適度紫外輻射增強對白鮮光合特性和藥用活性成分的影響

蘇宇航， 宋曉倩， 鄭晶文， 曹 夢， 張衷華*， 唐中華

( 1. 東北林業(yè)大學森林植物生態(tài)學教育部重點實驗室， 哈爾濱 150040； 2. 東北林業(yè)大學 化學化工與資源利用學院， 哈爾濱 150040 )

白鮮()是蕓香科多年生草本植物，白鮮皮是中醫(yī)臨床常用中藥和中國重要的大宗藥材(周亞福等，2013)，主要藥效物質為生物堿和檸檬苦素類化合物，是白鮮體內具有生物活性的一類次級代謝產(chǎn)物，其中最重要的為黃柏酮(CHO)、梣酮(CHO)、白鮮堿(CHNO)和檸檬苦素(CHO)4種(曹夢等，2018)，前2種是《中華人民共和國藥典》(2020版)規(guī)定的必檢測項，要求以干物質重計，黃柏酮含量不少于0.15%，梣酮含量不少于0.05%。白鮮主要藥效成分含量的多寡是決定白鮮質量的重要指標。雖然野生白鮮藥材的質量高，但是生長周期長，采收困難，大面積采收導致白鮮野生資源逐年減少(周亞福等，2013)。在日常生活中白鮮往往僅以根皮入藥，地上部分全部舍棄，造成資源的極大浪費(周亞福等，2013)。因此，提高白鮮資源的利用率和質量已經(jīng)成為當下亟須解決的問題。趙琳琳等(2020)發(fā)現(xiàn)部分地區(qū)的人工栽培白鮮藥用成分也達不到藥典要求，黃柏酮含量僅為0.10%，梣酮僅為0.033%。生產(chǎn)栽培條件以及環(huán)境因子等都會影響白鮮的品質。為提高藥材質量，利用環(huán)境因子對藥用植物的生長進行干擾從而調控其代謝途徑，已成為植物學研究的熱點，已有研究發(fā)現(xiàn)改變環(huán)境條件是提高白鮮次生代謝產(chǎn)物的有效途徑(杜程芳等，2005；劉雷等，2016)。所以，當下需要開展環(huán)境因子對白鮮藥用成分的影響研究，指導人工栽培通過環(huán)境因子誘導以提升白鮮藥用成分含量。

光不僅是植物光合作用所必需的環(huán)境因子，光照強度、光質等對植物發(fā)育均有影響(刑阿寶等，2018)，光還是影響植物初生代謝和次生代謝的主要環(huán)境因子之一，并調控植物多種代謝信號過程(Porto et al., 2020)。日光包括紫外、可見和紅外等波段，不同波長的光通過光合作用、激活受體和引起損傷等形式作用于植物(Christie & Briggs, 2001; Ahmad et al., 2002; Flint & Caldwell, 2003)。以往研究表明，紫外輻射對植物次生代謝物積累影響的范圍為10%～300%(Kakani et al., 2003)。高等植物進化出一系列避免紫外輻射損傷的防御機制，如莖葉表面形成蠟質或表皮毛，合成類黃酮、酚類等紫外吸收物質(Barnes et al., 2016; Valenta et al., 2020)，利用抗氧化系統(tǒng)和酶系統(tǒng)修復受損的DNA等(Bornman et al., 2015)。UV-A決定植物對UV-B的敏感性，光敏色素(phytochrome A)、隱花色素(cryptochromes)、向光素(phototropins)等藍光受體都能吸收一定的UV-A輻射(Krizek, 2004)，同時，UV-A對植物生長、生物量分配、酚類和類黃酮等次生代謝物合成也存在或正或負的效應(Valenta et al., 2020)。植物光合作用和藥用成分對輻射的響應取決于輻射強度、植物種類、環(huán)境條件等(岳向國等，2005)。李亞敏等(2005)研究發(fā)現(xiàn)浙貝母()在中劑量UV-B輻射下，生長狀況良好，生物堿含量顯著增加；付金穎等(2017)研究發(fā)現(xiàn)紫外輻射增強顯著提高了京尼平和黃酮等次生代謝產(chǎn)物含量。適量強度的UV-B輻射可以促進多種藥用活性成分的積累，如黃酮類化合物(flavonoids)、生物堿(alkaloids)、萜類(terpenoids)等(Zhang & Bj?rn, 2009)。

目前，紫外LED技術以及生境適宜性分析技術的發(fā)展，使光質定向誘導藥用活性成分積累具備了田間生產(chǎn)的可行性，但具體的控制參數(shù)仍然匱乏。就目前國內市場而言，人工栽培植物藥效遠低于野生植物，通過光質定向誘導解決這一關鍵難題，對于保護野生植物資源意義重大。因此，為提高人工栽培白鮮藥用成分的含量，本文以兩年生白鮮為研究對象，在不同紫外輻射強度下進行栽培試驗，探索白鮮光合特性和4種主要活性成分對短期紫外輻射增強的響應情況，擬探討以下問題：(1)在短期不同紫外輻射條件下，白鮮是否受損；(2)白鮮的利用率是否提高；(3)白鮮各器官藥用成分對紫外輻射的響應如何。以期揭示紫外輻射對藥用成分積累的影響，為白鮮優(yōu)質栽培及產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和處理條件

試驗選擇150株長勢一致的兩年生白鮮盆栽植株，林下黑土作為培養(yǎng)基質，每盆定植3株，平均分成5組，每組30株。

在人工氣候箱內用白色LED光源(惠州雷士光電科技有限公司)進行預培養(yǎng)，光照強度為400 μmol·m·s，光照時間10 h·d，預培養(yǎng)至白鮮植株具有4片完全伸展的葉片，預培養(yǎng)后設置5種不同光照處理組，具體如下：

(1)以與預處理相同的光照強度和光周期作為對照組(CK)；

(2)CK組光照基礎上增加2 W·mUV-A輻射作為低劑量UV-A輻射增強組(UVAL)；

(3)CK組光照基礎上增加4 W·mUV-A輻射作為中劑量UV-A輻射增強組(UVAM)；

(4) CK組光照基礎上增加0.25 W·mUV-B輻射作為低劑量UV-B輻射增強組(UVBL)；

(5) CK組光照基礎上增加0.50 W·mUV-B輻射作為中劑量UV-B輻射增強組(UVBM)。

上述紫外輻射強度通過前期的預試驗摸索確定，以不存在明顯的葉灼傷為中劑量輻射，低劑量輻射減半，具體強度通過調節(jié)植株與紫外LED光源之間的距離獲得。UV-B LED光源生產(chǎn)商為北京電光源研究所，強度為36 W；UV-A LED光源生產(chǎn)商為東莞市森夏電子科技有限公司，強度為40 W。為了降低UV-B長時間輻射對白鮮損傷的積累效應采取間歇輻射方式，每30 min輻射15 min，一天總UV-B輻射時間為2 h；UV-A輻射周期與可見光光周期一致，為10 h·d。

處理期2 d補充一次土壤水分使其達到最大含水量，此含水量可以保證2 d內不會出現(xiàn)植物水分抑制，光合作用測定和藥用活性成分分析在處理滿7 d時進行。

1.2 光合作用測定

處理7 d 后，在一個晴天上午8:00—10:00，隨機選擇長勢良好的葉片，從莖尖開始選擇第一片完全展開的一致葉位葉片進行光合作用測定，葉片不經(jīng)過暗適應，在測定過程中氣溫為25 ℃，相對濕度為60%，CO濃度為400 μmol·mol，采用Li-6400便攜式光合測定系統(tǒng)(Li-Cor, USA)進行光響應曲線測定，光輻射強度(PAR)設置為2 000、1 600、1 200、800、600、200、100、0 μmol·m·s，測定時光強由強到弱，每個光照強度梯度下平衡5 min左右，測定指標包括凈光合速率()、呼吸速率()、蒸騰速率()，每片葉子重復測5次，取其平均值，用于統(tǒng)計分析。

光響應曲線擬合模型為指數(shù)函數(shù)模型： =max(1-e-max)-[指數(shù)模型是沒有極值的函數(shù)，要對飽和光強進行估算。參照王滿蓮等(2006)的方法，假設光合速率為0.9max或0.99max所對應的光強為飽和光強。α=0.05，max=20，=1]。

葉綠素熒光特性采用PAM-2000便攜式調制葉綠素熒光儀(Walz, German)測定，葉片暗適應20 min，依次測定最小熒光產(chǎn)量、最大熒光產(chǎn)量、任意時間實際熒光產(chǎn)量，按照順序依次測定600 μmol·m·s光強下的光下熒光′、最大熒光′和最小熒光′，并依據(jù)便攜式調制葉綠素熒光儀系統(tǒng)自帶公式計算光系統(tǒng)Ⅱ(PS Ⅱ)最大光合量子產(chǎn)量(/)、PS Ⅱ實際光合量子產(chǎn)量(Ⅱ)、非光化學淬滅系數(shù)()、光化學淬滅系數(shù)()、基于“湖泊模型”光化學淬滅系數(shù)()、非調節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量()、調節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量()，具體公式如下：

=(-)；

(Ⅱ)=(′-′)′；

=(-′)′；

=(′-)/(′-′)；

=×(′′)；

()=1-(Ⅱ)-()。

1.3 活性成分含量檢測

處理7 d后，每組取10株樣品進行測試，分出根、莖和葉后分別加入8 mL甲醇研磨，超聲提取1 h(功率100 W，頻率40 kHz，溫度40 ℃)，8 000 r·min離心10 min，抽取上清液在40 ℃下利用真空旋轉蒸發(fā)儀濃縮揮干，揮干后用色譜級甲醇復溶到2 mL，再次8 000 r·min離心10 min，取上清，密封后-20 ℃保存用于色譜分析。

黃柏酮、梣酮、白鮮堿和檸檬苦素含量參照曹夢等(2018)建立的方法，色譜儀為e2695-2998液相檢測系統(tǒng)(Waters, USA)，Waters SymmetryC色譜柱(4.6 mm × 250 mm, 5 μm, waters)；流動相為乙腈(A)和超純水(B)，梯度洗脫(0～20 min，45.0%～55.0%A)，流速為1.0 mL·min，柱溫為35 ℃，進樣量為10 μL，檢測波長為210 nm和236 nm。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用R 4.1.2中ggsignif包進行分組差異顯著性分析和檢驗，明確不同處理組之間光合作用特性、藥用活性成分含量之間差異是否具有統(tǒng)計學意義；繪圖使用ggplot2包。

2 結果與分析

2.1 短期紫外輻射增強對白鮮光合特性的影響

短期UV-A和UV-B輻射增強對白鮮光合特性的影響具有顯著差異(圖1)。UVAL組的/顯著提高，UVBL和UVBM組則顯著降低，各處理組間(Ⅱ)、()、和差異均不顯著。UVBL和UVBM組對光合量子產(chǎn)量的影響，主要表現(xiàn)為()顯著增加。

盡管UV-A處理提高了，但與CK相比，差異并不顯著；UVBM處理對有顯著的抑制作用；在方面，各處理組間差異不顯著；UVAM處理顯著提高了。

2.2 短期紫外輻射增強對白鮮活性成分積累的影響

不同紫外光質和光強輻射對白鮮根、莖和葉中黃柏酮、梣酮、白鮮堿和檸檬苦素含量影響存在差異(圖2、圖3、圖4)。UVAM和UVBL對根中黃柏酮含量具有顯著提升作用，UVAM和UVBL分別是CK的1.61、1.54倍。梣酮則是UVBM、UVBL和UVAM組誘導效果好，平均為CK的1.5倍。UVAM、UVBL、UVBM對檸檬苦素的誘導積累效果顯著，分別是CK的1.61、1.54、1.16倍。UVAL和UVAM對根中白鮮堿有顯著誘導積累作用，UVAL誘導白鮮堿為CK的1.56倍。

**和*分別表示在0.01和0.05水平上存在顯著差異; NS表示沒有顯著差異。CK. 對照白色LED光; UVAL. CK+2 W·m-2 UV-A輻射; UVAM. CK+4 W·m-2 UV-A輻射; UVBL. CK+0.25 W·m-2 UV-B輻射; UVBM. CK+0.50 W·m-2 UV-B輻射。圖中的黑點代表離群值。下同。** and * indicate significant differences at 0.01 and 0.05 levels, respectively; NS indicates no significant differences. CK. The white LED light; UVAL. CK+2 W·m-2 UV-A radiation; UVAM. CK+4 W·m-2 UV-A radiation; UVBL. CK+0.25 W·m-2 UV-B radiation; UVBM. CK+0.50 W·m-2 UV-B radiation. The black dots in the figure represent outliers. The same below.圖 1 短期紫外輻射增強對白鮮光合特性的影響Fig. 1 Effects of short-term enhanced ultraviolet radiation on photosynthesis characteristics of Dictamnus dasycarpus

圖 2 短期紫外輻射增強對白鮮根中4種活性成分的影響Fig. 2 Effects of short-term enhanced ultraviolet radiation on four active ingredients in Dictamnus dasycarpus roots

圖 3 短期紫外輻射增強對白鮮莖中4種活性成分的影響Fig. 3 Effects of short-term enhanced ultraviolet radiation on four active ingredients in Dictamnus dasycarpus stems

圖 4 短期紫外輻射增強對白鮮葉中4種活性成分的影響Fig. 4 Effects of short-term enhanced ultraviolet radiation on four active ingredients in Dictamnus dasycarpus leaves

紫外增強對白鮮根中4種關鍵活性成分總含量均有明顯影響，UVAM處理組最高，活性成分含量達到3.86 mg·g，其中檸檬苦素含量提升了1.46倍，白鮮堿含量提升了1.5倍左右。就藥典必測成分黃柏酮和梣酮而言，黃柏酮得到了最大提升，梣酮提升了1.5倍以上，其次是UVBL處理組，活性成分含量達3.61 mg·g，UVBM和UVAL處理組較低，分別為3.19、2.94 mg·g，CK為2.56 mg·g，相對于CK，各處理組總含量最高提升了51%。

白鮮莖中白鮮堿、梣酮、黃柏酮類和檸檬苦素含量相對較低(圖3)，除UVAM顯著促進白鮮堿含量外，其他處理對莖中4種主要活性成分含量均無顯著影響。

4種紫外輻射增強處理，對白鮮葉中黃柏酮、白鮮堿和檸檬苦素含量的影響均不顯著，僅梣酮含量受UVBL影響，存在明顯的誘導積累作用(圖4)。

3 討論

PSⅡ最大光化學量子產(chǎn)量(/)是各種環(huán)境脅迫下衡量PS Ⅱ活性的重要參數(shù)，可以反映植物受傷害的程度(Zhang & Scheller, 2004)，非脅迫條件下植物/一般在0.75～0.85之間(Kitajima & Butler, 1975; Genty et al., 1989)。研究發(fā)現(xiàn)當/<0.75時，植物所受到的損傷是不可逆的，而/<0.44時，PS Ⅱ 反應中心失去活性(Schansker & Rensen, 1999)。本研究發(fā)現(xiàn)，在UV-A中劑量和較低劑量輻射條件下，白鮮葉片/均穩(wěn)定在0.8以上，說明其并沒有受到UV-A紫外脅迫的影響；而在低劑量和中劑量UV-B輻射條件下，白鮮葉片/則顯著降低，表明PS Ⅱ光破壞的發(fā)生，但是其最低值為0.76，說明其光合能力在UV-B輻射下雖受到影響，但影響是可逆的，短期4種紫外輻射增強并沒有對白鮮造成不可逆的傷害。當光化學能量轉換和保護性的調節(jié)機制不足以將過剩光能完全消耗掉時，會引起PS Ⅱ光抑制， 而植物葉片可以通過PS Ⅱ的光破壞防御機制減小光抑制造成的負面影響(Pascal et al., 2005)。植物光合機構通過葉黃素循環(huán)的能量耗散(Demmig-Adams & Adams, 1992)、光呼吸作用(Osmond & Grace, 1995)、Mehler反應(Flexas et al., 1999)等途徑緩解光抑制。而本研究發(fā)現(xiàn)不同紫外輻射下白鮮的能量分配策略不同，UV-A輻射下，隨著輻射強度的增加，()、(Ⅱ)和()均保持穩(wěn)定狀態(tài)，UV-B輻射下，白鮮()顯著增加，表明白鮮用于非化學反應的能量增加(Kramer et al., 2004)，光系統(tǒng)趨于受損(Goss & Jakob, 2010; Jahns & Holzwarth, 2012)，盡管可能還未受到損傷，但繼續(xù)紫外照射白鮮將會受損。()表示的是電子傳遞到PS Ⅱ以后既不參與光化學反應，也不以葉黃素循環(huán)介導的調節(jié)性的熱量耗散，而是以光呼吸、Mehler 反應等形式進行耗散或者是將電子傳遞給氧參與活性氧形成(Wang et al., 2009)，表明白鮮可以通過自我調節(jié)提高()，因此來提升光合系統(tǒng)的非光化學效率使自身不受傷害。本研究還發(fā)現(xiàn)所有處理并沒有改變白鮮和，其中可以反映植物對光能的轉化能力(Kramer et al., 2004)，反映的是PS Ⅱ天線色素吸收的光能不能用于光合電子傳遞而以熱的形式耗散掉的光能部分，是一種植物對光合機構的自我保護機制(Kramer et al., 2004)，說明白鮮通過提高()使PS Ⅱ反應中心電子傳遞活性恢復正常狀態(tài)。

植物次生代謝產(chǎn)物因生長環(huán)境不同而有所差異(李彥等，2012)，調節(jié)紫外輻射強度可以提高植物體內某些具有重要藥用價值的次生代謝物質含量(吳洋等，2012)。白鮮主要活性成分中，白鮮堿屬于生物堿，黃柏桐、檸檬苦素、梣酮都屬于檸檬苦素類化合物(曹夢，2019)，檸檬苦素類化合物是一類高度氧化的四降三萜類化合物，其中梣酮為降解性檸檬苦素類化合物，黃柏桐與檸檬苦素是檸檬苦素苷元類化合物。本研究發(fā)現(xiàn)，中劑量UV-A和低劑量UV-B對黃柏桐、檸檬苦素、梣酮的誘導效果強烈，紫外輻射促進了三萜的合成，進而影響白鮮體內萜類化合物的含量，黃柏桐與檸檬苦素在梣酮合成的上游(曹夢，2019)，推測可能是紫外輻射促進了黃柏桐與檸檬苦素的合成，從而使梣酮含量增加。紫外輻射主要通過改變甲羥戊酸途徑(MVA)和2-甲基赤蘚糖-4-磷酸途徑(MEP)上相關酶基因的表達量控制白鮮體內這三類檸檬苦素類化合物的合成。當前，關于白鮮的代謝途徑的研究較少，且并不十分明確，白鮮活性成分響應紫外輻射的作用機理還需進一步研究。

已有研究證實白鮮活性物質在葉和莖中合成，在根中積累(周亞福等，2017)，所以本研究中白鮮根中活性成分含量顯著高于莖、葉活性成分含量，與毛少利等(2015)研究結果一致。本研究中劑量UV-A輻射顯著促進莖中白鮮堿積累，低劑量UV-B輻射顯著促進葉中梣酮積累，提高白鮮植物莖和葉的利用效率。而白鮮活性成分的質量分數(shù)隨生長年限的增加而增加(劉麗娟等，2015)，本研究以兩年生白鮮為對象，紫外輻射處理后白鮮藥用成分含量提升了1.5倍，預期對成株處理時，能夠較容易地將人工栽培白鮮品質提升到藥典規(guī)定標準以上，具有較好的開發(fā)利用前景，為白鮮今后高效生產(chǎn)有效藥用成分和可持續(xù)發(fā)展提供了理論基礎。

4 結論

本試驗通過短期、適度增強UV-A和UV-B輻射研究了白鮮堿、黃柏酮、梣酮和檸檬苦素4種藥用活性成分的誘導積累效應。結果表明，在試驗條件下，白鮮可以通過自我調節(jié)，提升PS Ⅱ的非光化學效率使自身不受傷害，且適度增強紫外輻射可以提高藥用活性成分含量，白鮮根中活性成分含量最高，其中中劑量UV-A輻射和低劑量UV-B輻射對4種活性成分誘導效果比較明顯。因此，在田間生產(chǎn)中，可以在采收一周前進行相應的紫外輻射處理，不僅能提升根中活性成分含量，還能提高對莖和葉的利用效率，以達到人工栽培白鮮關鍵活性成分含量躍升的目標，對促進白鮮資源的可持續(xù)利用具有重要意義。