貴州省桑植臭蛙及其系統(tǒng)發(fā)育分析

穆 浪 沈 拓 劉 京 李仕澤 粟海軍*

(1.貴州大學(xué)林學(xué)院，貴陽，550025；2.貴州大學(xué)生物多樣性與自然保護研究中心，貴陽，550025；3.茅臺學(xué)院資源環(huán)境系，仁懷，564500)

臭蛙屬(Odorrana)物種廣泛分布于日本、中國南部和印度支那，西至印度東北部，緬甸和泰國，南至馬來半島和蘇門答臘以及婆羅洲[1]。目前國內(nèi)報道有臭蛙屬物種40種[2-3]，貴州報道有分布的臭蛙屬物種14種，即合江臭蛙(O.hejiangensis)、大綠臭蛙(O.graminea)、綠臭蛙(O.margaretae)、黃崗臭蛙(O.huanggangensis)、宜章臭蛙(O.yizhangensis)、花臭蛙(O.schmackeri)、務(wù)川臭蛙(O.wuchuanensis)、貴州臭蛙(O.kweichowensis)、荔波臭蛙(O.liboensis)、無指盤臭蛙(O.grahami)、竹葉蛙(O.versabilis)、云南臭蛙(O.yunnanensis)、龍勝臭蛙(O.lungshengensis)和安龍臭蛙(O.anlungensis)[2-4]。

2021年5月30日，在關(guān)嶺縣開展兩棲動物多樣性調(diào)查期間，于關(guān)嶺縣滴水灘瀑布(25°58′36.951 6＂ N，105°37′0.771 6＂ E)采集到 4號成體臭蛙屬物種標(biāo)本。經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子系統(tǒng)學(xué)比較分析，鑒定為桑植臭蛙(O.sangzhiensis)，為貴州省兩棲動物新紀(jì)錄種。本研究對其形態(tài)特征及生態(tài)習(xí)性進行了描述，初步探討該種形態(tài)特征的地理變異，為臭蛙屬物種的生物地理學(xué)研究提供新的信息。

1 材料與方法

1.1 材料

4號成體臭蛙標(biāo)本取肌肉組織樣品放于95%乙醇中，標(biāo)本浸泡在10%福爾馬林溶液中，存放在茅臺學(xué)院生物學(xué)標(biāo)本室。

1.2 形態(tài)鑒定與測量

標(biāo)本的形態(tài)鑒定依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)為《中國兩棲動物及其分布彩色圖鑒》[5]；使用游標(biāo)卡尺(無錫錫工量具有限公司；量程200.0 mm，精度0.1 mm)對關(guān)嶺臭蛙標(biāo)本的 15項形態(tài)特征進行測量。形態(tài)測量依據(jù)《中國兩棲動物檢索及圖解》[6]。

1.3 分子鑒定

采用高鹽法提取肌肉樣品總 DNA[7]。利用PCR擴增并測定線粒體16S rRNA基因部分片段，引物使用16SF(5′-ACGAGCCTAGTGATAGCTGGTT-3′)和16SR(5′-CGGTCTGAACTCAGATCACGT-3′)[8]。16S rRNA基因PCR擴增條件和步驟參照桑植臭蛙新種文獻[9]。PCR擴增完成后，對產(chǎn)物電泳檢測，將符合測序要求的產(chǎn)物交生工生物工程(上海)股份有限公司測序，所得序列上傳到GenBank(尚未公開)。

從GenBank下載臭蛙屬部分物種以及蛙科(Ranidae)部分物種的16S rRNA基因序列，結(jié)合關(guān)嶺臭蛙序列，進行分子系統(tǒng)發(fā)育分析，選用序列詳情見表1，其中仙琴蛙(Nidiranadaunchina)和中國林蛙(Ranachensinensis)為外群。將下載的所有16S rRNA基因片段在CLUSTAL_X v1.8[10]中進行比對，系統(tǒng)比對后人工校對，然后采用最大似然法(maximum likelihood，ML)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。構(gòu)建ML樹前，利用jModeltest v2[11]基于AIC標(biāo)準(zhǔn)選擇最適核苷酸替代模型。用MEGA v6.0[12]中的Kimura雙參數(shù)模型計算表1中臭蛙屬物種間的遺傳距離。

表1 樣品信息和GenBank登錄號

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)鑒定與度量

本次采集的4號臭蛙標(biāo)本(GL20210530001～004)均為雌性，比較了貴州采集的臭蛙標(biāo)本和文獻所列臭蛙屬物種的形態(tài)鑒定特征，發(fā)現(xiàn)本研究采集的標(biāo)本形態(tài)特征與桑植臭蛙模式產(chǎn)地標(biāo)本相近，體長(84.1±1.7) mm (82.4～85.8 mm，n=4)，其他部位量度見表2。

表2 本文標(biāo)本及模式標(biāo)本形態(tài)度量

續(xù)表2

背部綠色，皮膚粗糙，有數(shù)個大小不一的黑斑(圖1A)；頭頂扁平，頭長大于頭寬；吻長是頭體長的14.61%，吻端鈍圓，略突出于下唇；鼻孔略近吻端；鼓膜明顯；無背側(cè)褶；掌突2；前臂及手長不到頭體長的一半，指尖膨大，指長順序Ⅰ≤Ⅱ<Ⅳ<Ⅲ；后肢細(xì)長，脛跗關(guān)節(jié)貼體前伸達鼻眼之間；脛長為頭體長的56.61%，股長是頭體長的49.61%，足長是頭體長的54.82%，趾間具蹼；趾長順序Ⅰ<Ⅱ<Ⅲ<Ⅴ<Ⅳ；腹部光滑，乳白色，股后方有褐色斑(圖1 B)。

圖1 關(guān)嶺桑植臭蛙及其生境

與貴州分布近源種的區(qū)別：桑植臭蛙與花臭蛙、黃崗臭蛙、合江臭蛙的區(qū)別在于前者頭長大于頭寬，后者均表現(xiàn)為頭長與頭寬相近；安龍臭蛙指長順序為Ⅰ≤Ⅱ<Ⅳ<Ⅲ，桑植臭蛙指長順序為Ⅱ<Ⅰ≈Ⅳ<Ⅲ；宜章臭蛙雌性體長58.2～71.5 mm，貴州臭蛙雌性體長62.4～81.4 mm，桑植臭蛙雌性體長82.4～92.7 mm；桑植臭蛙鼓膜直徑大于第Ⅲ指指盤寬度，龍勝臭蛙鼓膜直徑與第Ⅲ指指盤寬度幾乎等大[9]。

2.2 分子系統(tǒng)發(fā)育與遺傳距離

PCR擴增共獲得桑植臭蛙線粒體16S rRNA基因序列4條，長度506 bp，T、C、A、G 含量分別為23.6%、25.0%、30.3%、21.2%，A+T含量高于G+C含量。最適核苷酸替代模型為GTR+G+I。ML樹顯示關(guān)嶺縣所采集的標(biāo)本與桑植臭蛙模式標(biāo)本聚為一支，支持率為100%(圖2)。基于Kimura雙參數(shù)模型估算的臭蛙屬部分物種間的遺傳距離如表3，本研究采用的臭蛙屬物種間的遺傳距離為1.4%～10.8%，平均遺傳距離為6.8%。關(guān)嶺縣采集的桑植臭蛙與模式標(biāo)本間遺傳距離為0(表3)。因此，結(jié)合形態(tài)比較、系統(tǒng)發(fā)育分析和遺傳距離分析，確定關(guān)嶺縣滴水灘采集的臭蛙標(biāo)本為桑植臭蛙。

圖2 基于線粒體16S rRNA基因聯(lián)合序列構(gòu)建的臭蛙屬最大似然系統(tǒng)發(fā)育樹

表3 基于 16S rRNA基因聯(lián)合序列估算的臭蛙屬部分物種間Kimura雙參數(shù)遺傳距離

2.3 生境描述

關(guān)嶺桑植臭蛙生活于關(guān)嶺縣滴水灘瀑布下的河溝內(nèi)。采集地海拔約730 m，河溝內(nèi)有多處裸露的巖石，河道兩側(cè)具喬灌叢，河岸多為凹凸不平具有一定傾斜度的石壁(圖1C)，與其同域分布的兩棲動物僅發(fā)現(xiàn)黑眶蟾蜍(Duttaphrynusmelanostictus)。

3 討論

桑植臭蛙的模式產(chǎn)地為湖南桑植，此前僅在該蛙的模式產(chǎn)地有分布記錄。本研究基于形態(tài)比較、分子系統(tǒng)發(fā)育和遺傳距離分析確定該物種在貴州關(guān)嶺縣滴水灘也有分布。雖然關(guān)嶺縣桑植臭蛙種群與模式產(chǎn)地種群形態(tài)上存在差異，如與桑植種群相比，關(guān)嶺種群背部褐色斑點明顯較大；關(guān)嶺種群脛跗關(guān)節(jié)貼體前伸達鼻眼之間，而桑植種群超過吻端，但系統(tǒng)發(fā)育顯示兩個種群聚為一支，遺傳距離分析也顯示這兩個種群間的遺傳距離為0，說明兩個種群間尚未發(fā)生遺傳分化，形態(tài)上出現(xiàn)的分化可能和種群間的生境差異有關(guān)。關(guān)嶺縣地處烏蒙山系，桑植地處武陵山系，兩者間有烏江、北盤江等大江大河相隔，遺傳上未發(fā)現(xiàn)分化，但在形態(tài)上出現(xiàn)了一些分化，是否由長期的地理隔離造成，或因兩個產(chǎn)地的標(biāo)本數(shù)量非常有限造成認(rèn)識的局限，使兩者在形態(tài)上本不一定出現(xiàn)分化等，這些問題都還有待進一步研究證實。