二甲雙胍通過增強M146L細胞IDE表達促進胞內(nèi)Aβ降解

謝婷，徐采利，唐姣玲，郭開華

（中山大學中山醫(yī)學院解剖生理學系，人體解剖學教研室，廣東廣州 510080）

阿爾茲海默癥（Alzheimer’s disease，AD）是最常見的衰老相關神經(jīng)退行性疾病，淀粉樣蛋白-β（amyloid beta，Aβ）是AD 最重要的病理標志物之一。除了淀粉樣斑塊，AD 還呈現(xiàn)相關代謝紊亂的特征［1］，代謝性疾?、蛐吞悄虿。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）和AD 之間有著多重聯(lián)系［2-3］。二甲雙胍（metformin，Met）是治療T2DM 的一線藥物［4］，主要通過增加外周組織的胰島素敏感性達到降血糖效果。而目前Met是否能用于AD 治療值得關注也尚存爭議。臨床研究報道長期Met 治療可導致老年人認知及腦小血管病（cerebral small vessel disease，CSVD）改善［5-6］。然而，也有研究顯示Met 治療不會改善T2DM 高危人群的認知功能［7］。有研究報道，在db∕db 小鼠［8］及SAMP8 小鼠［9］中，Met 治療可降低Aβ 水平及改善認知能力，然而具體機制尚不清楚。Aβ 的表達水平取決于Aβ 產(chǎn)生和清除的動態(tài)平衡［10］，Aβ 來源于淀粉樣蛋白前體（amyloid precursor protein，APP）的非淀粉樣蛋白切割途徑，β分泌酶是此途徑的關鍵酶，BACE1（beta-site amyloid precursor protein cleaving enzyme 1）被認為是主要的β 分泌酶［11］。細胞中異常聚集蛋白的清除主要與蛋白酶體降解途徑和自噬-溶酶體降解途徑有關，蛋白酶體降解途徑中的各種Aβ 降解酶（Aβ-degrading proteases，AβDPs）以單獨或協(xié)同作用的方式，對調(diào)節(jié)腦內(nèi)Aβ 水平具有重要影響［12-14］。此外，有研究報道稱低劑量的Met 通過激活葡萄糖敏感途徑（lysosomal glucose-sensing pathway）調(diào)節(jié)葡萄糖水平［15］。而胰島素降解酶（Insulin-degrading enzyme，IDE）是葡萄糖代謝的關鍵分子［16］，也是最重要的AβDPs 之一，在細胞外和細胞內(nèi)Aβ 降解中都發(fā)揮重要作用［17］。值得注意地是，最近有研究顯示，在APP∕PS1 小鼠小鼠模型中，Met能減弱Aβ 病理及認知障礙，提高IDE 水平［18］，但尚未明確IDE 在此通路中的作用。因此，我們假設IDE 是Met 調(diào)節(jié)Aβ 蛋白水平改變的潛在機制。本研究采用AD 細胞模型M146L 細胞系［19-20］，通過藥理學干預等策略探索Met 對胞內(nèi)Aβ 異常積累的影響及其潛在機制。

1 材料與方法

1.1 細胞系和細胞培養(yǎng)

中國倉鼠卵巢細胞（Chinese hamster ovary cell，CHO）細胞購于中國科學院昆明細胞庫，M146L細胞購于上海谷研實業(yè)有限公司，該細胞系是將突變型PS1基因轉入過表達APP的CHO細胞，能穩(wěn)定分泌Aβ［21］。實驗倫理批號：SYSU-IACUC-2019-B989。細胞培養(yǎng)液：F12-DMEM（C11330500 BT，Gibco）添加10 g∕L 的胎牛血清（Thermo Fisher Scientific，USA）以及青鏈霉素（青霉素100 U∕mL，鏈霉素0.1 mg∕mL）（15140-122，Gibco），細胞培養(yǎng)于37 ℃，體積分數(shù)5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱。培養(yǎng)液添加200μg∕mL 的G418（A1720-1G Sigma-Aldrich）用于M146L的篩選及培養(yǎng)。

1.2 MTT實驗

細胞種板于96 孔板，放入37 ℃，5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱。細胞貼壁后，棄舊培養(yǎng)液，每孔加入10μL MTT 溶液（5 mg∕mL）及100 μL 新鮮培養(yǎng)液，37 ℃，5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄舊培養(yǎng)液，每孔加入110 μL DMSO，慢搖10 min 以溶解MTT 結晶甲臜，隨后采用酶標儀檢測490 nm的吸光度。

1.3 蛋白免疫印跡

用蛋白提取試劑盒（貝博，中國）提取蛋白，BCA 定量試劑盒（碧云天，中國）檢測以及配平蛋白濃度后，加入SDS 蛋白上樣緩沖液煮沸5 min 使蛋白變性。SDS-PAGE 凝膠電泳，保證每條泳道上樣量均為10 μL，PVDF 膜濕法轉膜。5%BSA 室溫封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜。抗體濃度分別為βactin（1：1 000，4970S，CST，USA），APP（1：1 000，2452，CST，USA）；Aβ1-42（1：500，bs-0107R，Bioss Antibodies，China）；IDE（1：1 000，ab32216，Abcam，USA）；NEP（1：100，sc-46656，SANTA，USA）；輕鏈蛋白3（light chain 3，LC3）（1：1 000，ET1701-65，HUABIO，China）；BACE（1：1 000，CST，USA）。漂洗后相應二抗室溫孵育2 h。洗膜后加入ECL 發(fā)光液顯色曝光，用GE AI600 成像系統(tǒng)（GE，USA）顯色拍照，Image J 軟件進行灰度值分析。

1.4 細胞免疫熒光

用激光共聚焦皿培養(yǎng)細胞（801002，NEST，USA），匯合度為60%時培養(yǎng)液換成加入或不加入Met 的F12-DMEM 繼續(xù)培養(yǎng)24 h。隨后棄培養(yǎng)液，PBS 洗3 次，每次5 min。多聚甲醛固定15 min。PBS 洗3 次，每次5 min。隨后加入1%BSA 及0.25%Triton X-100（Sigma）室溫孵育1 h后，加入一抗4 ℃過夜，漂洗后加入相應二抗iFluor?594 Conjugated Goat anti-rabbit IgG Goat Polyclonal Antibody（1：500，HA1122，HUABIO，China）及Hoechst 33258（1：1 000，H3570，Enzo Life Sciences）室溫孵育2 h。一抗是Aβ1-42（bs-0107R，Bioss Antibodies）和IDE（ab32216，Abcam）。滴加抗熒光萃滅封片劑后存放于4 ℃或-20 ℃。在激光共聚焦顯微鏡（LSM780；Carl Zeiss）下觀察攝片。

1.5 統(tǒng)計學分析

統(tǒng)計學分析用Graph pad Prism 9.0 進行，數(shù)據(jù)來自至少3 次獨立實驗，并用均數(shù)±標準差表示。所有定量數(shù)據(jù)經(jīng)過正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗確認為服從正態(tài)分布且方差齊后，采用單因素方差分析（One Way ANOVA），方差分析差異有統(tǒng)計學意義時采用Bonferroni 法進行兩兩比較，以雙側P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度Met 對CHO 和M146L 細胞活力的影響

為了確定Met 的最佳使用濃度，我們進行了MTT 實驗，通過測定吸光度間接反應活細胞數(shù)量及細胞活力。對CHO 細胞和M146L 細胞分別設置Met 的濃度梯度為0 μmol∕L（對照組）、25 μmol∕L、50μmol∕L、100μmol∕L、200μmol∕L，培養(yǎng)24 h后，檢測細胞活力。結果如圖1 所示，經(jīng)單因素方差分析，CHO 細胞（F=1.067，P=0.407）及M146L 細胞（F=2.166，P=0.123）組間差異均無統(tǒng)計學意義。因此，在0～200μmol∕L 濃度范圍內(nèi)，Met 處理24 h 后，CHO 細胞和M146L 細胞的細胞活性都沒有顯著改變。同時，在Met 濃度為50 μmol∕L 時兩種細胞的細胞活力均較高，因此后續(xù)實驗Met 的處理濃度均設置為50μmol∕L。

圖1 不同濃度Met 對CHO和M146L 細胞活力的影響Fig.1 The effects of Met on cell viability of CHO and M146L cells

2.2 Met誘導M146L細胞Aβ42水平降低

檢測Met 對細胞內(nèi)Aβ42表達水平的影響。結果如圖2 Western blotting 所示，經(jīng)單因素方差分析，3組間差異有統(tǒng)計學意義（F=11.880，P=0.006）；采用Bonferroni 法作兩兩比較，發(fā)現(xiàn)M146L 細胞組與CHO 對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.021），同時，Met 處理24 h 的M146L 細胞組與M146L 細胞組比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.009）。為了直觀顯示Met 處理對Aβ42水平的影響，用Aβ42以及細胞核的特異性抗體進行免疫染色，并在共聚焦顯微鏡下進行觀察（圖3A），同時進行半定量統(tǒng)計（圖3B）。經(jīng)單因素方差分析，3 組間差異有統(tǒng)計學意義（F=10.620，P=0.011）；采用Bonferroni 法作兩兩比較，發(fā)現(xiàn)M146L 細胞組與CHO 對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0.108），Met 處理24 h 的M146L 細胞組與M146L 細胞組比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.011）。因此，免疫熒光結果表明，Met 處理24 h后，M146L細胞內(nèi)Aβ42水平明顯降低。

圖2 Met 誘導M146L 細胞內(nèi)Aβ42 水平降低Fig.2 Met treatment induced Aβ42 degradation in M146L cells

圖3 免疫熒光結果顯示Met 誘導M146L 細胞內(nèi)Aβ42 水平降低Fig.3 Immunofluorescence staining showing Met treatment degraded Aβ42 deposition in M146L cells

2.3 Met 誘導M146L 細胞Aβ42水平降低與Aβ42產(chǎn)生途徑無關

APP 和BACE 是與Aβ 產(chǎn)生相關的蛋白，為了探究Met 處理下調(diào)細胞內(nèi)Aβ42表達的機制，我們首先檢測50 μmol∕L Met 處理24 h 后CHO 細胞及M146L 細胞中APP 和BACE 的蛋白表達水平。Western blotting 結果如圖4 所示：經(jīng)單因素方差分析，BACE 蛋白3 組間差異有統(tǒng)計學意義（F=6.957，P=0.027）；采用Bonferroni 法作兩兩比較，發(fā)現(xiàn)M146L 細胞組與CHO 對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.043），Met 處理24 h 的M146L 細胞組與M146L 細胞組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.999）。APP 蛋白3 組間差異無統(tǒng)計學意義（F=4.030，P=0.056）。因此，在加入50 μmol∕L Met 處理24 h 后，M146L細胞的APP、BACE表達量無明顯變化。

圖4 Met處理對APP、BACE蛋白表達的影響Fig.4 Effect of Met treatment on the expression of APP and BACE

2.4 Met 誘導M146L 細胞Aβ42水平降低與IDE 表達增強有關

我們接著檢測了Aβ降解相關蛋白在細胞內(nèi)表達量的變化，Western blotting 結果如圖5所示：經(jīng)單因素方差分析，IDE 蛋白3 組間差異有統(tǒng)計學意義（F=8.071，P=0.020）；采用Bonferroni 法作兩兩比較，發(fā)現(xiàn)M146L 細胞組與CHO 對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.035），同時，Met 處理24 h 的M146L 細胞組與M146L 細胞組比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.045）。腦啡肽酶（neprilysin，NEP）蛋白3組間差異有統(tǒng)計學意義（F=14.130，P=0.005）；采用Bonferroni 法作兩兩比較，發(fā)現(xiàn)M146L 細胞組與CHO對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.008），Met處理24 h 的M146L 細胞組與M146L 細胞組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.999）。LC3Ⅱ∕Ⅰ蛋白3組間差異有統(tǒng)計學意義（F=8.753，P=0.017）；采用Bonferroni法作兩兩比較，發(fā)現(xiàn)M146L細胞組與CHO對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.049），Met 處理24 h 的M146L 細胞組與M146L 細胞組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.999）。因此，M146L 細胞內(nèi)的IDE、NEP 及LC3Ⅱ∕Ⅰ水平明顯低于CHO 細胞，且只有IDE 蛋白水平在Met 處理24 h 后有顯著提高（圖5）。為了直觀地觀察Met 處理對IDE 水平的變化，進行了免疫熒光實驗。用IDE 以及細胞核的特異性抗體進行免疫染色，并在共聚焦顯微鏡下進行觀察。免疫熒光結果如圖6 所示，對半定量統(tǒng)計結果行單因素方差分析，3 組間IDE 蛋白水平差異有統(tǒng)計學意義（F=10.430，P=0.011）；Bonferroni 法作兩兩比較，發(fā)現(xiàn)M146L 細胞組與CHO 對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.014），同時，Met 處理24 h的M146L 細胞組與M146L 細胞組比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.045）。因此，免疫熒光顯示IDE 蛋白表達量的變化與Western blotting 結果一致，提示IDE可能參與Met對細胞內(nèi)Aβ42蛋白水平的調(diào)節(jié)。

圖5 Met 處理對Aβ42降解相關蛋白的影響Fig.5 Effect of Met treatment on the expression of proteins degrading Aβ42

圖6 免疫熒光顯示Met增強M146L細胞IDE表達Fig.6 Immunofluorescence staining shows Met treatment promoted IDE protein level in M146L cells

2.5 抑制IDE 表達將逆轉Met 對Aβ42 的降解作用

為了進一步驗證Met 對M146L 細胞的保護作用是通過IDE 介導的，我們采用IDE 的特異性抑制劑桿菌肽（Bacitracin，Bac），探究在IDE 的表達受到抑制后，Met 對Aβ42的降解作用是否會被逆轉。Western Blotting 結果顯示（圖7），對半定量結果進行單因素方差分析，IDE 蛋白3 組間差異有統(tǒng)計學意義（F=22.750，P=0.002）；采用Bonferroni 法作兩兩比較，發(fā)現(xiàn)M146L 細胞組與M146L 細胞經(jīng)Met處理24 h組比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.034），同時，M146L細胞經(jīng)Met處理24h組與M146L細胞經(jīng)Met、Bac 聯(lián)合處理24 h 組比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.002）。Aβ42蛋白3 組間差異有統(tǒng)計學意義（F=9.677，P=0.013）；采用Bonferroni 法作兩兩比較，發(fā)現(xiàn)M146L 細胞組與M146L 細胞經(jīng)Met 處理24 h組比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.029），同時，M146L細胞經(jīng)Met處理24 h組與M146L細胞經(jīng)Met、Bac聯(lián)合處理24 h 組比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.025）。因此，與Met處理組相比，50μmol∕L Met及20μmol∕L Bac 聯(lián)合處理M146L 細胞24 h 后，M146L 細胞中的IDE表達水平下調(diào)，即20μmol∕L Bac可以有效降低IDE 蛋白表達。Met 和Bac 聯(lián)合處理24 h 后，M146L 細胞中的Aβ42水平明顯升高，因此，抑制IDE 表達將逆轉Met對Aβ42的降解作用。以上結果表明，Met 對M146L 細胞Aβ42的降解作用是通過IDE介導的。

圖7 抑制IDE 表達將逆轉Met 對Aβ42 的降解作用Fig.7 Inhibition of IDE reverses Met-induced Aβ42 degradation

3 討論

目前臨床使用的AD治療藥物只能起到減緩癥狀的作用，無法阻止或延緩病情進展。因此，尋找和開發(fā)AD 治療藥物具有重要臨床價值。考慮到AD 的發(fā)病與代謝紊亂具有一定聯(lián)系。于是，將臨床糖尿病治療藥物用于AD治療或許是一個可以嘗試的思路。為此我們選擇T2DM 的一線臨床用藥Met 作為治療藥物［22］，同時將M146L 細胞作為AD模型組。我們嘗試探究Met 是否促進M146L 細胞Aβ 降解并初步探討潛在機制。在本研究中，我們在AD 細胞模型M146L 細胞系中確認了Met能夠降低胞內(nèi)Aβ42水平，這種影響依賴于Met 上調(diào)Aβ 降解酶IDE 水平，而與Aβ 產(chǎn)生途徑的APP，BACE 及Aβ降解途徑的NEP及LC3Ⅱ∕Ⅰ無關。

在Farr［9］等的研究中，Met能改善AD模型SAMP8小鼠的學習和記憶能力，這種改善與APPc99和pTau404的降低有關。同時，Met能降低Aβ1-40水平，以及增加PKC，pGSK-3β ser9 水平。在Ou［23］等的研究中，Met 通過AMPK∕mTOR∕S6K∕Bace1 和AMPK∕P65 NF-κB 信號通路促進神經(jīng)發(fā)生和抗炎，從而減少APP∕PS1 小鼠的Aβ 斑塊沉積以及改善學習記憶損害。然而，也有報道稱單獨使用Met 治療上調(diào)BACE 水平，從而增加原代皮質(zhì)神經(jīng)元和N2a695神經(jīng)元中Aβ 的合成，但聯(lián)合使用胰島素和Met可以使Aβ水平降低［24］。

眾所周知，Aβ是AD的主要病理標志物。有研究表明，相對于細胞外Aβ，神經(jīng)元內(nèi)Aβ 的積累是AD 進展中的早期事件［25］，隨著細胞外斑塊的積累，神經(jīng)元內(nèi)Aβ 水平降低［26］。因此，本研究假設細胞內(nèi)Aβ42是AD 在病理進程中較早出現(xiàn)的標志物，檢測的指標是細胞內(nèi)的Aβ42表達量。APP 分別經(jīng)β 分泌酶和γ 分泌酶的剪切是Aβ 產(chǎn)生的主要來源［25］，AβDPs 介導的蛋白降解以及自噬溶酶體途徑是Aβ清除的重要途徑，Aβ來源與清除之間的動態(tài)平衡決定了體內(nèi)Aβ的水平［10］。本研究結果顯示在Met 處理24 h 后APP 和BACE 均沒有顯著變化?？紤]到BACE 與APP 都是與Aβ 產(chǎn)生相關的關鍵蛋白，由此可以推斷：Met處理后Aβ的減少主要與Aβ的清除增多相關，而非Aβ的產(chǎn)生減少。

在Aβ 的清除機制中，AβDPs 及自噬溶酶體途徑發(fā)揮了重要作用。有研究報道在AD的小鼠模型中，Met通過激活分子伴侶介導的自噬（Chaperonemediated autophagy，CMA），進而激活TAK1-IKKα∕β 信號通路，減少APP∕PS1 小鼠大腦內(nèi)Aβ 斑塊積累，改善AD 行為障礙［27］。因此，我們檢測了IDE、NEP 這兩種主要的AβDPs 以及檢測LC3Ⅱ∕Ⅰ以判斷自噬流的活化情況。結果提示Met 對Aβ42的清除作用可能依賴于IDE 表達增強，而不依賴自噬途徑。

在Lu 等［18］的研究中，Met 能減輕氧化應激水平，降低APP∕PS1小鼠大腦中的Aβ水平，改善APP∕PS1 小鼠的學習和記憶損害，同時，Met 使p-AMPK以及IDE 的水平升高，但不影響B(tài)ACE1、PS1 等分泌酶的水平，提示Met 作為AD 治療藥物具有應用前景。我們的研究在此基礎上，采用藥理學阻斷的策略進一步明確Met 對Aβ 病理的改善是通過IDE介導的。

細胞模型具有干擾因素小、方便等特點，本次研究在AD轉基因細胞模型中證實Met對胞內(nèi)Aβ42的積極作用。我們的研究確認了Met對胞內(nèi)Aβ42異常積累的改善作用，并且明確了其中的機制是通過IDE介導，提示T2DM藥物Met作為AD藥物的治療前景。