丹頂鶴的保護(hù)遺傳學(xué)與保護(hù)基因組學(xué)研究

李菲凡 胡東宇

(沈陽(yáng)師范大學(xué)，遼寧古生物博物館，遼寧省東北亞生物進(jìn)化與環(huán)境變遷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng)，110034)

丹頂鶴(Grusjaponensis)為鶴形目(Gruiformes)鶴科(Gruidae)大型鳥(niǎo)類，目前被世界自然保護(hù)聯(lián)盟(IUCN)瀕危物種紅色名錄列為易危(VU)物種，也是國(guó)家一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物[1]，野外現(xiàn)存數(shù)量不足4 000只[2]。

作為一地區(qū)性分布物種，歷史上丹頂鶴夏季廣泛繁殖于東北亞地區(qū)的大型濕地，冬季遷徙到長(zhǎng)江中下游地區(qū)、朝鮮半島和日本本州甚至更南部地區(qū)越冬[3-5]，目前野生丹頂鶴分為大陸和島嶼2個(gè)種群。大陸種群(約2 000只)夏季主要在俄羅斯遠(yuǎn)東與中國(guó)東北交界地區(qū)繁殖，冬季在中國(guó)東部沿海和朝鮮半島的非軍事區(qū)越冬。黑龍江省境內(nèi)的松嫩平原和三江平原濕地是國(guó)內(nèi)丹頂鶴的主要繁殖地，江蘇省鹽城沿海地區(qū)和山東省境內(nèi)的黃河三角洲地區(qū)是國(guó)內(nèi)丹頂鶴的主要越冬地[2，4，6]。島嶼種群(約1 900只)終年生活于日本北海道東部地區(qū)，春秋僅有越冬地和繁殖地間的短距離移動(dòng)，所以也被稱為日本北海道種群[2-3，6]。

由于大規(guī)模的土地開(kāi)發(fā)和大量捕殺，至19世紀(jì)末，分布于日本的丹頂鶴數(shù)量急劇減少，曾一度被認(rèn)為已經(jīng)滅絕。目前的島嶼種群來(lái)自20世紀(jì)20年代在北海道東部的未開(kāi)發(fā)濕地中僅存的30余只丹頂鶴[3]。經(jīng)過(guò)保護(hù)，特別是50年代開(kāi)始的冬季人工投食，島嶼種群數(shù)量逐漸得到恢復(fù)，至2020年發(fā)展到1 900只[7]。由于從小種群發(fā)展而來(lái)，一定程度上經(jīng)歷了種群瓶頸效應(yīng)，因此島嶼種群的遺傳多樣性一直令人擔(dān)憂[6-8]。對(duì)大陸種群實(shí)施的保護(hù)始于20世紀(jì)80年代，在我國(guó)境內(nèi)越冬的丹頂鶴于20世紀(jì)末增加到接近1 200只，此后不斷減少，目前已不到500只[9]，同時(shí)棲息地也在不斷地縮小和破碎化[10-12]，大陸種群是否會(huì)重蹈島嶼種群的覆轍也令人擔(dān)憂。

遺傳多樣性是物種演化的基礎(chǔ)，保護(hù)遺傳學(xué)研究為瀕危物種保護(hù)提供理論依據(jù)。在過(guò)去的丹頂鶴保護(hù)過(guò)程中，雖然面臨著樣本獲取困難和測(cè)試費(fèi)用昂貴等難題，但還是有一些與保護(hù)遺傳學(xué)相關(guān)的研究被開(kāi)展。21世紀(jì)以來(lái)，隨著高通量測(cè)序技術(shù)，特別是二代和三代測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用，保護(hù)基因組學(xué)研究應(yīng)運(yùn)而生，為瀕危物種的科學(xué)保護(hù)提供了前所未有的機(jī)遇[13]。本文回顧了過(guò)去40年對(duì)丹頂鶴全面實(shí)施保護(hù)以來(lái)，在丹頂鶴保護(hù)遺傳學(xué)與保護(hù)基因組學(xué)研究上已取得的成果，探討了目前丹頂鶴大陸種群遺傳多樣性保護(hù)所面臨的挑戰(zhàn)，以及新的基因組學(xué)技術(shù)對(duì)今后丹頂鶴保護(hù)的潛在作用。

1 丹頂鶴的保護(hù)遺傳學(xué)研究

保護(hù)遺傳學(xué)(conservation genetics)是保護(hù)生物學(xué)和分子遺傳學(xué)相互滲透、結(jié)合而產(chǎn)生的一門分支學(xué)科，已成為保護(hù)生物學(xué)研究的一個(gè)核心部分[14]，主要研究?jī)?nèi)容包括：物種的分類地位、種群遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性、近親繁殖、遺傳變異、基因流、雜交、遷移、親系關(guān)系、有效種群大小、種群的亞分化和進(jìn)化顯著單元等方面[14]。在過(guò)去40年里，丹頂鶴保護(hù)遺傳學(xué)研究主要集中在系統(tǒng)演化、種間關(guān)系和物種的遺傳多樣性等方面。

1.1 丹頂鶴在鶴類系統(tǒng)演化中的位置

關(guān)于丹頂鶴所在鶴科15種鶴的種間關(guān)系，前后有通過(guò)DNA-DNA雜交[15]、蛋白質(zhì)電泳分析[16]、線粒體細(xì)胞色素b基因序列[17-18]、線粒體細(xì)胞色素b和NADH脫氫酶亞基6基因序列測(cè)序[19]、多基因(4個(gè)線粒體基因和3個(gè)核基因)序列測(cè)序[20-21]和線粒體全基因組序列測(cè)序[22]等進(jìn)行的多項(xiàng)研究，這些研究得出了基本一致的結(jié)果(圖1)。系統(tǒng)發(fā)育分析進(jìn)一步支持了鶴科的單系性，并且其內(nèi)部存在著種組(species group)分化，丹頂鶴、灰鶴(G.grus)、白頭鶴(G.monacha)、美洲鶴(G.americana)、黑頸鶴(G.nigricollis)形成了一個(gè)種組，被稱為美洲鶴種組(species group Americana)[22]。基于線粒體DNA序列，對(duì)鶴科各物種的分異時(shí)間所做的貝葉斯估計(jì)顯示，各物種的分異發(fā)生在新近紀(jì)，丹頂鶴于7.9百萬(wàn)年～9.0百萬(wàn)年前最早從美洲鶴種組分出(圖1)。主要用鶴屬線粒體全基因組進(jìn)行的系統(tǒng)演化分析[23]也得出了相同的結(jié)果。

圖1 基于全線粒體DNA序列的鶴類系統(tǒng)樹(shù)(基于Krajewski等[22]修改)

1.2 島嶼種群與大陸種群間遺傳多樣性差異

關(guān)于丹頂鶴島嶼種群與大陸種群間的遺傳多樣性差異，目前主要通過(guò)線粒體DNA片段測(cè)序和以微衛(wèi)星為主的核遺傳標(biāo)記分析進(jìn)行研究。各種研究共同表明，丹頂鶴島嶼種群與大陸種群(不論是野生種群，還是人工飼養(yǎng)種群)相比，具有較低的遺傳多樣性水平，并且在過(guò)去的近百年間一直維持著一個(gè)較低的遺傳變異水平。

1999年，日本學(xué)者Hasegawa等[8]對(duì)來(lái)自日本各動(dòng)物園、水族館的丹頂鶴等鶴類的線粒體DNA控制區(qū)(D環(huán)區(qū))全DNA序列進(jìn)行了測(cè)序，比較種間和種內(nèi)的序列變化，并使用其中最易變的418 bp序列評(píng)估丹頂鶴大陸與島嶼種群間的遺傳多樣性差異。研究顯示，丹頂鶴、灰鶴和白頭鶴的種內(nèi)遺傳距離相似。在丹頂鶴大陸種群中發(fā)現(xiàn)了7個(gè)D環(huán)單倍型，而島嶼種群只有2個(gè)(Gj1、Gj2)，兩者間不存在相同的單倍型。簡(jiǎn)約網(wǎng)絡(luò)(parsimony network)分析顯示，島嶼種群的單倍型并沒(méi)有形成獨(dú)立的分支，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)也顯示2組單倍型沒(méi)有按種群分成2個(gè)單系群，強(qiáng)烈地支持了2個(gè)種群屬于一個(gè)譜系，無(wú)顯著的遺傳結(jié)構(gòu)分化。Hasegawa等[8]認(rèn)為，島嶼種群的單倍型較少，可能是由該種群從少數(shù)個(gè)體恢復(fù)而來(lái)所產(chǎn)生的“瓶頸”效應(yīng)所致。此后，一個(gè)覆蓋了島嶼種群各主要繁殖地的更大樣本的測(cè)序分析證實(shí)，島嶼種群僅有Gj1和Gj2兩個(gè)單倍型，并且以Gj2為主，Gj1單倍型在島嶼種群中的分布存在著地域局限性[24]。為了解島嶼種群遺傳結(jié)構(gòu)在時(shí)間上的變化，Akiyama等[25]從日本各博物館、研究機(jī)構(gòu)等獲取1878—2001年保存的填充標(biāo)本的羽毛，并使用1970—2014年在島嶼種群主要繁殖地區(qū)采集的幼鳥(niǎo)或亞成鳥(niǎo)血液或組織樣本，對(duì)線粒體D環(huán)區(qū)DNA進(jìn)行測(cè)序，在已知的2種單倍型以外，又發(fā)現(xiàn)了一種新的單倍型Gj13，來(lái)自1997年和2007年的各1份樣本。分析結(jié)果表明：近百年來(lái)，Gj1和Gj2單倍型的頻率沒(méi)有明顯變化，Gj2頻率最低時(shí)(20世紀(jì)90年代)也達(dá)到了87.5%，Gj1頻率最高時(shí)(20世紀(jì)80年代)僅11.1%，即島嶼種群一直維持著低遺傳變異水平，而極其稀少的Gj13目前是否還存在尚不清楚。這也意味著島嶼種群的遺傳多樣性幾乎不可能靠自身獨(dú)立恢復(fù)，因此建議促進(jìn)大陸和島嶼種群間的遺傳交流，如人工引入大陸種群個(gè)體提高島嶼種群的遺傳多樣性水平[25]。

與使用線粒體DNA片段的分析同期，核遺傳標(biāo)記也被用于丹頂鶴大陸與島嶼種群的遺傳多樣性分析(表1)。Hasegawa等[26]從來(lái)自日本各動(dòng)物園、水族館飼養(yǎng)的大陸個(gè)體和北海道的野生幼鶴的DNA中分離出7個(gè)微衛(wèi)星基因座，都表現(xiàn)出明顯的等位基因變異，大陸個(gè)體表現(xiàn)為2～10個(gè)等位基因，島嶼種群則為1～4個(gè)等位基因，顯示大陸種群存在著明顯的等位基因變異，而島嶼種群的等位基因變異幅度相當(dāng)小。對(duì)我國(guó)扎龍保護(hù)區(qū)野生、散養(yǎng)和圈養(yǎng)的3個(gè)丹頂鶴小種群應(yīng)用6個(gè)微衛(wèi)星分子標(biāo)記位點(diǎn)的分析表明，3個(gè)小種群均表現(xiàn)出較高且相近的遺傳變異水平[27]；另外，從該保護(hù)區(qū)野生或散養(yǎng)個(gè)體的羽毛和蛋殼中，成功分離出12個(gè)微衛(wèi)星基因座，并證實(shí)包括這些基因座在內(nèi)的18個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記的每個(gè)組合對(duì)種群遺傳分析都是有效的[28]。對(duì)采自我國(guó)鹽城保護(hù)區(qū)的野生越冬丹頂鶴的羽毛樣本選擇6個(gè)微衛(wèi)星基因座進(jìn)行基因分型，獲得了47個(gè)等位基因，所有微衛(wèi)星位點(diǎn)均高度多態(tài)；同時(shí)，該研究對(duì)上述樣本的線粒體細(xì)胞色素b基因序列也進(jìn)行了分析，檢測(cè)出12個(gè)單倍型，系統(tǒng)發(fā)育分析顯示樣本的同源性較低[29]?；?4個(gè)基因座，對(duì)來(lái)自成都、上海、重慶和秦嶺動(dòng)物園的丹頂鶴樣本檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其基因分型在209個(gè)等位基因中表現(xiàn)出高度的多態(tài)性[30]。上述研究均顯示大陸種群具有高度的遺傳多樣性。

表1 不同研究分離的丹頂鶴種群微衛(wèi)星基因座的變異分析

1.3 親子鑒定與家族區(qū)域地理分布

利用1995—2006年在北海道不同巢址采集的幼鶴血液樣本和12個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星基因座，對(duì)北海道3個(gè)主要繁殖區(qū)的種群遺傳結(jié)構(gòu)的研究表明，3個(gè)區(qū)域種群間的遺傳多樣性沒(méi)有顯著差異，但似乎不是隨機(jī)婚配的種群[31]。空間自相關(guān)分析(spatial autocorrelation analysis)顯示，盡管丹頂鶴有很強(qiáng)的飛行能力，近距離(0～15 km)樣本間有明顯的正親緣關(guān)系，而遠(yuǎn)距離(155～205 km)樣本間則有明顯的負(fù)親緣關(guān)系，說(shuō)明在近距離的空間尺度下仍存在距離隔離。在出生地的留戀(natal philopatry)影響下的擴(kuò)散和繁殖地選擇可能是這種距離隔離的主要成因[31]。

2 丹頂鶴的保護(hù)基因組學(xué)研究

保護(hù)基因組學(xué)(conservation genomics)本質(zhì)上是保護(hù)遺傳學(xué)理論和基因組學(xué)技術(shù)的融合。它通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)，尤其是二代、三代測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用，推動(dòng)了保護(hù)遺傳學(xué)研究?jī)?nèi)容和手段的革新性變化[33-34]。保護(hù)基因組學(xué)除了在傳統(tǒng)的保護(hù)遺傳學(xué)問(wèn)題上能夠提供更加精準(zhǔn)的研究結(jié)果以外，還能對(duì)物種的演化歷史、種群的局域適應(yīng)、遺傳混合、雜交、遠(yuǎn)交衰退和基因漸滲等方面提供更加深入的研究[33-34]。

目前，有關(guān)丹頂鶴的保護(hù)基因組學(xué)研究還處于起步階段。近年有2項(xiàng)研究[22-23]分別測(cè)定了丹頂鶴線粒體全基因組序列，得到了基本一致的結(jié)果。測(cè)定的序列全長(zhǎng)分別為16 715、16 727 bp，有13和14個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因、22個(gè)tRNA基因和2個(gè)rRNA基因。2020年，丹頂鶴的全基因組序列被發(fā)表，用于研究基因與鳥(niǎo)類長(zhǎng)壽的關(guān)系，這項(xiàng)研究鑒定出了多個(gè)與丹頂鶴長(zhǎng)壽相關(guān)的候選基因，包括在代謝和免疫途徑中被正向選擇的基因，提供了低代謝率和長(zhǎng)壽相關(guān)的基因證據(jù)[35]。通過(guò)與其他鳥(niǎo)類全基因組的比較進(jìn)化分析(comparative evolutionary analysis)，估測(cè)出丹頂鶴全基因組大小為1.146 Gb，鑒定出約3 600萬(wàn)個(gè)單核苷酸變異(SNV)，核苷酸多樣性為每位點(diǎn)1.29×10-3個(gè)核苷酸取代。與無(wú)危鳥(niǎo)類物種的核苷酸多樣性中位數(shù)(每位點(diǎn)2.49×10-3個(gè)核苷酸取代)相比，丹頂鶴的核苷酸多樣性水平低，在遺傳上與瀕危物種一致。用成對(duì)順序馬爾科夫聚類(PSMC)分析方法對(duì)丹頂鶴的歷史種群數(shù)量波動(dòng)進(jìn)行了模擬，顯示從上新世晚期到更新世早期(約40萬(wàn)年前)，丹頂鶴的有效種群數(shù)量(Ne)減少；在晚更新世的最后一個(gè)冰期末期(70萬(wàn)～10萬(wàn)年前)增加。Ne在大約8萬(wàn)年前達(dá)到峰值，預(yù)計(jì)約7.0×104[35]。

3 結(jié)論與展望

3.1 結(jié)論

回顧40年來(lái)的丹頂鶴保護(hù)，保護(hù)遺傳學(xué)研究主要集中在物種的系統(tǒng)演化和遺傳多樣性，以及島嶼和大陸種群間的遺傳多樣性差異方面。在技術(shù)應(yīng)用上，證實(shí)了AFLP和微衛(wèi)星分子標(biāo)記可用于丹頂鶴親緣關(guān)系鑒定。保護(hù)基因組學(xué)研究雖歷史較短，但已完成了線粒體全基因組和全基因組序列的測(cè)定。以上研究顯示：(1)現(xiàn)存15種鶴類組成了一個(gè)單系群，丹頂鶴屬于美洲鶴種組，是該種組中最早分化出來(lái)的物種。從分化時(shí)間來(lái)說(shuō)，該種組稱為丹頂鶴種組應(yīng)該更為恰當(dāng)。(2)丹頂鶴物種的核苷酸多樣性水平較低，在遺傳上與瀕危物種一致；島嶼和大陸種群之間，雖然不存在遺傳結(jié)構(gòu)上的顯著分化，但島嶼種群的遺傳多樣性明顯低于大陸野生和人工飼養(yǎng)種群，近百年間一直維持著較低的遺傳變異水平，表明該種群獨(dú)立恢復(fù)或提高遺傳多樣性水平的可能性很低。

雖然丹頂鶴的保護(hù)遺傳學(xué)和保護(hù)基因組學(xué)研究已經(jīng)取得了一些重要的進(jìn)展，但在許多方面開(kāi)展的工作還很少，甚至還沒(méi)有涉及，如大陸種群內(nèi)部各區(qū)域分布種群的遺傳多樣性分化和各區(qū)域種群間的基因交流等。新的基因組學(xué)技術(shù)可為上述保護(hù)遺傳學(xué)問(wèn)題提供更加精準(zhǔn)的研究結(jié)果，使之前難以開(kāi)展的大規(guī)模系統(tǒng)性研究變成可能。為此，我們對(duì)目前迫切需要解決的丹頂鶴保護(hù)遺傳學(xué)問(wèn)題和未來(lái)的保護(hù)基因組學(xué)研究作出以下探討和展望。

3.2 展望

3.2.1 關(guān)于島嶼種群的遺傳多樣性的恢復(fù)

丹頂鶴島嶼種群的遺傳多樣性很低，表明19世紀(jì)末至20世紀(jì)初，島嶼種群的極度減少導(dǎo)致了遺傳多樣性的嚴(yán)重喪失[26]。同樣，由瀕臨滅絕的小種群恢復(fù)而來(lái)的美洲鶴，遺傳多樣性也一直維持在一個(gè)低水平狀態(tài)[36]。在沒(méi)有顯著遺傳結(jié)構(gòu)分化的前提下，促進(jìn)大陸與島嶼種群間的基因自然交流，或通過(guò)大陸個(gè)體或基因的人工引入方式提高島嶼種群的遺傳多樣性水平，應(yīng)該是目前可取且可行的方案，但在實(shí)施之前，有必要對(duì)丹頂鶴物種的演化歷史和大陸種群的遺傳結(jié)構(gòu)與遺傳多樣性進(jìn)行全面了解和把握，依此制定具有遺傳學(xué)依據(jù)的實(shí)施方案。

3.2.2 關(guān)于大陸種群內(nèi)部地理性遺傳變異和遺傳多樣性差異的研究

物種的分布區(qū)(繁殖地、越冬地和遷徙路徑)是在長(zhǎng)期演化過(guò)程中形成的，在分布區(qū)內(nèi)又形成了各區(qū)域種群，這一區(qū)域性及其演化過(guò)程應(yīng)在基因上有所體現(xiàn)[37]。對(duì)丹頂鶴島嶼種群的研究也顯示：即使在很小的分布區(qū)域內(nèi)，個(gè)體的基因交流也不是隨機(jī)的，雄性個(gè)體的出生地留戀性比雌性更強(qiáng)，出生地留戀的棲息地選擇可能導(dǎo)致小尺度距離隔離[31]。與島嶼種群相比，大陸種群有廣泛的地域分布，通常依據(jù)繁殖地、遷徙路線和越冬地的明顯差異分成東、西部2個(gè)區(qū)域種群，即使在各區(qū)域種群分布區(qū)內(nèi)，也存在著各繁殖地間的地理隔離。因此，大陸種群內(nèi)部或許也存在著地理性遺傳變異和遺傳多樣性差異，或者某種特定的偏性擴(kuò)散模式，對(duì)此尚不可知。在大陸種群，特別是我國(guó)境內(nèi)繁殖越冬種群面臨縮小和消失的情況下，認(rèn)識(shí)與評(píng)價(jià)各區(qū)域種群的遺傳結(jié)構(gòu)特征和進(jìn)化意義，了解區(qū)域種群間以及內(nèi)部的基因交流方式，對(duì)深入認(rèn)識(shí)和有效管理大陸種群、保護(hù)種群的進(jìn)化潛力具有十分重要的意義，并且迫在眉睫[14]。

3.2.3 關(guān)于人工種群的譜系調(diào)查和遺傳管理

目前，國(guó)內(nèi)動(dòng)物園和鶴類保護(hù)區(qū)飼養(yǎng)著一個(gè)數(shù)量超出國(guó)內(nèi)繁殖越冬野生種群的人工種群[38]。對(duì)于瀕危物種保護(hù)來(lái)說(shuō)，人工飼養(yǎng)種群是一種重要的資源儲(chǔ)備[13]，但目前對(duì)這一人工種群的譜系和遺傳特征了解得很少，基本上不清楚[30]。作為瀕危物種保護(hù)的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，譜系登記和基因信息庫(kù)的建設(shè)必不可少，以保證放歸自然個(gè)體的譜系和遺傳信息是清楚的，對(duì)野生種群的遺傳多樣性影響是可預(yù)判的，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)種群的遺傳管理[32]?？梢栽谝延械难芯炕A(chǔ)上，利用AFLP和微衛(wèi)星等分子標(biāo)記技術(shù)建立一個(gè)統(tǒng)一的標(biāo)記體系，用于查明各人工飼養(yǎng)種群的譜系，建立基因信息庫(kù)，進(jìn)行統(tǒng)一監(jiān)測(cè)和管理。

3.2.4 對(duì)保護(hù)基因組學(xué)研究的展望

目前，基因組學(xué)已從結(jié)構(gòu)基因組學(xué)轉(zhuǎn)向功能基因組學(xué)的后基因組時(shí)代，高通量測(cè)序技術(shù)也日漸成熟，正在成為特定鳥(niǎo)類研究領(lǐng)域的常規(guī)工具。低成本、短時(shí)間的高通量測(cè)序技術(shù)使大規(guī)模研究成為可能，如單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)分析，相比多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記方法，在種群遺傳交流、親緣地理和區(qū)域適應(yīng)，以及物種的演化歷史等各研究層次上均具有更高的解析力[39]，可用于丹頂鶴的相關(guān)研究。Xu等[40]用基因分型測(cè)序(genotyping-by-sequencing)方法開(kāi)發(fā)了33個(gè)丹頂鶴的SNP標(biāo)記，未來(lái)可將該標(biāo)記體系用于基因信息庫(kù)建設(shè)、丹頂鶴的遺傳多樣性保護(hù)和管理。此外，基因組學(xué)的高通量測(cè)序技術(shù)可以比保護(hù)遺傳學(xué)方法更好地解析生物結(jié)構(gòu)、功能與環(huán)境之間的協(xié)同演化關(guān)系，如能夠提取環(huán)境中全部微生物DNA的宏基因組學(xué)(metagenomics)研究[34]，未來(lái)也將成為深入研究丹頂鶴生理、行為、食性、疾病、生長(zhǎng)發(fā)育和環(huán)境適應(yīng)等課題的重要手段[35，41-42]。