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    核型分析聯(lián)合CNV-seq技術(shù)在羊水染色體嵌合體檢測(cè)中的應(yīng)用

    2022-08-11 08:25:36高明雅柴玉瓊王亞男
    檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床 2022年15期
    關(guān)鍵詞:嵌合體核型羊水

    高明雅,柴玉瓊,王亞男

    洛陽(yáng)市婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳與產(chǎn)前診斷科,河南洛陽(yáng) 471000

    羊水染色體嵌合體是產(chǎn)前診斷中發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)常見(jiàn)核型異常,但嵌合體形成機(jī)制復(fù)雜,存在真假性嵌合,因此給臨床咨詢(xún)工作帶來(lái)很大難度和挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)觀(guān)點(diǎn)認(rèn)為,在染色體異常的診斷中,常規(guī)染色體核型分析是確診的重要手段,也是臨床首選的方法[1]。但羊水染色體核型分析受取樣、體外培養(yǎng)、制片等多種因素影響,也存在一定的漏診和誤診。因此,有研究認(rèn)為,羊水染色體核型分析結(jié)果提示嵌合的孕婦應(yīng)使用其他檢測(cè)技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證[2]。近年來(lái),隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展及檢測(cè)成本的降低,越來(lái)越多的產(chǎn)前診斷中心把染色體核型分析聯(lián)合基因組拷貝數(shù)變異測(cè)序(CNV-seq)技術(shù)作為產(chǎn)前診斷的有效策略[3],二者聯(lián)合檢測(cè),可極大提高染色體嵌合體檢測(cè)的靈敏度。本研究擬就本院行羊水穿刺后進(jìn)行兩種方法聯(lián)合檢測(cè)的羊水標(biāo)本進(jìn)行回顧性分析,探討兩種方法羊水染色體嵌合體診斷中的準(zhǔn)確性,并進(jìn)一步分析不同產(chǎn)前診斷指征孕婦在羊水染色體核型的嵌合情況,期望能為臨床正確處理和解釋羊水染色體嵌合體提供一定的理論依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

    1 資料與方法

    1.1一般資料 選擇2019年8月至2020年12月在本院醫(yī)學(xué)遺傳與產(chǎn)前診斷科進(jìn)行羊水穿刺的孕婦3 920例為研究對(duì)象,按照產(chǎn)前診斷指征分為4類(lèi),(1)高齡:預(yù)產(chǎn)期年齡≥35歲;(2)血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn):本實(shí)驗(yàn)室采用四聯(lián)篩查方案進(jìn)行篩查,即游離絨毛膜促性腺激素(free-β-HCG)+甲胎蛋白(AFP)+游離雌三醇(uE3)+抑制素A(InhA),按照豐華血清學(xué)篩查試劑盒說(shuō)明書(shū)界定21-三體綜合征高危值為1/270,18-三體綜合征高危值為1/350;(3)無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)(NIPT)結(jié)果異常;(4)超聲結(jié)果異常:包括胎兒頸部透明帶厚度(NT)增厚、結(jié)構(gòu)異常等因素。納入者孕周控制在18~24周,無(wú)羊水穿刺禁忌證,孕婦均簽署羊水穿刺核型分析與CNV-seq技術(shù)檢測(cè)知情同意書(shū)。

    1.2方法

    1.2.1超聲引導(dǎo)下經(jīng)腹羊膜腔穿刺術(shù) 超聲引導(dǎo)下采用21G穿刺針對(duì)孕婦行穿刺手術(shù),為避免母細(xì)胞污染,先抽取羊水2 mL丟棄,改換注射器后繼續(xù)抽取羊水3管,每管約10 mL,兩管用于細(xì)胞培養(yǎng),剩余1管提取DNA行 CNV-seq技術(shù)檢測(cè)。

    1.2.2羊水染色體核型分析 兩管羊水分別按兩線(xiàn)獨(dú)立操作,Ⅰ線(xiàn)采用德國(guó)cytogen培養(yǎng)基,Ⅱ線(xiàn)采用廣州白云山培養(yǎng)基,分別置于兩臺(tái)培養(yǎng)箱獨(dú)立培養(yǎng)。9~10 d后使用消化法收獲細(xì)胞并制片。G顯帶染色后萊卡自動(dòng)掃描儀掃片分析,計(jì)數(shù)不少于來(lái)自于兩線(xiàn)培養(yǎng)的20個(gè)細(xì)胞,分析不少于5個(gè)完整細(xì)胞。按照《胎兒染色體核型分析判讀指南》[4]對(duì)羊水染色體嵌合體情況進(jìn)行評(píng)估,必要時(shí)加大計(jì)數(shù)和分析數(shù)量。

    1.2.3CNV-seq技術(shù)檢測(cè)方法 取剩余羊水標(biāo)本5 mL離心,根據(jù)TIANGEN DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,提取終濃度≥5 ng/L DNA作為模板構(gòu)建測(cè)序文庫(kù),550AR測(cè)序儀進(jìn)行低深度測(cè)序,分析并記錄23對(duì)染色體非整倍體改變及100 kb以上的缺失及重復(fù)。CNV改變按照國(guó)際系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行命名。

    1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Excel對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理。

    2 結(jié) 果

    2.1胎兒染色體嵌合體檢出情況 在3 920例羊水標(biāo)本中,核型分析檢出嵌合體共19例,檢出率為0.48%,CNV-seq技術(shù)檢出嵌合體共12例,檢出率為0.33%,二者聯(lián)合檢測(cè)檢出嵌合體共21例,檢出率為0.53%。其中有兩例核型分析結(jié)果正常而CNV-seq技術(shù)檢測(cè)結(jié)果提示異常的標(biāo)本,后經(jīng)FISH檢測(cè)驗(yàn)證后為真性嵌合體;1例核型分析結(jié)果提示為2號(hào)染色體三體低比例嵌合(嵌合比例9%)的病例,CNV-seq技術(shù)檢測(cè)檢出嵌合體比例高達(dá)33%;兩例特納與超雌的嵌合體,因嵌合比例基本為1∶1,而造成性染色體的DNA總量變化不大,因此CNV-seq技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示均為正常。見(jiàn)表1。

    表1 核型分析與CNV-seq技術(shù)檢測(cè)羊水嵌合體結(jié)果統(tǒng)計(jì)

    續(xù)表1 核型分析與CNV-seq技術(shù)檢測(cè)羊水嵌合體結(jié)果統(tǒng)計(jì)

    2.2不同產(chǎn)前診斷指征孕婦羊水染色體嵌合體檢出情況比較 按照產(chǎn)前診斷指征不同將接受羊水穿刺的孕婦分為4組,最終,在檢出的21例羊水染色體嵌合體病例中,血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)有10例,占比最高,其次為NIPT結(jié)果異常,共檢出6例嵌合體,高齡3例,超聲結(jié)果異常2例,見(jiàn)表2。

    表2 不同產(chǎn)前診斷指征孕婦嵌合體檢出情況(n)

    2.3羊水染色體嵌合體類(lèi)型 在羊水標(biāo)本檢出的21例染色體嵌合體中,性染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常嵌合體最多,共12例,其次為常染色體數(shù)目異常,共7例。1例核型分析結(jié)果中出現(xiàn)標(biāo)記染色體嵌合體,但不能明確來(lái)源,進(jìn)一步CNV-seq技術(shù)檢測(cè)明確該標(biāo)記染色體為1號(hào)染色體部分短臂嵌合重復(fù)。見(jiàn)表3。

    表3 羊水染色體嵌合體類(lèi)型(n)

    3 討 論

    羊水染色體嵌合體,是指受精卵在早期卵裂過(guò)程中,由于染色體核內(nèi)復(fù)制、染色體不分離、丟失、斷裂重接等多種因素造成染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常,而出現(xiàn)兩種或兩種以上核型的個(gè)體[5]。羊水染色體嵌合體是產(chǎn)前診斷工作中常見(jiàn)的異常結(jié)果,其形成機(jī)制復(fù)雜。除了真性嵌合體外,特定情況下,如體外培養(yǎng)過(guò)程中的異常增殖,也會(huì)導(dǎo)致羊水假性嵌合體現(xiàn)象[6]。因此,準(zhǔn)確鑒別胎兒是否存在染色體嵌合體及嵌合體的性質(zhì),對(duì)決定孕婦的妊娠結(jié)局尤為重要。

    染色體核型分析早在20世紀(jì)60年代就已被作為臨床診斷染色體異常的“金標(biāo)準(zhǔn)”。但是,羊水染色體核型分析技術(shù)受到取材、體外培養(yǎng)、制片等多種因素的影響,在診斷低比例嵌合體及判斷真假性嵌合體方面存在明顯不足。有研究認(rèn)為,當(dāng)羊水核型分析發(fā)現(xiàn)嵌合體,需進(jìn)一步加做細(xì)胞分裂間期的FISH檢測(cè),若嵌合體比例超過(guò)20%,也可采用拷貝數(shù)變異檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行確認(rèn)[7]。CNV-seq技術(shù)是近年發(fā)展起來(lái)的分子細(xì)胞學(xué)技術(shù),可對(duì)未培養(yǎng)的分裂間期細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè),且分辨率高,檢測(cè)周期短,檢測(cè)范圍廣,很好地彌補(bǔ)了單一羊水核型分析檢測(cè)的不足,能夠更加準(zhǔn)確地輔助診斷羊水染色體嵌合體,提高檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確度[8-9]。

    本研究對(duì)本院3 920例經(jīng)羊水穿刺取材的標(biāo)本行染色體核型分析和CNV-seq技術(shù)檢測(cè),結(jié)果顯示核型分析檢出的嵌合體共19例,檢出率為0.48%,CNV-seq技術(shù)檢測(cè)檢出嵌合體共12例,檢出率為0.33%,二者聯(lián)合檢出嵌合體共21例,檢出率為0.53%,與文獻(xiàn)報(bào)道的羊水染色體嵌合體檢出率基本一致[10-11]。值得注意的是,兩例羊水核型分析結(jié)果未見(jiàn)明顯異常的病例,CNV-seq技術(shù)檢測(cè)檢出嵌合體,后經(jīng)FISH檢測(cè)證實(shí)為真性嵌合體。1例核型分析結(jié)果提示為2號(hào)染色體三體低比例嵌合(嵌合比例9%)的病例,CNV-seq技術(shù)檢測(cè)檢出嵌合體比例高達(dá)33%,后期超聲結(jié)果發(fā)現(xiàn)多項(xiàng)畸形而引產(chǎn)。由此可見(jiàn),羊水染色體核型分析因?yàn)榻?jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的體外培養(yǎng),其結(jié)果僅代表成功貼壁并形成克隆的細(xì)胞結(jié)果。在這一過(guò)程中,一些未能貼壁的死細(xì)胞被淘汰,且培養(yǎng)過(guò)程中正常細(xì)胞可能因?yàn)閮?yōu)勢(shì)生長(zhǎng)而使異常細(xì)胞的嵌合體比例降低,最終導(dǎo)致核型分析出現(xiàn)漏檢或結(jié)果偏差的情況。而CNV-seq技術(shù)檢測(cè)是直接對(duì)未培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè),包括羊水中的活細(xì)胞和死細(xì)胞,較好地避開(kāi)了核型分析的劣勢(shì)[12-13]。此外,由于常規(guī)G顯帶核型分析只能檢出5 Mb以上的缺失重復(fù),因此,該方法無(wú)法檢出小片段微缺失微重復(fù)的嵌合體,對(duì)于核型分析結(jié)果中出現(xiàn)的一些標(biāo)記染色體也不能明確性質(zhì),而CNV-seq技術(shù)檢測(cè)的分辨率可以達(dá)到100 kb,在對(duì)微缺失微重復(fù)的嵌合體檢測(cè)中發(fā)揮重要作用,對(duì)于核型分析結(jié)果不能明確的標(biāo)記染色體也能明確其性質(zhì)。在本研究中,1例核型分析結(jié)果提示出現(xiàn)小的標(biāo)記染色體嵌合體,CNV-seq技術(shù)檢測(cè)明確其為1號(hào)染色體部分短臂嵌合重復(fù),因該片段包含明確致病基因,孕婦及家屬慎重考慮后決定及時(shí)終止妊娠。對(duì)于類(lèi)似病例,兩種檢測(cè)方法聯(lián)合應(yīng)用,互為補(bǔ)充,很大程度地縮短了孕婦的產(chǎn)診周期,避免后期追加分子檢測(cè)造成長(zhǎng)時(shí)間等待,不僅可以減輕孕婦心理壓力,當(dāng)出現(xiàn)不可避免終止妊娠時(shí)也可以避免因孕周過(guò)大引產(chǎn)困難而造成孕婦身體損傷。

    CNV-seq技術(shù)檢測(cè)雖然在羊水染色體嵌合體的診斷中可以很好地彌補(bǔ)核型分析的不足,但是,由于該技術(shù)是基于二代測(cè)序技術(shù)對(duì)DNA總量的檢測(cè),因此,對(duì)于一些遺傳物質(zhì)總量不變,僅有結(jié)構(gòu)異常的變異還不能有效檢出。如本研究中,有幾例平衡易位嵌合,CNV-seq技術(shù)檢測(cè)均未能分辨出。除此之外,在性染色體的檢測(cè)中,CNV-seq技術(shù)檢測(cè)也存在不足,如本研究中的兩例特納與超雌的嵌合體,因嵌合比例基本為1∶1,而造成性染色體的DNA總量變化不大,因此CNV-seq技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示均為正常。另外,對(duì)于不平衡的性染色體嵌合體,CNV-seq技術(shù)檢測(cè)也僅能檢測(cè)出性染色體含量變化,但對(duì)具體的核型表現(xiàn)形式無(wú)法準(zhǔn)確判斷,尚需結(jié)合核型分析精準(zhǔn)解讀。

    在本研究的3 920例羊水標(biāo)本中,診斷出嵌合體的產(chǎn)前診斷指征包括唐氏篩查高風(fēng)險(xiǎn)、NIPT結(jié)果異常、超聲結(jié)果異常、高齡等。本研究中血清學(xué)篩查采用的是四聯(lián)篩查方案,早有研究證實(shí)了free-β-HCG、AFP、uE3、InhA結(jié)合孕婦年齡、孕周及體質(zhì)量等參數(shù)對(duì)產(chǎn)前篩查染色體異常及神經(jīng)管缺陷的有效性[14-15]。在本研究中,血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)組檢出的嵌合體最多,這也從側(cè)面證實(shí)了王莉芬等[16]、葉盛等[17]提出的觀(guān)點(diǎn),即血清學(xué)篩查結(jié)果的意義不應(yīng)該僅僅局限于提示21-三體綜合征、18-三體綜合征兩類(lèi)常見(jiàn)的染色體異常,其他染色體異??赡芤矔?huì)導(dǎo)致血清中激素水平異常,從而導(dǎo)致篩查結(jié)果提示高風(fēng)險(xiǎn)。另外,對(duì)于高齡孕婦來(lái)說(shuō),由于生殖細(xì)胞老化、體內(nèi)各種毒素的堆積,都將導(dǎo)致胎兒染色體出現(xiàn)異常的風(fēng)險(xiǎn)升高[18]。在本研究中,也有多例高齡孕婦出現(xiàn)染色體嵌合體的情況。這說(shuō)明年齡風(fēng)險(xiǎn)可能體現(xiàn)在細(xì)胞分裂周期的各個(gè)階段,高齡妊娠不僅增加了21-三體綜合征的風(fēng)險(xiǎn),其他染色體異常風(fēng)險(xiǎn)也隨之增加。

    綜上所述,隨著生化免疫學(xué)、超聲診斷學(xué)的發(fā)展,常規(guī)的產(chǎn)前篩查手段在一定程度上提高了胎兒染色體異常的檢出率。因此,對(duì)于常規(guī)產(chǎn)前篩查高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦,應(yīng)納入高危妊娠管理,進(jìn)一步轉(zhuǎn)診至有產(chǎn)前診斷資質(zhì)的診斷中心進(jìn)行產(chǎn)前診斷與檢測(cè)。在產(chǎn)前診斷方法的選擇上,推薦常規(guī)核型分析聯(lián)合CNV-seq技術(shù)檢測(cè),這不僅可以彌補(bǔ)單一檢測(cè)方法帶來(lái)的漏診和誤診,也在很大程度上縮短了產(chǎn)診周期,減輕孕產(chǎn)婦的心理壓力,同時(shí)可為臨床產(chǎn)前遺傳咨詢(xún)提供更加全面的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

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