yù)熱95 ℃，5 min;變性94 ℃，50 s，退火54 ℃，40 s，延伸72 ℃，1 min 30 s，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃，10 min。將擴(kuò)增序列進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果通過(guò)BLAST查找比對(duì)分析[5]；選取典型的污染樣本進(jìn)行高通量測(cè)序，提取純化樣本DNA后，將驗(yàn)證正確的DNA樣本采用Illumina MiSeq/HiSeq測(cè)序平臺(tái)對(duì)樣本中微生物16SrRNA基因的V3-V4 區(qū)(336F-806R)進(jìn)行測(cè)序分析從而得到樣本的群落組成及豐度等信息[6-7]。

1.4.3樣品中防腐劑含量的測(cè)試

參照《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015)中規(guī)定的方法，使用高效液相色譜法測(cè)試防腐劑的含量[8]，測(cè)定結(jié)束后，于室溫保存28天后，復(fù)測(cè)防腐劑的含量。

1.4.4菌落耐藥性分析

分別測(cè)試卡松類(lèi)防腐劑對(duì)污染菌的最低抑菌濃度和使用污染菌種對(duì)樣品進(jìn)行防腐挑戰(zhàn)試驗(yàn)。具體試驗(yàn)方法如下：最低抑菌濃度測(cè)試：參照《消毒技術(shù)規(guī)范》(2002版)2.1.8.3最小抑菌濃度試驗(yàn)，使用瓊脂稀釋法測(cè)試污染樣品分離到的優(yōu)勢(shì)菌對(duì)防腐劑CJ-5的最低抑菌濃度值[9]。防腐挑戰(zhàn)試驗(yàn)：使用ASTM E 640:2019《含水化妝品防腐功效測(cè)試》規(guī)定的方法，對(duì)正常的樣品進(jìn)行防腐挑戰(zhàn)試驗(yàn)[10]。測(cè)試時(shí)，一組樣品采用標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的大腸埃希氏菌ATCC8739、金黃色葡萄球菌ATCC6538、銅綠假單胞菌ATCC9027、洋蔥伯克霍爾德氏菌ATCC10425、日溝維腸桿菌ATCC33028的混合菌懸液作為挑戰(zhàn)菌種，另一組樣品使用上述標(biāo)準(zhǔn)菌種與污染菌的混合菌液。測(cè)試結(jié)束后，對(duì)殘留的防腐劑含量進(jìn)行測(cè)定。如沒(méi)有通過(guò)防腐挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)，則對(duì)殘留菌種進(jìn)行菌種鑒定。

2 結(jié)果和討論

2.1 污染樣品微生物菌落總數(shù)結(jié)果

采樣后立即對(duì)工廠提供的樣品進(jìn)行菌落總數(shù)的測(cè)定，結(jié)果顯示，發(fā)臭有異味的樣品S01～S04，均檢出了微生物(細(xì)菌)，菌落總數(shù)菌超過(guò)了106CFU/g。疑似有異味的樣品S05及正常無(wú)異味的樣品S06～S10，菌落總數(shù)均<10 CFU/g。對(duì)所有未檢出微生物的樣品，經(jīng)室溫自然存放28 d后進(jìn)行復(fù)測(cè)，S05異味明顯，菌落總數(shù)達(dá)到1.9×104CFU/g；S06～S10性狀氣味無(wú)改變，存放后仍未檢出微生物。這表明樣品的變質(zhì)主要是由微生物污染引起。具體結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 變質(zhì)樣品中微生物的優(yōu)勢(shì)菌種及群落構(gòu)成

對(duì)污染樣品進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)后，分離培養(yǎng)得到優(yōu)勢(shì)菌種，并使用16S rRNA基因測(cè)序的方法對(duì)其進(jìn)行了鑒定。對(duì)5個(gè)樣品的測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果均為類(lèi)產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonaspseudoaligenes)，序列相似度均超過(guò)99%，具體結(jié)果見(jiàn)表2。使用高通量測(cè)序分析樣品的細(xì)菌群落構(gòu)成，在屬水平上，5個(gè)污染樣品中共注釋到了26個(gè)類(lèi)群，其中假單胞菌屬為所有樣品中共有的屬，且其序列數(shù)比例均超過(guò)50%；除此之外，蒼白桿菌屬在S01、S02中占比較高，分別為19.9%及25.4%，為第二優(yōu)勢(shì)屬；而柄桿菌屬、青桔菌屬及葡萄球菌屬則是S05中除假單胞菌屬外的其它優(yōu)勢(shì)屬，其占比分別為17.6%、20.3%及7.3%。在種水平上，5個(gè)樣品共注釋到23個(gè)類(lèi)群，類(lèi)產(chǎn)堿假單胞菌為所有樣品中的優(yōu)勢(shì)種。其中S03、S04樣品的菌種構(gòu)成比較單一，類(lèi)產(chǎn)堿假單胞菌的豐度達(dá)到99.9%；S01、S02的群落構(gòu)成基本相似，但各菌種豐度略有不同，其組成均為類(lèi)產(chǎn)堿假單胞菌(豐度分別為77.49%及77.43%)、未能分類(lèi)菌種(Unclassified，分別占19.88%及25.40%)及少量漢氏鹽單胞菌(Halomonasstevensii)(小于2%)；S05的組成最為復(fù)雜，其中類(lèi)產(chǎn)堿假單胞菌占53.59%、其獨(dú)有的優(yōu)勢(shì)菌分別包括未能鑒定到種的海洋浮游菌(unidentified marine bacterioplankton)20.32%、柄桿菌(Caulobactersp.)17.63%及路鄧葡萄球菌(Staphylococcuslentus)7.33%。上述微生物屬水平及種水平群落構(gòu)成分別見(jiàn)圖1和圖2。由上述結(jié)果可以推定，發(fā)生污染的樣品中，污染的主要來(lái)源是一致的，但不排除其它污染渠道的存在，污染樣品中可能存在其它常規(guī)培養(yǎng)中未能培養(yǎng)的微生物，或者這些微生物含量較低，不足以形成生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。

表2 微生物菌種鑒定結(jié)果及豐度分布信息

圖1 屬水平物種相對(duì)豐度

圖2 種水平物種相對(duì)豐度

2.3 樣品中防腐劑含量的測(cè)定結(jié)果

采樣后，對(duì)樣品中的防腐劑含量進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果顯示，5個(gè)微生物污染樣品中，所有樣品的防腐劑含量均有所下降，其中S01、S03樣品防腐劑含量已降至不能檢出，S02、S04、S05樣品的總甲基異噻唑啉酮含量分別是 59.9 mg/kg、 46.6 mg/kg和 85.9 mg/kg。對(duì)上述樣品自然放置28 d后復(fù)測(cè)防腐劑含量，其總異噻唑啉酮含量均下降至未檢出。這表明，樣品的腐敗菌有一定的耐藥性，且會(huì)持續(xù)的消耗防腐劑。對(duì)正常未檢出微生物的樣品也進(jìn)行防腐劑含量的檢測(cè)，其總異噻唑啉酮的含量分別為103.7 mg/kg、88.2 mg/kg、88.3 mg/kg、76.5 mg/kg和71.1 mg/kg。該配方產(chǎn)品中，正常生產(chǎn)的防腐劑理論添加量為 95 mg/kg ～100 mg/kg，S06～S08的防腐劑含量在正常允許偏差內(nèi)，而S09～S10則略有降低。復(fù)測(cè)S06～S10的防腐劑含量，發(fā)現(xiàn)其基本不變。這說(shuō)明，未發(fā)生微生物污染的樣品中，防腐劑的含量基本沒(méi)有降低，未發(fā)生大量的消耗。結(jié)合優(yōu)勢(shì)菌的鑒定結(jié)果，推測(cè)認(rèn)為，引發(fā)污染的產(chǎn)堿假單胞菌消耗或降解了體系中的防腐劑，或通過(guò)代謝改變了體系的微環(huán)境，從而造成了變質(zhì)樣品中防腐劑含量持續(xù)降低的現(xiàn)象。

表3 樣品中殘留防腐劑的含量

2.4 污染菌的耐藥性分析及對(duì)防腐體系的挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1污染菌的最低抑菌濃度結(jié)果及分析

污染菌及標(biāo)準(zhǔn)菌的最低抑菌濃度測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表4。測(cè)試數(shù)據(jù)顯示，來(lái)源于污染樣品的污染菌的最低抑菌濃度低于污染樣品體系中的防腐劑含量，說(shuō)明污染菌對(duì)變質(zhì)樣品體系中的防腐劑產(chǎn)生了一定的耐藥性，可以在較高濃度的防腐劑含量下生長(zhǎng)。但這種耐藥性并不會(huì)隨著傳代而傳遞，在防腐劑的選擇壓力消失時(shí)，其耐藥性消失，表明該腐敗菌的耐藥性不是由基因突變產(chǎn)生的穩(wěn)定耐藥，而是由于基因表達(dá)調(diào)控或代謝調(diào)控等引起的群體適應(yīng)性引起的。這樣的發(fā)現(xiàn)，對(duì)于進(jìn)一步的微生物污染治理具有積極的參考價(jià)值。

表4 污染菌及標(biāo)準(zhǔn)菌的最低抑菌濃度測(cè)試結(jié)果

2.4.2防腐挑戰(zhàn)試驗(yàn)結(jié)果

僅采用標(biāo)準(zhǔn)菌和采用標(biāo)準(zhǔn)菌加污染菌的混合菌液作為挑戰(zhàn)菌種分別進(jìn)行防腐挑戰(zhàn)試驗(yàn)，其結(jié)果見(jiàn)表5。結(jié)果顯示，對(duì)同一配方的正常產(chǎn)品進(jìn)行防腐挑戰(zhàn)試驗(yàn)，使用標(biāo)準(zhǔn)混合菌作為挑戰(zhàn)菌種時(shí)，接種后3 d微生物即下降至不能檢出；使用標(biāo)準(zhǔn)混合菌加污染菌種作為挑戰(zhàn)菌種時(shí)，則僅有一個(gè)樣品可以通過(guò)挑戰(zhàn)。對(duì)其28 d挑戰(zhàn)結(jié)束后的殘留菌種及防腐劑含量進(jìn)行測(cè)試，未能通過(guò)挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)的樣品中，殘留菌均為銅綠假單胞菌，且未通過(guò)挑戰(zhàn)的樣品28 d后已經(jīng)沒(méi)有防腐劑殘留，表明未通過(guò)挑戰(zhàn)的結(jié)果非實(shí)驗(yàn)室操作污染引起，挑戰(zhàn)結(jié)果可靠。標(biāo)準(zhǔn)混合菌均能夠通過(guò)挑戰(zhàn)測(cè)試，并且防腐劑殘留量無(wú)異常。結(jié)合前文中污染樣品中防腐劑全部無(wú)殘留，及本次防腐挑戰(zhàn)前后樣品的防腐劑含量變化，可以發(fā)現(xiàn)，在含有類(lèi)產(chǎn)堿假單胞菌的樣品下，防腐劑的含量均出現(xiàn)了大幅的下降，而不含此菌株的體系，防腐劑的含量則沒(méi)有明顯的降低。由此可以推測(cè)，分離到的污染菌是引起防腐劑含量降低的主要因素。該菌種具有一定的耐藥性，但耐藥性并不能持續(xù)傳遞，當(dāng)防腐體系中的防腐劑被消耗降解至一定濃度時(shí)，由于防腐挑戰(zhàn)菌種之間的生存競(jìng)爭(zhēng)，污染菌本身未能占據(jù)生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，導(dǎo)致挑戰(zhàn)之后的存活菌種為銅綠假單胞菌。該結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明腐敗菌具有一定的非典型性。

表5 防腐挑戰(zhàn)試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

本研究表明，引起本次日化產(chǎn)品變質(zhì)的主要原因是微生物污染，其主要污染微生物為類(lèi)產(chǎn)堿假單胞菌。這類(lèi)微生物是一種革蘭氏陰性、好氧的環(huán)境微生物，可以從石油[11]、海洋樣本[12]、切削液[13]、重金屬?gòu)U水[14]、醫(yī)院病人樣本[15-16]及其它環(huán)境[17]等中分離得到，日化污染中的報(bào)道少見(jiàn)。此類(lèi)細(xì)菌對(duì)環(huán)境具有廣泛的適應(yīng)性，可以在有重金屬、高滲透壓或某些有機(jī)殺菌劑存在的情況下存活并產(chǎn)生耐藥性。報(bào)道顯示，從上述環(huán)境中分離到的類(lèi)產(chǎn)堿假單胞菌，有些可以改變應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制，通過(guò)提高離子通道通透性、脯氨酸、抗氧化酶等的含量來(lái)提高植物對(duì)高鹽環(huán)境或干旱環(huán)境的耐受性[18-20]，有些通過(guò)差異化表達(dá)某些基因，調(diào)節(jié)蛋白及酶的水平來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)金屬富集環(huán)境的適應(yīng)[21-24]。OLAYA-ABRIL A等發(fā)現(xiàn)，在珠寶廢水中的類(lèi)產(chǎn)堿假單胞菌可以過(guò)量產(chǎn)生二氫二癸酸合酶DapA1。這是一種參與賴(lài)氨酸代謝的蛋白質(zhì)，也參與二癸酸鹽的合成，而二癸酸鹽是優(yōu)良的金屬螯合劑，可以提高鐵、銅、鋅等金屬的耐受能力[22]。此外還發(fā)現(xiàn)，類(lèi)產(chǎn)堿假單胞菌可以利用多種氮源及碳源，如石油烴[11,25]、硝基苯[26]、硝酸鹽及亞硝酸鹽[27]，及其它物質(zhì)[13,17]，一株可以降解氰化物的類(lèi)產(chǎn)堿假單胞菌在以含氰化物的首飾殘?jiān)颁@分別作為唯一氮源時(shí)，共有20個(gè)sRNAS發(fā)生了差異化表達(dá)，這些基因大多與編碼氰化物同化所必需的硝化酶NitC的nit1C基因簇、編碼氰化物不敏感的細(xì)胞色素bd型末端氧化酶的cioAB基因簇、中等長(zhǎng)度的聚羥基脂肪酸鹽(ml-PHAs)基因簇、編碼谷氨酰胺合成酶和尿素酶的基因簇相關(guān)[23]。同時(shí)這類(lèi)菌株還具有一定的致病性，并發(fā)現(xiàn)其對(duì)某些抗生素有一定的耐藥性[28-29]。本次污染中分離到的腐敗菌可以持續(xù)引起異噻唑啉酮類(lèi)消毒劑的降解或消耗，對(duì)此類(lèi)消毒劑有一定的耐受性。由于其耐藥性沒(méi)有實(shí)現(xiàn)持續(xù)的傳遞，初步推測(cè)不是由基因突變導(dǎo)致的，這種對(duì)防腐劑的耐受性，可能是由于能降解這種防腐劑的酶的基因表達(dá)或翻譯水平發(fā)生了調(diào)控；也可能是污染菌的代謝途徑發(fā)生了改變，使得體系的微環(huán)境發(fā)生了改變，從而引起甲基異噻唑啉酮類(lèi)防腐劑降解，或者是其它的未知的途徑改變等引起的獲得性耐藥。使用這種腐敗菌種混合標(biāo)準(zhǔn)菌進(jìn)行防腐挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)時(shí)，比較難以通過(guò)挑戰(zhàn)測(cè)試，但是最終體系中殘留的菌種卻不是這種污染菌，進(jìn)一步表明了這個(gè)菌種的特殊性。由于尚沒(méi)有關(guān)于這種微生物對(duì)卡松類(lèi)防腐劑耐藥性的深入報(bào)道，其耐藥機(jī)理其耐藥機(jī)理值得進(jìn)一步的研究和探討。

近年來(lái)，隨著法律法規(guī)的不斷完善，允許使用的防腐劑類(lèi)別逐年受限，導(dǎo)致產(chǎn)品保護(hù)的壓力越來(lái)越大[30-31]。逐年縮緊的使用譜和不斷增加的防腐劑添加量，進(jìn)一步導(dǎo)致了耐藥菌的產(chǎn)生，從而形成惡性循環(huán)[32]。因此，建立工業(yè)產(chǎn)品的污染菌種數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)對(duì)工業(yè)產(chǎn)品中的腐敗微生物的分離鑒定，充分了解其生物學(xué)特性及耐藥特征，有助于制定出更合理有效的微生物控制方案。除了常見(jiàn)的污染微生物，非常規(guī)、不典型的菌種也應(yīng)該引起充分的重視，這對(duì)于科學(xué)的進(jìn)行日化產(chǎn)品生產(chǎn)、運(yùn)輸、存儲(chǔ)及使用過(guò)程的微生物控制具有積極的意義。