脂肪來源間充質干細胞調控原發(fā)免疫性血小板減少癥小鼠Th細胞因子失衡

肖建紅，張陽春

（1.華中科技大學協(xié)和深圳醫(yī)院血液科，廣東深圳 518052；2.南華大學附屬第一醫(yī)院血液科，湖南衡陽 421001；3.深圳大學第二附屬醫(yī)院骨科中心，廣東深圳 518101）

原發(fā)免疫性血小板減少癥（primary immune thrombocytopenia，ITP）是血液科最為常見的一種由自身免疫紊亂而導致的機體血小板減少，在免疫系統(tǒng)具有器官特異性，由于人體內產(chǎn)生抗血小板自身抗體導致單核巨噬細胞系統(tǒng)破壞血小板過多，從皮膚、黏膜滲血，進而導致多個器官不同程度出血［1-2］。ITP 的發(fā)病原因及具體機制仍不完全清楚，在臨床治療上，對輕中度及急性的ITP 患者采取一般治療方法如糖皮質激素、免疫抑制劑、脾切除等等療效可顯著改善，但對于復發(fā)、難治性ITP 患者目前尚無較好的防治方案［3-4］。因此，防治ITP新的有效療法亟待探索。在治療自身免疫性疾病領域，間充質干細胞已在多個免疫性疾病的治療理念中有了跨越式發(fā)展，目前已成為一種全新的治療策略［5-6］。而在干細胞來源種類的選擇上，與骨髓等其他來源的間充質干細胞相比，脂肪來源的間充質干細胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，AMSCs）具有更大優(yōu)勢：供體充足、容易獲取及培養(yǎng)、生物個體間免疫原性低等，有著廣泛的臨床應用前景［7］。AMSCs 能否作為治療自身免疫性疾病ITP 的一種新的手段，尚有待進一步研究證實?；贏MSCs 的低免疫原性特征及臨床應用研究服務，我們采用人來源的AMSCs，探討其對ITP 小鼠的療效，免疫失衡的改善及特異性轉錄因子T-bet∕GATA-3 表達影響，并闡明AMSCs 在ITP 中的相關作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

SPF 級BALB∕c 小鼠，體質量為18～26 g，6～8 周齡，共30 只，動物實驗經(jīng)華中科技大學協(xié)和深圳醫(yī)院倫理委員會批準；脂肪組織供體：篩選在深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院手術室行抽脂術患者或和術中相關部位需要行多余脂肪組織切除的患者5 例（其中3 例女性，2 例男性），年齡18～45 歲，排除合并自身免疫系統(tǒng)疾病及影響免疫系統(tǒng)的其他疾患，并經(jīng)外科醫(yī)師確定獲取的脂肪組織無進一步臨床應用價值，以及術前術中無污染。所篩選的患者知曉實驗目的、知情同意，同時實驗方案征得我院醫(yī)學倫理委員會批準（倫審［2016］A-002號）。

1.2 AMSCs分離、培養(yǎng)及檢測以此為例重新調整標題

手術室獲取的脂肪組織快速送往實驗室，將其剪為小碎塊并清除夾雜的非脂肪組織，加入膠原酶消化后，采用Ficoll 密度梯度離心棄除浮游顆粒。AMSCs 為貼壁細胞，加入DMEM 培養(yǎng)液，5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，經(jīng)多次換液，待AMSCs 細胞生長到90%，再按比例傳代，并顯微鏡下觀察AMSCs 形態(tài)變化。根據(jù)前期研究經(jīng)驗［8］，選取生長穩(wěn)定、增殖能力強的第4 代傳代細胞，用酶聯(lián)免疫檢測儀波長570nm 測定吸光值（OD 值），繪制細胞生長曲線；同時流式細胞檢測AMSCs 表面抗原標記CD14、CD29、CD44、CD45及CD105分子表達。

1.3 AMSCs鑒定

1.3.1 誘導成脂分化 將傳代好的第4 代AMSCs以5×103∕cm2密度接種于6 孔板，待增殖達90%后，更換DMEM 培養(yǎng)液。成脂誘導組細胞每孔加入2 mL成脂誘導劑（10%FBS的HG-DMEM 培養(yǎng)液中加 入1 μmol∕L 地塞米松，10 μg∕mL 胰島素，200μmol∕L 吲哚美辛和0.5 mmol∕L IBMX），置5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 天，再用成脂誘導保持液處理，循環(huán)3 次后誘導維持培養(yǎng)液（只含有10 μg∕mL胰島素）處理一周并定期換液。對照組細胞加入10% FBS 的HG-DMEM 培養(yǎng)。3 周后行油紅“O”脂肪染色法觀察脂肪顆粒。

1.3.2 油紅“O”脂肪染色 AMSCs成脂誘導達3周后去除細胞當前使用培養(yǎng)液，PBS 清洗3 次；27.5%甲醛室溫固定20 min 后PBS 清洗3 次，空氣中干燥；加入0.5%的紅油室溫孵育1 h，60%異丙醇清洗30 s；PBS 清洗3 次后，倒置顯微鏡下觀察并記錄。

1.3.3 誘導成骨分化 將傳代好的第4 代AMSCs以5×103∕cm2密度接種于6 孔板，待增殖達90%后，更換DMEM 培養(yǎng)液。成骨誘導組細胞每孔加入2 mL 成骨誘導劑（10%FBS 的LG-DMEM 培養(yǎng)液中加入50 μmol∕L 抗壞血酸，10 mmol∕L β-磷酸甘油和100 nmol∕L 地塞米松），置5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，維持誘導3 周并定期換液。對照組細胞加入含10%FBS 的LG-DMEM 培養(yǎng)液。3 周后行茜素紅染色法觀察鈣質顆粒。

1.3.4 茜素紅染色 AMSCs 成骨誘導達3 周后去除細胞當前使用培養(yǎng)液，使用PBS 清洗三次；使用10%甲醛室溫固定15 min 后PBS 清洗3 次；按照1 mL∕孔加入40 mmol∕L 的茜素紅染色液，室溫孵育20 min 并輕微振蕩；清除掉未完全結合的染料，用PBS漂洗并振蕩5 min重復4次；傾斜放置2 min，去除多余的清洗液，倒置顯微鏡下觀察并記錄。

1.4 ITP小鼠建立及處理

將30 只BALB∕c 小鼠編號并隨機分成3 組，即正常對照組（Normal組）、ITP對照組（ITP∕PBS組）及ITP 實驗組（ITP∕AMSC 組），每組10 只，除正常對照組外，其余兩組均按我們前期已成功建立ITP 小鼠模型的方法繼續(xù)造模［9］。3 組小鼠分別處理如下，ITP 實驗組：從ITP 小鼠尾靜脈輸注200 μL 1×106∕mL AMSCs；ITP 對照組：從ITP 小鼠尾靜脈輸注200μL PBS；正常對照組小鼠不進行任何處理。根據(jù)我們既往研究及參考文獻，ITP 模型建立后進行1 次AMSCs 注射，處理后的第7 天，斷頸處死小鼠，獲取標本并進行相關指標檢測。

1.4.1 Th1∕Th2細胞因子 將獲取的小鼠部分外周血分離血清，酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）各組血清IFN-γ、IL-2、IL-4及IL-10細胞因子表達。96孔酶標板按照次序分別加入100μL 的標準品，100μL樣品，空白對照加入100μL 的蒸餾水，詳細步驟按ELISA試劑盒說明書，用酶標儀在450 nm處測吸光值（OD 值），以標準品濃度為橫坐標，OD 值為縱坐標繪制標準曲線，所有樣品孔OD 值均減除空白孔值后計算各種細胞因子含量。

1.4.2 外周血小板水平 按照實驗設計定期獲取的小鼠尾靜脈血100 μL，將血液和100 μL 1%EDTA-Na2 抗凝劑充分混合后，送檢驗科全自動血細胞分析儀檢測血常規(guī)并記錄外周血小板水平。

1.4.3 免疫磁珠分純Th 細胞 密度梯度離心法分離獲得的外周血單個核細胞，將細胞懸液移至Eppendorf 管，離心、棄上清、重懸后加入CD4 Micro-Beads 充分混勻，在4℃孵化15 min；用Buffer 洗滌細胞，再次離心、重懸。將MS 分離柱放置在MACS分離器的磁場中，以Buffer 漂洗，將細胞懸液通過分離柱，反復Buffer沖洗分離柱3次。取出分離柱，用1 mL Buffer 加壓沖洗分離柱，收集含CD4+T 淋巴細胞流出液，即Th細胞，已備基因檢測。

1.4.4 特異性轉錄因子基因表達 實時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測小鼠外周血調控Th1∕Th2 細胞分化的特異性轉錄因子T-bet∕GATA-3 表達水平，GenBank 上查找目的基因mRNA 序列，在CDS 區(qū)設計特異性引物，序列見表1。

表1 Th細胞特異性轉錄因子及相關細胞因子引物序列Table 1 Th cell specific transcription factors and related cytokines’primer sequences

按常規(guī)方法提取總RNA，加入DEPC 水溶解。取4μL RNA 模板做逆轉錄反應，逆轉錄聚合酶鏈反應體系如下：5×逆轉錄buffer 4.0 μL，下游引物（10 pmol∕μL）0.5 μL，dNTPs（10 mmol∕L）0.5 μL，MMLV（200 U∕μL）0.5 μL，DEPC 水10.5 μL，RNA模板4.0 μL，總體積為20.0 μL。實時熒光定量PCR 反應體系如下：5×SYBR Green ⅠPCR buffer 10μL，上游引物F（10 pmol∕μL）1.0μL，下游引物R（10 pmol∕μL）1.0 μL，dNTPs（10 mmol∕L）1.0 μL，Taq 酶（3 U∕μL）1.0 μL，cDNA 5.0 μL，ddH2O 31.0μL，總體積：50.0μL。PCR 條件：93℃，3 min-93℃，15 s-55℃，30 s-72℃，30 s，共40循環(huán)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理

2 結果

2.1 AMSCs細胞形態(tài)觀察

AMSCs 為貼壁細胞，形態(tài)多呈梭形，隨著細胞增殖和多次傳代，呈集落式生長，漩渦狀排列；供輸注ITP小鼠用的P4代細胞呈不規(guī)則梭形，有單個細胞核仁或者雙核，核仁基本居中，呈類圓形（圖1）。

圖1 顯微鏡下P4代AMSCs細胞形態(tài)Fig.1 Cell morphology of P4 AMSCs observed under microscope

2.2 AMSCs細胞免疫表型

P4 代AMSCs 細胞表面CD29、CD44 和CD105抗原標記呈強陽性表達，分別為97.54%、97.34%和99.61%；低表達抗原標記CD14 及CD45 分子，分別為2.51%和0.26%（圖2），細胞免疫表型鑒定結果合格。

2.3 AMSCs細胞生長曲線

P4 代細胞的生長增殖呈S 形，第0～3 天時處于起始期，3 天后增殖加快并進入對數(shù)生長期，1 周后進入平臺期。按照生長曲線實驗數(shù)據(jù)得細胞的倍增時間為26 h，其生長達平臺期平均擴增時間為5 d（圖3）。

圖3 P4代AMSCs細胞生長增殖情況Fig.3 Growth and proliferation of P4 AMSCs

2.4 AMSCs分化能力測定結果

2.4.1 AMSCs 誘導成脂分化 P4代AMSCs 增殖穩(wěn)定后，通過成脂誘導劑達3 周后去除細胞培養(yǎng)液，27.5%甲醛等處理后行油紅“O”脂肪染色倒置顯微鏡下觀察見細胞內紅色脂肪顆滴，結果符合實驗預期（圖4）。

圖4 AMSCs誘導成脂分化Fig.4 Lipogenic induction of AMSCs

2.4.2 AMSCs 誘導成骨分化 P4代AMSCs 增殖穩(wěn)定后，通過成骨誘導劑達3 周后去除細胞培養(yǎng)液，10%甲醛室溫固定等處理后，茜素紅染色液染色可見細胞質大量紅色鈣結節(jié)（圖5）。

圖5 AMSCs誘導成脂分化Fig.5 Osteogenic induction of AMSCs

2.5 小鼠一般狀況

建模后，ITP小鼠一般狀況比正常對照組較差，進食量和活動量有所下降；ITP 小鼠經(jīng)過AMSCs 治療1 周，進食量和活動量均較治療前有所增加，且好于ITP 對照組。同時ITP 實驗組經(jīng)AMSCs 治療1周后觀察小鼠皮膚紫癜范圍有所減少。分組前及各組小鼠在干預前（0 周）、造模后1 周（第1 周）及AMSCs 治療后1 周（第2 周）體質量符合正態(tài)分布，經(jīng)單因素方差分析3 組小鼠體質量在第1 及2 周組間差異有統(tǒng)計學意義（統(tǒng)計值分別為F=4.12，P=0.035 4；F=5.06，P=0.018 6），采用Bonferroni 法進一步作兩兩比較統(tǒng)計得出：ITP 小鼠在AMSCs 治療前（第1 周）的平均體質量（ITP∕PBS 組及ITP∕AMSC組）均輕于正常小鼠Normal 組，差異有統(tǒng)計學意義（分別為P=0.008 5，P=0.007 8），而ITP∕PBS組與ITP∕AMSC組比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0.525 1）；2周后，經(jīng)AMSCs 治療后ITP 小鼠的體質量雖未恢復至正常小鼠，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.028 1），但比對照組ITP 小鼠顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000 6；表2）。

表2 不同時間各組小鼠體質量情況比較Table 2 Comparison of mice weight in each group at different time g（）

表2 不同時間各組小鼠體質量情況比較Table 2 Comparison of mice weight in each group at different time g（）

Compared with the normal group，1）P＜0.001；2）P＜0.01；compared with the control group，3）P＜0.05.

2.6 外周血小板水平檢測

通過血細胞分析儀檢測小鼠外周血小板水平，各組數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，經(jīng)單因素方差分析，3 組小鼠血小板水平在第3～6 天組間差異均有統(tǒng)計學意義，第3 天（F=56.18，P=0.000 0）、第4 天（F=44.35，P=0.000 0）、第5 天（F=41.63，P=0.000 0）、第6天（F=37.35，P=0.000 0）。采用Bonferroni法進一步作兩兩比較發(fā)現(xiàn)：與Normal 組小鼠比較，ITP∕PBS 組及ITP∕AMSC 組小鼠血小板水平較低（均P=0.000 0）；經(jīng)AMSCs 治療后，ITP∕AMSC 組血小板水平雖有所升高（與ITP∕PBS 組比較，在第3～6 天，均有統(tǒng)計學差異，P值依次為0.010 4、0.000 6、0.000 0及0.000 0），但仍未達到正常水平（與Normal 組比較，仍有顯著性差異，均P=0.000 0；圖6）。通過3組數(shù)據(jù)比較分析得出，AMSCs 可提高ITP 小鼠血小板水平。

圖6 3組小鼠外周血小板水平變化Fig.6 Changes of peripheral blood platelet levels in three groups

2.7 T-bet/GATA-3表達水平

通過RT-PCR 檢測特異性轉錄因子T-bet∕GATA-3 mRNA 表達水平，各組數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，經(jīng)單因素方差分析，3 組小鼠T-bet mRNA 及GATA-3 mRNA 表達組間差異均有統(tǒng)計學意義（統(tǒng)計值分別為F=29.86，P=0.000 0；F=27.35，P=0.000 0）。采用Bonferroni 法進一步作兩兩比較發(fā)現(xiàn)ITP∕PBS組小鼠T-bet 表達明顯高于Normal 組及ITP∕AMSC組小鼠（均P=0.000 0）；經(jīng)AMSCs 治療后，ITP 小鼠T-bet表達雖有所降低，但仍高于正常小鼠，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000 0）。而對于Th2 細胞的特異性轉錄因子GATA-3 mRNA 表達，ITP∕PBS 組小鼠明顯低于Normal 組小鼠表達（P=0.000 0）；經(jīng)AMSCs 治療后，ITP 小鼠GATA-3 表達顯著上升，高于ITP∕PBS 組小鼠（P=0.000 0），但仍低于正常小鼠（P=0.012 8；圖7）。

圖7 T-bet/GATA-3 mRNA在3組小鼠中的表達Fig.7 Expression of T-bet/GATA-3 mRNA in three groups of mice

2.8 小鼠外周血Th1/Th2細胞因子表達

通過ELISA檢測小鼠外周血Th1∕Th2相關細胞因子，各組數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，經(jīng)單因素方差分析，3 組小鼠IL-2、IFN-γ、IL-4 及IL-10 表達組間差異均有統(tǒng)計學意義（統(tǒng)計值分別為F=29.86，P=0.000 0；F=27.35，P=0.000 0）。采用Bonferroni 法進一步作兩兩比較發(fā)現(xiàn)：ITP∕PBS 小鼠血清Th1 細胞因子IFN-γ、IL-2 水平高于正常Normal 組（均P=0.000 0），經(jīng)AMSCs 治療后，ITP 小鼠IFN-γ、IL-2與ITP∕PBS 組比較顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（分別為P=0.000 6，P=0.000 8），雖然IL-2 水平尚未恢復正常小鼠水平（P=0.010 5），但IFN-γ因子已接近正常水平，與Normal 組比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0.084 2）；對于Th2 細胞因子IL-4 及IL-10，ITP∕PBS 小鼠顯著低于Normal 組（均P=0.000 0），經(jīng)AMSCs 輸注后，ITP 小鼠血清IL-4 及IL-10 水平均上升，雖與Normal 組比較尚未恢復正常水平（分別為P=0.018 4，P=0.025 1），但較ITP∕PBS組小鼠有非常顯著差異（分別為P=0.000 1，P=0.000 7；圖8）。

圖8 ITP小鼠Th1/Th2細胞相關因子表達Fig.8 Expression of Th1/Th2 cytokines in ITP mice

3 討論

ITP 是人體血液系統(tǒng)的常見病，亦與免疫系統(tǒng)密切相關，是具有器官特異性的自身免疫紊亂性血液病［10-11］。由于人體內產(chǎn)生抗血小板自身抗體導致單核巨噬細胞系統(tǒng)破壞血小板過多，從早期的皮膚黏膜滲血，進展為多個重要器官的不同程度出血［11］。在臨床治療上，對輕中度及急性的ITP 患者采取一般治療方法如糖皮質激素、免疫抑制劑、脾切除等等療效顯著，但對于復發(fā)、難治性ITP 患者目前尚無較好的防治方案［3，12-13］。近年來，對ITP的發(fā)病機制有了更新的認識：ITP 患者機體產(chǎn)生了針對自身自身抗體的淋巴B 細胞離不開特異性自身反應性T 細胞的輔助即Th 細胞（輔助性T 淋巴細胞），分化異常的Th 及其產(chǎn)生的細胞因子導致機體Th 淋巴細胞免疫失衡，進而引起一系列免疫炎性反應，產(chǎn)生針對血小板的自身反應性抗體異常增多，最終導致ITP的發(fā)生和發(fā)展［10，14］。

目前認為，ITP 機體Th 淋巴細胞免疫的失衡，主要是其產(chǎn)生的Th1 細胞因子和Th2 細胞因子的比例失衡所致［15］。Th 細胞的分類是根據(jù)其生物學特性和產(chǎn)生細胞因子種類而區(qū)分為4 種不同的類別，除了Th1及Th2細胞外，還有Th3細胞即調節(jié)性T 細胞（Treg）和較晚發(fā)現(xiàn)的Th17 細胞［16-17］。在ITP免疫調節(jié)機制中產(chǎn)生關鍵作用的是Th1 及Th2 細胞［16-17］。Th1 細胞主要產(chǎn)生IL-2、IFN-γ 等因子，介導固有免疫等細胞免疫應答［18］。更重要的是在ITP中，Th1 細胞因子IFN-γ 的異常升高，能直接抑制Th2 細胞的分化和功能，以及Th2 細胞因子表達［18-20］。而Th2 細胞主要產(chǎn)生IL-4、IL-10 等因子，介導機體體液免疫應答［18］。ITP 患者的Th1 和Th2的免疫失衡，主要是Th1 細胞因子異常增多導致，是Th1 因子占主導地位的免疫性疾病［18］。作者通過建立ITP 小鼠模型，并對外周血對Th1 及Th2 細胞因子檢測，再次探明，ITP 小鼠血清Th1細胞因子IFN-γ 及IL-2 的表達水平高于正常小鼠；同時Th2細胞因子IL-4及IL-10表達水平低于正常小鼠。

鑒于ITP 患者的Th1∕Th2 細胞因子的免疫失衡，新的治療理念有了跨越式發(fā)展，針對其免疫失衡的新型藥物已在臨床上逐步開始嘗試［18］。Alemtuzumab，是一種抗糖基磷脂酰肌醇錨定的糖蛋白（CD52）的人源化單克隆抗體，可抑制ITP 患者Th細胞免疫失調，雖然具體機制尚有待進一步闡明，但臨床研究發(fā)現(xiàn)Alemtuzumab 可成功改善難治性ITP 患者血小板水平并能持續(xù)有效，而不足之處是可能由于該藥物的免疫原性等問題，患者治療后多出現(xiàn)的不良反應為發(fā)熱，帶狀皰疹等［3］。人臍帶間充質干細胞是一種僅存在于新生兒臍帶組織中的一種多功能干細胞，有文獻報道慢性難治性ITP 患者經(jīng)過人臍帶間充質干細胞治療，療效顯著，在兩年的隨訪中，1年的緩解率高達100%［21］。雖然研究例數(shù)不多及還需大樣本量進一步證實，但人臍帶間充質干細胞治療后1 年的100%有效緩解率及低副反應確實令人矚目。除了臍帶間充質干細胞外，其他如骨髓間充質干細胞、AMSCs等間充質干細胞均有著共性，具有生物個體間低免疫原性，調控過度的細胞免疫應答，改善機體免疫失衡［22］。相對其他來源的間充質干細胞而言，從脂肪獲取的AMSCs，來源廣及易培養(yǎng)增殖是其最大的優(yōu)勢。在前期實驗的基礎上［23］，作者再次通過分離培養(yǎng)人來源的AMSCs 輸注ITP 小鼠，發(fā)現(xiàn)AMSCs 能改善Th1∕Th2細胞因子失衡，Th1細胞代表性因子IFN-γ、IL-2水平下降，Th2 細胞代表性因子IL-4、IL-10 的水平上升，同時ITP 小鼠外周血血小板水平提高。除了Th1∕Th2 相關細胞因子，外周血小板水平等客觀指標改善外，我們也觀察到ITP 小鼠經(jīng)AMSCs 輸注后體質量有明顯提高，雖然ITP 小鼠的皮膚黏膜等出血性瘀斑尚無客觀指標進行統(tǒng)計分析［24］，實驗組ITP小鼠經(jīng)治療后表現(xiàn)出紫癜不同程度的減少。更重要是我們進一步深層次發(fā)現(xiàn)，ITP 小鼠Th細胞特異性轉錄因子GATA-3 和T-bet 發(fā)生表達改變，Tbet 水平顯著性高于正常小鼠，同時GATA-3 表達低于正常。目前已證實，在自身免疫性疾病中特異性轉錄因子T-bet 和GATA-3 與Th 細胞的分化和Th1∕Th2 細胞因子平衡密切相關［25-27］。通過AMSCs的輸注，ITP 小鼠T-bet 表達下調，同時GATA-3 表達增加。據(jù)此，我們得出：AMSCs 可能通過對TBet∕GATA3 的轉錄調控，影響Th1∕Th2 細胞因子失衡，從而改善ITP小鼠血小板水平。

綜上所述，ITP 機體存在Th1∕Th2 細胞因子免疫失衡，以Th1 細胞因子占主導，AMSCs 可能通過對Th 細胞的T-bet∕GATA-3 的轉錄調控，減少Th1因子分泌、增加Th2 因子分泌，改善ITP 免疫失衡，恢復血小板水平。