小熊貓犬瘟熱病毒分離鑒定及其H基因序列分析

陳詩涵 黃紫貝 管飄萍 郭 鑫 王海燕 金文杰 劉文博，4*

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院傳染病學(xué)教研室，揚(yáng)州，225009；2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州，225009；3.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，泰州，225300；4.揚(yáng)州大學(xué)動物疾病檢測與技術(shù)服務(wù)中心，揚(yáng)州，225009)

犬瘟熱病毒(Canine distemper virus，CDV)是一種高度傳染性病毒，可在家養(yǎng)和野生犬科(Canidae)、熊科(Ursidae)及非人靈長類動物等多種動物中引起多系統(tǒng)、亞臨床甚至致命的疾病[1-4]。近年來，由于野生動物園的快速發(fā)展，犬瘟熱病毒的自然宿主暴露和接觸頻率有所提高，對野生動物的健康造成了巨大的威脅。犬瘟熱病無季節(jié)性，不同年齡和性別均可感染發(fā)病，幼齡動物死亡率高達(dá)80%以上，危害嚴(yán)重[5-8]。據(jù)研究，CDV編碼的H蛋白的糖基化與其對宿主的致病性有關(guān)[9]，且H蛋白較易發(fā)生變異，因此常以血凝素H基因的變化來評估CDV毒株間的遺傳變異[10]。目前根據(jù)H基因編碼的氨基酸序列，CDV毒株已分為18個主要遺傳譜系，主要包括America Ⅰ、America Ⅱ、Asia-1、Asia-2、Asia-3、Europe、European wildlife、Arctic、South America和Southern Africa等，之后又增加了Asia-4型[11]。本研究對江蘇某動物園小熊貓(Ailurusfulgens)犬瘟熱病診斷和病原學(xué)研究，通過對H基因測序，并對其序列進(jìn)行同源性比較和遺傳發(fā)生分析，鑒定2株CDV病毒分別為Africa毒株和European wildlife毒株，以期為野生動物犬瘟熱病的防控提供參考。

1 基本情況

2019年10月21日，江蘇某動物園1只小熊貓突然死亡，由于事發(fā)突然，未檢測。10月31日，又有2只小熊貓發(fā)病，用犬瘟熱膠體金試紙條檢測，結(jié)果為弱陽性，對2只小熊貓進(jìn)行血常規(guī)檢查，其中一只小熊貓紅細(xì)胞略升高，其他無異常，另一只小熊貓嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞顯著升高。

11月19日起，對患病小熊貓皮下注射頭孢拉定。11月31日起，對全體小熊貓進(jìn)行干擾素和犬瘟熱單抗治療，連續(xù)4 d，并繼續(xù)注射頭孢類藥物，但呼吸道癥狀未見明顯改善。改用康衛(wèi)寧給藥，2～3 d后未見效果，加用阿奇霉素1 d，恩諾沙星3～4 d，仍未見效果，改用美羅培南持續(xù)給藥。12月10日起，用抗CDV高免血清治療，連續(xù)4 d，期間小熊貓進(jìn)食少時，給與葡萄糖氯化鈉注射液補(bǔ)液治療，隨后病情得到控制。

2 疾病診斷方法

2.1 病理剖檢及采血

對病死小熊貓剖檢。無菌采集2管小熊貓的尾靜脈血，用PBS以1∶3倍稀釋，5 000 r/min離心5 min，取上清，用0.22 μm的濾器過濾，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 PCR檢測

取稀釋后的樣品100 μL，根據(jù)RNA simple提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)說明書提取RNA。根據(jù)TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0試劑盒(寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司)說明書，用提取的RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。RT-PCR反應(yīng)體系為：MgCl22.00 μL，10×RT Buffer 1.00 μL，RNase Free dH2O 3.75 μL，RNase Inhibitor 0.25 μL，AMV Reverse Transcriptase XL 0.50 μL，Random 9 mers 0.50 μL，Sample 1.00 μL。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：30 ℃保溫10 min，使Random 9 mers延伸達(dá)到足夠長度，50 ℃退火，與模板RNA充分結(jié)合30 min，95 ℃加熱5 min，使AMV RTase失活，5 ℃冷卻5 min。參考相關(guān)文獻(xiàn)[12-13]，合成鑒定犬瘟熱病毒的引物CDV-F和CDV-R(表1)，預(yù)期擴(kuò)增的目的片段長度為455 bp。

表1 CDV鑒定及H基因擴(kuò)增的引物

PCR反應(yīng)體系：cDNA 10.00 μL，5×PCR Buffer 10.00 μL，TaKaRa E×TaqHS 0.25 μL，CDV-F 0.50 μL，CDV-R 0.50 μL，ddH2O 28.75 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳得到符合要求的PCR產(chǎn)物送往南京擎科生物科技有限公司測序。

2.3 病毒分離培養(yǎng)

取出Vero-CD150細(xì)胞(此前在本實(shí)驗(yàn)室-80 ℃保存)復(fù)蘇，待培養(yǎng)長至80%后棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗1或2次。取過濾除菌的小熊貓CDV陽性血清樣本100 μL，按1∶10的比例加入無血清DMEM(Gibco公司)，混勻后接種單層Vero細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃、5%CO2吸附2 h，棄去培養(yǎng)基，補(bǔ)加含1%G418(賽默飛世爾科技公司)的抗生素和2%胎牛血清(FBS)細(xì)胞培養(yǎng)基(Gibco公司)，同時將未接毒的正常Vero-CD150細(xì)胞作為陰性對照，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃、5%CO2培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞病變情況。當(dāng)Vero-CD150細(xì)胞有80%及以上出現(xiàn)細(xì)胞病變時進(jìn)行收毒，反復(fù)凍融3次，傳至第3代。所有細(xì)胞培養(yǎng)物置于-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 H基因擴(kuò)增

合成3對針對犬瘟熱病毒H基因的特異性引物：CDV4F/CDV4R、CDV5F/CDV5R和CDV6F/CDV6R(表1)，預(yù)期擴(kuò)增的目的片段長度分別為471、571、1 014 bp。以上引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。擴(kuò)增細(xì)胞培養(yǎng)物H基因，PCR反應(yīng)條件參考2.2。

2.5 同源性和遺傳進(jìn)化分析

在GenBank中下載不同基因型(Asia-1、Asia-2、America-1、America-2、Africa、Arctic like、Europe和European wildlife)的CDV參考毒株(35株)，應(yīng)用DNASTAR軟件中的MegAlign分析核苷酸序列，并比對這35株參考毒株和2株分離株的基因序列。使用BioEdit進(jìn)行Clustal同源性比較，并用MEGA-X軟件的Neighbor-joining(鄰位相連法)繪制遺傳進(jìn)化樹，Bootstrap設(shè)為1 000。

3 結(jié)果與分析

3.1 病理剖檢

剖檢發(fā)現(xiàn)，病死小熊貓胸腔內(nèi)肺部充血并伴有斑塊狀出血(圖1A)，肝臟腫大，心內(nèi)膜出血(圖1B)，胃腸黏膜腫脹、出血(圖1C)。

圖1 病死小熊貓出血病變

3.2 PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增后得到長度約455 bp的目的條帶(圖2)。PCR產(chǎn)物測序結(jié)果經(jīng)BLAST分析，2份血樣均為CDV陽性，測序確定為CDV基因片段。

圖2 小熊貓血樣PCR擴(kuò)增結(jié)果

3.3 CDV分離培養(yǎng)

接種病毒的Vero-CD150細(xì)胞，24 h后均出現(xiàn)圓縮、細(xì)胞顆粒增多、融合和聚集成多核巨細(xì)胞等細(xì)胞病變效應(yīng)(圖3A)，且部分細(xì)胞脫落、壞死。連續(xù)傳代后細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)穩(wěn)定產(chǎn)生，2個毒株分別命名為SZ2019CDV1H和SZ2019CDV2H。而未接種病毒的Vero-CD150細(xì)胞則無變化(圖3B)。

圖3 分離株的犬瘟熱病變(100×)

3.4 H基因的擴(kuò)增

用犬瘟熱病毒H基因的特異性引物對細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行H基因擴(kuò)增，擴(kuò)增出H基因的3段序列，電泳得到預(yù)期長度的目的條帶(圖4)，測序后拼接得到完整的H基因序列，總長度為1 824 bp。

圖4 細(xì)胞培養(yǎng)物中H基因3個片段的PCR產(chǎn)物

3.5 同源性分析

利用MegAlign軟件對已發(fā)表在NCBI上的其他35株CDV的H基因序列與本試驗(yàn)測得的2株CDV基因序列進(jìn)行比對。SZ2019CDV1H株與SZ2019CDV2H株的基因同源性為97.2%，兩毒株與標(biāo)準(zhǔn)European wildlife毒株Rockborn-Candur (GU266280.1)和Rockborn (GU810819.1)的同源性較高，全基因同源性達(dá)96.7%，但與America毒株同源性相對較低，特別是America-1疫苗株Snyder Hill (AF259552.1)，同源性分別僅為91.3%和91.0%(圖5)。

圖5 不同CDV毒株基因同源性

3.6 遺傳進(jìn)化樹分析

由圖6可以看出，小熊貓?jiān)碨Z2019CDV1H、SZ2019CDV2H株與其他35株代表毒株可分為8個遺傳系。從遺傳進(jìn)化樹分析，SZ2019CDV1H株與Africa毒株親緣關(guān)系較近，SZ2019CDV2H株與European wildlife毒株親緣關(guān)系較近，兩毒株均不與Convac、Vacc-Q和Vaccine等America-1疫苗毒株在同1個分支上，遺傳進(jìn)化距離相距甚遠(yuǎn)。

圖6 不同CDV毒株H基因核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

4 討論

根據(jù)小熊貓的臨床發(fā)病情況首先懷疑為犬瘟熱病毒感染，將臨床送檢的血樣進(jìn)行分子生物學(xué)檢測，在獲得陽性結(jié)果后分離和鑒定病毒，并對分離得到的病毒H基因擴(kuò)增和測序，以確定其遺傳譜系。近年來，國內(nèi)報(bào)道的引起犬[14-15]、東北虎(Pantheratigrisaltaica)[16]、水貂[17]和小熊貓[18-19]等野生動物高病死率的主要流行犬瘟熱遺傳系為Asia-1。經(jīng)同源性分析，本研究獲得的CDV分離株與Europe毒株同源性較高；但在遺傳進(jìn)化分析上，SZ2019CDV1H株與Africa毒株同處1個分支，SZ2019CDV2H株與European wildlife毒株同處1個分支，與常見Asia-1差距較大，與America-1疫苗株遺傳進(jìn)化距離最遠(yuǎn)。這說明CDV的遺傳演變存在不同的方向性，這對基因分型和演化關(guān)系分析可能會存在一定的干擾。

因目前還沒有小熊貓?jiān)葱缘娜翢嵋呙?，我國預(yù)防此病多用犬用弱毒苗，該苗對野生動物并不一定適用。在高強(qiáng)度的疫苗免疫壓力下，流行毒株發(fā)生變異，從而造成了市面上商品化的犬瘟熱弱毒疫苗對犬以外的物種免疫效果不佳[18]。

基因分型往往基于病毒所分離的地域[19]，而遺傳關(guān)系代表了毒株本身的變異程度。本研究在一次疫病暴發(fā)事件中分離得到了2種不同的基因型病毒，可以推斷病毒來源相對比較復(fù)雜，可能與動物的來源及病原體在動物園內(nèi)的散播有一定的聯(lián)系。由于數(shù)據(jù)和信息的缺乏，還不能確定此次疫病暴發(fā)的原因，但是這些復(fù)雜的病原學(xué)特征為臨床發(fā)病后的治療造成很大的困難。本研究中的數(shù)據(jù)和信息將為犬瘟熱病毒地方性流行毒株的分子流行病學(xué)調(diào)查提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，流行毒株遺傳系分析結(jié)果可為臨床篩選疫苗和治療提供一定參考。