基于UPLC-MS/MS的不同產(chǎn)地金觀音紅茶代謝組學(xué)分析

林潔鑫，顏廷宇，邵淑賢，王鵬杰，葉乃興，金 珊，吳芹瑤，鄭德勇，楊江帆

(1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院/茶學(xué)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)材料工程學(xué)院，福建福州 350002；3.福建商學(xué)院，福建福州 350002)

紅茶是我國六大茶類之一，屬于全發(fā)酵茶，由于其獨(dú)特的滋味和香氣成為世界上消費(fèi)量最大的茶類。福建是紅茶的發(fā)明地，其主產(chǎn)區(qū)分布在閩東和閩中一帶，由于茶葉的品質(zhì)與生長環(huán)境密切相關(guān)，使得不同產(chǎn)地的紅茶具有特定的品質(zhì)特征。隨著人們生活水平提高，消費(fèi)者對(duì)確認(rèn)茶產(chǎn)品原產(chǎn)地的需求明顯增加，目前常用的茶葉感官審評(píng)方法，不僅其結(jié)果易受多種因素影響，也很難以據(jù)此判別茶葉的產(chǎn)地。因此，從保護(hù)消費(fèi)者利益與福建茶葉區(qū)域品牌建設(shè)的需要出發(fā)，探究一種客觀、科學(xué)的茶葉產(chǎn)地與品質(zhì)鑒別技術(shù)十分必要。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)、近紅外光譜(NRIS)、穩(wěn)定性同位素(IRMS)、礦物質(zhì)元素測(cè)定等檢測(cè)技術(shù)在鑒定食品的產(chǎn)地與品質(zhì)方面取得一定成功，國內(nèi)外學(xué)者開始將此類技術(shù)手段引入到茶葉的產(chǎn)地判別與品質(zhì)鑒別研究中，并取得了重要進(jìn)展。代謝組學(xué)作為一門新興綜合性技術(shù)，通過高通量檢測(cè)和多元數(shù)據(jù)處理方法將樣品檢測(cè)的全部信息系統(tǒng)性整合起來，具有耗時(shí)短、準(zhǔn)確度高和廣覆蓋的特點(diǎn)，能夠在定性定量檢測(cè)樣品中小分子代謝產(chǎn)物的基礎(chǔ)上，提取出與樣品的品質(zhì)或(和)產(chǎn)地關(guān)聯(lián)的關(guān)鍵信息，達(dá)到更全面、準(zhǔn)確鑒別的目的。徐春暉等利用非靶向代謝組學(xué)分析方法結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析對(duì)3種江西名茶品質(zhì)構(gòu)建預(yù)測(cè)模型，準(zhǔn)確度可達(dá)100%，且3種茶葉的代謝物存在較大差異。鄭起帆等采用核磁共振氫譜技術(shù)(H-NMR)結(jié)合判別分析能較準(zhǔn)確地對(duì)不同茶山普洱生茶進(jìn)行分類，發(fā)現(xiàn)纈氨酸、綠原酸、奎尼酸等代謝物對(duì)不同茶山分型貢獻(xiàn)較大。王春波等利用超高效液相色譜-四級(jí)桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)和多元統(tǒng)計(jì)方法成功區(qū)分貴州3個(gè)不同產(chǎn)區(qū)都勻毛尖，并且篩選出6種差異顯著的產(chǎn)地標(biāo)志物。目前關(guān)于不同產(chǎn)地紅茶的代謝組學(xué)研究仍較為欠缺。

筆者所在課題組曾利用代謝組學(xué)技術(shù)研究了福云6號(hào)制成的紅茶，顯著區(qū)分了紅茶的產(chǎn)地，并發(fā)現(xiàn)氨基酸和黃酮類物質(zhì)對(duì)產(chǎn)于福建省福安市和尤溪縣的紅茶滋味品質(zhì)間的差異具有重要貢獻(xiàn)。由于不同產(chǎn)地紅茶的滋味品質(zhì)是受各種因素綜合影響的，為了更全面地比較分析2地紅茶品質(zhì)的差異，進(jìn)一步以金觀音單一品種制成的紅茶為研究對(duì)象，采用廣泛靶向代謝組學(xué)技術(shù)結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)方法篩選差異代謝物進(jìn)而區(qū)分不同產(chǎn)地的紅茶，分析形成紅茶滋味品質(zhì)差異的可能原因，以期為福建紅茶的品質(zhì)評(píng)價(jià)、產(chǎn)地鑒別及溯源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料共23份，于2020年3月分別收集自福建省尤溪縣的坂面鎮(zhèn)、臺(tái)溪鄉(xiāng)，以及福安市的城陽鎮(zhèn)、上白石鎮(zhèn)、社口鎮(zhèn)、松羅鄉(xiāng)；其中產(chǎn)自尤溪縣的紅茶有13份，產(chǎn)自福安市的紅茶有10份，全部茶樣均是金觀音單一品種制成的成品紅茶，且等級(jí)相似。參照GB/T 23776—2018茶葉感官審評(píng)方法，由6名高級(jí)評(píng)茶員對(duì)23份茶樣的滋味進(jìn)行評(píng)價(jià)與評(píng)分，最后從2個(gè)產(chǎn)地各篩選出1份具有代表性的茶樣進(jìn)行后續(xù)的代謝組學(xué)分析，試驗(yàn)所用茶樣具體信息見表1。

表1 紅茶樣品信息

1.2 樣品制備方法

將樣品放入5 mL離心管，置于凍干機(jī)中真空冷凍干燥，用30 Hz的研磨儀研磨約1.5 min，再稱取100 mg樣品粉末，用1.2 mL 70%的甲醇水溶液溶解，每30 min渦旋提取30 s、重復(fù)6次后置于4 ℃冰箱過夜；經(jīng)12 000 r/min離心10 min，吸取上清液，使用0.22 μm濾膜過濾并儲(chǔ)存于進(jìn)樣瓶中，2個(gè)產(chǎn)地的紅茶樣品，分別重復(fù)取樣3次、制備后進(jìn)行UPLC-MS/MS分析。

1.3 液相色譜條件

色譜柱：Agilent SB-C(1.8 μm，2.1 mm×100 mm)；流動(dòng)相：A相為超純水(含0.1%甲酸)，B相為乙腈(含0.1%甲酸)；洗脫梯度：B相比例為5%→95%，時(shí)間0.00～9.00 min；B相比例95%維持9～10 min；B相比例95%→5%，時(shí)間10.00～11.10 min；B相比例降為5%平衡至14 min；柱溫 40 ℃；進(jìn)樣量4 μL；流速0.35 mL/min。

1.4 質(zhì)譜條件

利用電噴霧離子源(ESI)進(jìn)行海量數(shù)據(jù)采集，溫度為550 ℃，離子噴霧電壓(IS)5 500 V(正離子模式)/-4 500 V(負(fù)離子模式)。在三重四級(jí)桿(QQQ)中，每個(gè)離子對(duì)根據(jù)優(yōu)化的去簇電壓(DP)和碰撞能(CE)進(jìn)行掃描檢測(cè)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

通過比較色譜保留時(shí)間、離子碎片值和相對(duì)豐度，并采用邁維(武漢)生物技術(shù)有限公司自建數(shù)據(jù)庫和公共數(shù)據(jù)庫對(duì)代謝物進(jìn)行鑒定。利用三重四級(jí)桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)對(duì)代謝物進(jìn)行定量，獲得樣品的代謝物質(zhì)譜數(shù)據(jù)并對(duì)其進(jìn)行峰面積積分以及校正。采用R軟件(https：//www.r-project.org/)對(duì)鑒定的代謝產(chǎn)物進(jìn)行PCA分析和OPLS-DA分析，利用OPLS-DA模型獲得的VIP值評(píng)分，根據(jù)VIP≥1、fold change≥2或fold change≤0.5進(jìn)行顯著差異代謝物(SCMs)的篩選，同時(shí)通過代謝通路KEGG Pathways進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)地紅茶代謝組學(xué)分析與代謝物的多元統(tǒng)計(jì)

利用廣泛靶向代謝組學(xué)技術(shù)，在尤溪紅茶、福安紅茶中共檢測(cè)到936種代謝物，PCA分析和OPLS-DA分析顯示，不同產(chǎn)地紅茶的代謝物能夠明顯分離(圖1-A、圖1-B)。根據(jù)OPLS-DA分析得到的VIP值(VIP≥1)和FC值(fold change≥2或fold change≤0.5)篩選差異代謝物，共篩選出96種顯著差異代謝物?；鹕綀D(圖1-C)顯示，上調(diào)的代謝物有50種，即尤溪紅茶相對(duì)含量較高的差異代謝物有50種；下調(diào)的代謝物有46種，即福安紅茶相對(duì)含量較高的差異代謝物有46種。這些差異代謝物大致可分為11類，包括氨基酸及其衍生物、酚酸類、核苷酸及其衍生物、黃酮類、生物堿、脂質(zhì)和有機(jī)酸等(圖1-D)，其中黃酮類、鞣質(zhì)和脂質(zhì)在尤溪紅茶中的相對(duì)含量更高，氨基酸及其衍生物、生物堿和有機(jī)酸在福安紅茶中的相對(duì)含量更高。

2.2 不同產(chǎn)地紅茶差異性代謝產(chǎn)物

2.2.1 主要差異代謝物 將差異代謝物的FC值進(jìn)行l(wèi)og處理，得到差異變化在前20的差異表達(dá)代謝物(圖2)。與福安紅茶相比，尤溪紅茶有4種黃酮類[楊梅素-3--(6″-丙二酰)葡萄糖苷、7，4′-二--沒食子?；乩S烷、楊梅素、圣草酚]，2種有機(jī)酸(2-甲基戊二酸、己二酸)，1種核苷酸及其衍生物(2′-脫氧腺苷)，1種酚酸類(綠原酸)和1種香豆素(7-甲氧基-5-異戊烯基氧基香豆素)的相對(duì)含量顯著高于福安紅茶；3種酚酸類(二氫咖啡酸、1，3，5-苯三酚、甲基丁香酚)，2種氨基酸及其衍生物(-乙酰--苯丙氨酸、--乙?；?-鳥氨酸)，2種核苷酸及其衍生物(-墨喋呤、環(huán)二-3′，5′-腺嘌呤核苷酸)，1種有機(jī)酸(馬來酸)和2種其他類(4-甲基-5-噻唑乙醇、香草醇苷)的相對(duì)含量明顯低于福安紅茶。結(jié)果表明，尤溪紅茶中相對(duì)含量較高的主要差異代謝物是黃酮類代謝物，而福安紅茶中的則是酚酸類代謝物。黃酮類和酚酸類均屬于多酚類物質(zhì)，而多酚類物質(zhì)的積累有利于形成醇厚鮮爽的滋味口感，由此可以推測(cè)，黃酮類和酚酸類物質(zhì)在2個(gè)產(chǎn)地紅茶滋味風(fēng)格的差異上有一定的貢獻(xiàn)。

2.2.2 主要差異代謝物熱圖 為了更直觀地觀察尤溪紅茶、福安紅茶差異代謝物之間的變化，我們得到了96種差異代謝物的熱圖(圖3)，其中有6種氨基酸及其衍生物、7種核苷酸及其衍生物、18種黃酮類、5種鞣質(zhì)、24種酚酸類、11種生物堿、11種有機(jī)酸、4種木脂素和香豆素、1種萜類、5種脂質(zhì)和4種其他類物質(zhì)。

游離氨基酸是茶葉中具有生物活性和味覺活性的物質(zhì)，可賦予茶湯復(fù)雜的口感，如鮮味、甜味和苦味等，是影響紅茶風(fēng)味的重要因素。根據(jù)VIP值和FC值結(jié)果，發(fā)現(xiàn)2個(gè)產(chǎn)地紅茶差異代謝物中 5-氧化脯氨酸、-丙酰甘氨酸、-天冬酰胺、--乙?；?-鳥氨酸、-乙酰--苯丙氨酸和-單甲基--精氨酸等6種氨基酸及其衍生物存在顯著差異，且福安紅茶中的含量都明顯高于尤溪紅茶，其中呈鮮味的-天冬酰胺的含量是尤溪紅茶的2.3倍，這可能是由于2個(gè)產(chǎn)地地理位置的差異造成太陽光照強(qiáng)度不同引起的，與Ji等的研究結(jié)果一致。有研究發(fā)現(xiàn)，嘌呤類的核苷酸會(huì)呈現(xiàn)鮮味，雖然這種呈味核苷酸自身的鮮味較弱，但對(duì)茶湯滋味中的甜味、鮮味以及醇厚感起到一定的增強(qiáng)效果。從圖3可以看出，福安紅茶中的呈味核苷酸環(huán)二-3′，5′-腺嘌呤核苷酸和煙酸腺嘌呤二核苷酸的含量分別上調(diào)7.8倍和下調(diào)50%，所以認(rèn)為呈味核苷酸可能會(huì)促進(jìn)紅茶鮮味的呈現(xiàn)，這與2個(gè)產(chǎn)地紅茶的感官審評(píng)結(jié)果相似。

多酚類物質(zhì)包括黃烷醇類、酚酸類和黃酮醇類等，是紅茶中苦澀味和收斂性的主要成分。由圖3可知，與福安紅茶相比，尤溪紅茶中相對(duì)含量較高的黃酮類代謝物有18種，增幅由大至小依次為楊梅素-3--(6″-丙二酰)葡萄糖苷、7，4′-二--沒食子?；乩S烷、楊梅素、圣草酚、槲皮素-3--(6″-沒食子酰)半乳糖苷、丁香亭、楊梅素-3--蕓香糖苷、表兒茶素、楊梅素-3--半乳糖苷-3′--鼠李糖苷、3，3′，4′，5，5′，7-六羥基黃酮、二氫槲皮素、楊梅素-3--葡萄糖苷、槲皮素-3--(6″-乙酰)半乳糖苷、3，3′，4′，5，7-五羥基黃烷(4→8)-3，3′，4′，5，7-五羥基黃烷、沒食子兒茶素、3，3′，4′，5，7-五羥基黃烷-(4→6)-3，3′，4′，5，7-五羥基黃烷、芹菜素-7--蕓香糖苷和5，7，3′，4′，5’-五羥基黃烷，其中非酯型兒茶素沒食子兒茶素和表兒茶素分別顯著上調(diào)2.1倍和2.4倍，這可能是由于2個(gè)產(chǎn)地地理區(qū)域的差異形成的。尤溪紅茶中有6種黃酮醇類含量明顯高于福安紅茶，其中楊梅素含量顯著上調(diào)3.5倍，相關(guān)研究表明，高海拔低緯度的區(qū)域，有利于合成較多的黃酮類化合物，其中黃酮醇類物質(zhì)與茶湯滋味的厚度和鮮味呈反比，這有助于說明尤溪紅茶中黃酮醇類代謝物含量更高的原因。

生物堿的主要成分為咖啡堿、茶堿和可可堿等，與茶湯的典型苦味密切相關(guān)，容易與兒茶素形成氫鍵絡(luò)合物，提高茶湯滋味的鮮爽度和醇度，而在尤溪紅茶、福安紅茶中鑒定到的11種生物堿中，有9種生物堿(2-苯乙胺、異喹啉、-乙酰腐胺、色胺、吲哚-3-乙酸、1-甲氧基吲哚-3-甲醛、茶堿、乙酰色胺和二氫咖啡酰腐胺等)的含量在福安紅茶中更高，其中茶堿的含量是尤溪紅茶的2.3倍，所以這些生物堿在一定程度上會(huì)影響福安紅茶的滋味特征。從圖3可以看出，在鑒定到的有機(jī)酸代謝物中，大部分在福安紅茶中顯著累積，馬來酸累積最高，明顯上調(diào)3.5倍。除此之外，福安紅茶中的2種溶血磷脂酰乙醇胺和1種溶血磷脂酰膽堿含量明顯高于尤溪紅茶，Li等研究已證實(shí)，磷脂的顯著降解與綠茶香氣的形成有重要關(guān)系，因此這3種磷脂降解產(chǎn)物可能對(duì)紅茶香氣的形成有一定的影響。

2.3 不同產(chǎn)地紅茶差異代謝物通路

通過KEGG通路分析，共鑒定出41條代謝通路，被KEGG注釋到的具有明顯差異的代謝物個(gè)數(shù)為40個(gè)，其中有15個(gè)差異代謝物在尤溪紅茶中相對(duì)含量較高，25個(gè)差異代謝物在福安紅茶中相對(duì)含量較高，主要分布在20條代謝通路中(圖4)，其中顯著富集(值<0.05)的通路為苯丙氨酸代謝通路(Phenylalanine metabolism)和黃酮類生物合成通路(Flavonoid biosynthesis)，從一定程度上可以認(rèn)為，這2條代謝通路對(duì)于不同產(chǎn)地紅茶的滋味品質(zhì)具有重要意義，這與Wu等的研究結(jié)果相符，說明代謝通路中涉及到的差異代謝物可以作為區(qū)分2個(gè)產(chǎn)地紅茶品質(zhì)差異的重要依據(jù)。

研究結(jié)果表明，苯丙氨酸代謝通路富集了苯丙酮酸、2-羥基苯乙酸、2-苯乙胺、-乙酰--苯丙氨酸和2-苯乙醇等5種明顯差異的代謝成分，黃酮類生物合成通路富集了圣草酚、表兒茶素、楊梅素、沒食子兒茶素、二氫槲皮素和綠原酸等6種明顯差異的代謝成分，從相對(duì)豐度(圖5)可以看出，苯丙氨酸代謝通路中的5種差異代謝物在福安紅茶中的相對(duì)含量更高，其中-乙酰--苯丙氨酸上調(diào)3.5倍、2-苯乙胺上調(diào)2.6倍，2-苯乙胺作為一種神經(jīng)遞質(zhì)，可以提高細(xì)胞外液中多巴胺的水平，具有使人感到身心愉悅的效果；與此相反，黃酮類生物合成通路中的6種差異代謝物則在尤溪紅茶的相對(duì)含量更高，其中圣草酚、綠原酸含量較高，分別上調(diào)了3.3、3.0倍，綠原酸在茶湯中呈苦澀味，會(huì)隨著濃度的增加而增強(qiáng)。由此可見，苯丙氨酸代謝通路和黃酮類生物合成通路作為關(guān)鍵通路，在不同產(chǎn)地紅茶的品質(zhì)差異中起主要作用。

3 討論與結(jié)論

紅茶獨(dú)特的滋味和香氣是由多種呈味成分協(xié)同作用的結(jié)果，而差異代謝物賦予了不同產(chǎn)地紅茶的品質(zhì)特征。相關(guān)研究認(rèn)為，氨基酸和黃酮類差異代謝物可能是形成由福云6號(hào)品種制成的不同產(chǎn)地紅茶滋味品質(zhì)差異的原因，其中紫云英苷、表兒茶素、-谷氨酰胺、-天冬氨酸、-賴氨酸、-色氨酸、-谷氨酸、綠原酸、苯乙胺和牡荊素-2″--鼠李糖苷等差異代謝產(chǎn)物具有重要貢獻(xiàn)。

在此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步探究不同產(chǎn)地金觀音紅茶代謝產(chǎn)物的差異，共篩選出96種明顯差異代謝物，其中氨基酸及其衍生物(-天冬酰胺、-乙酰--苯丙氨酸等)、生物堿(茶堿、2-苯乙胺等)、酚酸類(二氫咖啡酸、甲基丁香酚等)等代謝物的相對(duì)含量在福安紅茶中較高，黃酮類(楊梅素、圣草酚、丁香亭、表兒茶素等)代謝物的相對(duì)含量在尤溪紅茶中較高，因此認(rèn)為這些明顯差異代謝物對(duì)不同產(chǎn)地紅茶滋味品質(zhì)差異的形成具有重要意義；苯丙氨酸代謝通路、黃酮類生物合成通路作為關(guān)鍵通路，在不同產(chǎn)地紅茶的代謝差異中起重要作用，其中苯丙酮酸、2-羥基苯乙酸、2-苯乙胺、-乙酰--苯丙氨酸、2-苯乙醇、圣草酚、表兒茶素、楊梅素、沒食子兒茶素、二氫槲皮素和綠原酸等可以作為區(qū)分不同產(chǎn)地紅茶的重要依據(jù)。運(yùn)用本研究結(jié)果，進(jìn)一步探明了福安紅茶、尤溪紅茶品質(zhì)特征差異的代謝物基礎(chǔ)，可為福建省福安市、尤溪縣今后紅茶產(chǎn)品開發(fā)和生產(chǎn)提供參考依據(jù)。