8種中草藥材提取物體外抗人肺炎支原體活性研究

柴 琳，張 俊，李 萌，趙若蓮，劉榮均，李云芬

（云南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，云南 昆明 650011）

肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae，MP）是一種主要引起上、下呼吸道感染的病原體［1-2］，可以導(dǎo)致呼吸道感染、支氣管炎、哮喘、不典型肺炎等一系列疾病。本病原體常感染學(xué)齡兒童及老年人，約占呼吸道感染疾病的20%。目前，治療肺炎支原體肺炎（MPP）的首選藥物是大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，隨著臨床MP耐藥菌株的不斷增加，使臨床治療效果降低。由于中藥的特殊性，細(xì)菌較少對(duì)其產(chǎn)生耐藥，本研究擬根據(jù)8種中藥對(duì)肺炎支原體的體外抑菌試驗(yàn)，篩選出對(duì)肺炎支原體有較好抑菌和殺菌效果的中草藥材，為中藥院內(nèi)制劑開(kāi)發(fā)和中醫(yī)臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

中草藥：云南石斛（dendrobium）、遼寧板藍(lán)根（radix isatidis）、云南臭靈丹（Laggera pterodonta）、甘肅半夏（pinellia ternate）、四川魚(yú)腥草（herba houttuyniae）、河北黃芩（radix scutellariae）、安徽桔梗（Platycodon grandiflorum）、河南艾葉（folium artemisiae argyi）。

實(shí)驗(yàn)菌株：肺炎支原體2株流行株ATCC15531、ATCC29342和4株耐藥株MP8、MP10、MP19、MP47（均來(lái)源于昆明醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所）。

培養(yǎng)基：PPLO液體培養(yǎng)基。

實(shí)驗(yàn)設(shè)備：貝克曼離心機(jī)、山東新華電熱蒸汽壓力滅菌器、力康電熱恒溫培養(yǎng)箱。

1.2 方法

中藥原液制備：中藥原液的制備采用二次煮沸法。稱取8種中藥100g，加入蒸餾水300mL浸泡20min，強(qiáng)火加熱煮沸，文火煎煮30min，攪拌，過(guò)濾；藥渣再加入蒸餾水150mL按上法煎熬、過(guò)濾；兩次藥液合并濃縮成100mL，用NaOH調(diào)pH值至7.6～7.8，取50mL作為未離心藥液備用，剩余50mL置離心管中4000r/min離心10min；121℃高壓蒸汽滅菌20min后，作為中藥原液（1mL藥液相當(dāng)于原藥材1g），存放4℃冰箱貯存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)前以MP液體培養(yǎng)基稀釋。

中藥液的稀釋：采用倍比稀釋法，對(duì)離心和未離心藥液進(jìn)行相同處理。（1）取中藥原液125μL加入液體培養(yǎng)基875μL配為125.00mg/mL藥液①；（2）取藥液①250μL加入液體培養(yǎng)基750μL配為62.50mg/mL藥液②；（3）取藥液②250μL加入液體培養(yǎng)基750μL配為31.25mg/mL藥液③；（4）取藥液③250μL加入液體培養(yǎng)基750μL配為15.63mg/mL藥液④；（5）取藥液④250μL加入液體培養(yǎng)基750μL配為7.81mg/mL藥液⑤；（6）取藥液⑤250μL加入液體培養(yǎng)基750μL配為3.91mg/mL藥液。

肺炎支原體菌株的復(fù)蘇培養(yǎng)：ATCC15531、ATCC29342、MP8、MP10、MP19、MP47的凍干菌株（昆明醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所保藏）接入PPLO液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)1周。培養(yǎng)基由紅變黃，再次轉(zhuǎn)接到PPLO液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)5天，即為MP-2（第2代）。

MP工作菌液的制備：將凍干保存的肺炎支原體菌種，用PPLO液體培養(yǎng)法連續(xù)傳代，取第3代，采用顏色變化單位（ colour change units，CCU）方法測(cè)定MP濃度，用MP液體培養(yǎng)基稀釋到104～ 105CCU /mL，作為工作菌液。

最低抑菌濃度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）測(cè)定：采用微量稀釋法測(cè)定其最低抑菌濃度（MIC值）。在12×8孔聚苯乙烯微量板上試驗(yàn)：第1孔加入100μL培養(yǎng)基和100μL工作菌液作為陽(yáng)性對(duì)照。從2～11孔分別加入100μL稀釋藥液和100μL工作菌液，每個(gè)濃度做3個(gè)，第12孔加入200μL培養(yǎng)基，為陰性對(duì)照；藥物濃度從第2孔開(kāi)始依次為125.00mg/mL、62.50mg/mL、31.25mg/mL、15.63mg/mL、7.81mg/mL、3.91mg/mL；同時(shí)，做每個(gè)藥液濃度加培養(yǎng)基的對(duì)照，排除藥液的顏色干擾；滴入無(wú)菌液體石蠟密封，蓋上板蓋，輕搖混勻，用封口膜封邊，置電熱恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)37℃孵育48h～96h后觀察結(jié)果。利用MP的生長(zhǎng)代謝產(chǎn)物，可以改變培養(yǎng)液的pH值，從而引起其中指示劑變色的特點(diǎn)，來(lái)判定MP的生長(zhǎng)狀況，即陽(yáng)性對(duì)照孔發(fā)生顏色改變（即培養(yǎng)液中酚紅指示劑由紅色變?yōu)殚冱S色）且無(wú)混濁，加藥孔不再出現(xiàn)顏色變化的最小藥物濃度即為最低抑菌濃度（MIC）。

2 結(jié) 果

2.1 最小抑菌濃度MIC

采用微量稀釋法測(cè)得8種中草藥提取物體外抗肺炎支原體MIC結(jié)果，結(jié)果如表1所示。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，所選的7種中草藥粗提藥液以及藥液的濃度對(duì)2株ATCC15531、ATCC29342肺炎支原體流行株有一定的抑制作用：艾葉、桔梗、黃芩、臭靈丹和板藍(lán)根對(duì)MP的抑制作用最強(qiáng)，MIC均為3.91mg/mL；魚(yú)腥草次之為15.63mg/mL；石斛作用最弱為62.50mg/mL；而半夏對(duì)MP無(wú)抑制作用。與此相似，對(duì)4株肺炎支原體耐藥株，艾葉、桔梗、黃芩、臭靈丹和板藍(lán)根的抑制作用最強(qiáng)MIC均為15.70mg/mL；魚(yú)腥草次之為31.30mg/mL；石斛作用最弱為125.00mg/mL。因此8種中藥對(duì)MP流行株和耐藥株的抑制順序相同，依次為：艾葉、桔梗、黃芩、臭靈丹、板藍(lán)根抑制作用最強(qiáng)，魚(yú)腥草次之，石斛抑制作用較弱，半夏無(wú)抑制作用。

表1 8種中草藥材提取物體外抗肺炎支原體2株流行株MIC結(jié)果 （mg.mL-1）

表2 8種中草藥材提取物體外抗肺炎支原體4株耐藥株MIC結(jié)果 （mg.mL-1）

2.2 8種中草藥材提取物抗4種肺炎支原體耐藥株實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖片（備注：因篇幅原因，3.91mg/mL濃度未列出）

3 討 論

肺炎支原體（MP）是呼吸道感染的常見(jiàn)病原，數(shù)據(jù)顯示，MP是5～15歲兒童社區(qū)獲得性肺炎（community acquired pneumonia，CAP）和老年人支氣管肺炎的常見(jiàn)病原菌，占10%～40%［3-4］，僅次于肺炎鏈球菌，且有逐年升高的趨勢(shì)。除此之外，它還與急性和慢性呼吸道疾病有關(guān)，大約有25%～30%的MP感染會(huì)引發(fā)肺外并發(fā)癥［5］。MP的感染通常間隔3～7年會(huì)發(fā)生地方性流行和大流行［6-8］。

MP缺乏細(xì)胞壁這一結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，故對(duì)作用于細(xì)胞壁的抗生素如青霉素類、頭孢菌素類不敏感，而對(duì)影響蛋白質(zhì)和DNA合成的抗生素如大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、喹諾酮類等敏感?？傮w來(lái)說(shuō)，由于四環(huán)素類和喹諾酮類抗生素存在潛在的嚴(yán)重不良反應(yīng)，所以MP感染的治療仍以大環(huán)內(nèi)酯類藥物為主，但近些年來(lái)，隨著大環(huán)內(nèi)酯類藥物在臨床上的廣泛應(yīng)用，臨床遇到越來(lái)越多的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素治療無(wú)效的病例［9］，并分離出耐藥菌株［10］，提示MP耐藥現(xiàn)象的存在。目前，國(guó)內(nèi)外MP耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)。據(jù)最近幾年資料顯示，MP對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類耐藥率在日本為30.6%［11］，法國(guó)為9.8%［12］，德國(guó)為3.0%［13］，美國(guó)為27%［14］，我國(guó)陳岳明等［15］報(bào)道2009年杭州市MP耐藥率達(dá)到78.9%，辛德莉等［16］報(bào)道2009年北京地區(qū)耐藥率已達(dá)92%，劉楊等［17］報(bào)道2009年上海MP耐藥率為83.0%，韓曉華等［18］報(bào)道沈陽(yáng)地區(qū)MP耐藥率達(dá)到100%。由此可見(jiàn)，我們國(guó)內(nèi)各地區(qū)MP耐大環(huán)內(nèi)酯類非常嚴(yán)重。這對(duì)肺炎支原體感染導(dǎo)致的肺炎及肺外并發(fā)癥的治療產(chǎn)生了極大的挑戰(zhàn)，雖然目前對(duì)肺炎支原體耐藥菌株的監(jiān)測(cè)已經(jīng)被納入美國(guó)感染性疾病協(xié)會(huì)指南以及歐洲呼吸協(xié)會(huì)指南等，但目前尚無(wú)詳細(xì)的關(guān)于針對(duì)肺炎支原體耐藥菌株的治療方案。

由于中藥的特殊性，細(xì)菌不易對(duì)其產(chǎn)生耐藥，且其具有來(lái)源廣，價(jià)格低，毒性較低等優(yōu)點(diǎn)，在防病抗病毒的同時(shí)還能提高機(jī)體的免疫力，增強(qiáng)機(jī)體整體的抗病抗菌能力，從而在MP治療方面漸顯優(yōu)勢(shì)。據(jù)鄭青山教授統(tǒng)計(jì)研究結(jié)果表明，芩柏清肺濃縮丸（主要成分為黃芩，桔梗等）治療支原體肺炎總療效優(yōu)于阿奇霉素顆粒，與阿奇霉素比較，起效快，改善癥狀明顯［19］。桔梗皂苷D是芩柏清肺丸（芩柏）的重要成分，通過(guò)桔梗皂苷D治療肺炎支原體感染的細(xì)胞和小鼠，可以使細(xì)胞生長(zhǎng)加快，同時(shí)強(qiáng)烈抑制肺炎支原體P1和P30蛋白的表達(dá)，從而抑制肺炎支原體，已被批準(zhǔn)為首批有效抗MP的中藥［20-21］。

在對(duì)前期中藥治療耐藥性和頑固性支原體肺炎療效回顧性分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)院內(nèi)制劑復(fù)方臭靈丹合劑、清炎合劑、鎮(zhèn)咳神口服液在治療耐藥性MPP上有較好的療效。結(jié)合此3種制劑主要成分和臨床用中藥治療耐藥MPP的有效處方方劑，選出本研究用的8種單味中草藥材：臭靈丹、黃芩、魚(yú)腥草、南板藍(lán)根、桔梗、石斛、半夏、生艾葉；其中石斛、半夏為云南道地特色藥材。這8種藥材具有清熱解毒、潤(rùn)肺止咳［22］、止咳化痰［23］、抗菌消炎［24］的功效。實(shí)驗(yàn)所選的8種中草藥粗提藥液以及藥液的濃度對(duì)2株ATCC15531、ATCC29342肺炎支原體流行株有一定的抑制作用。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，艾葉、桔梗、黃芩、臭靈丹和板藍(lán)根對(duì)MP的MIC均為3.91mg/mL；魚(yú)腥草為15.63mg/mL；石斛為62.5mg/mL；而半夏對(duì)MP無(wú)抑制作用。對(duì)4株肺炎支原體耐藥株，艾葉、桔梗、黃芩、臭靈丹和板藍(lán)根對(duì)MP的MIC均為15.7mg/mL，魚(yú)腥草為31.3mg/mL，石斛為125mg/mL，半夏對(duì)MP無(wú)抑制作用。8種中草藥對(duì)MP流行株和耐藥株的抑制順序相同，依次為：艾葉、桔梗、黃芩、臭靈丹、板藍(lán)根抑制作用最強(qiáng)，魚(yú)腥草次之，石斛抑制作用較弱，半夏無(wú)抑制作用。4株耐藥MP的MIC明顯高于流行標(biāo)準(zhǔn)株。8種中草藥粗提藥液經(jīng)離心和不離心處理，離心后的藥液對(duì)MP的抑制效果有所減弱，尤其是臭靈丹為62.5mg/mL。8種中草藥提取物體外抗人肺炎支原體不離心效果較離心效果好。

目前越來(lái)越多的國(guó)內(nèi)外學(xué)者開(kāi)始嘗試從傳統(tǒng)中醫(yī)藥中尋找解決細(xì)菌耐藥問(wèn)題的新思路。本研究立足于中藥材，結(jié)果表明艾葉、桔梗、黃芩、臭靈丹、板藍(lán)根能較好的抑制肺炎支原體流行株及耐藥株，為相關(guān)中成藥及院內(nèi)制劑的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)及理論依據(jù)。下一步可進(jìn)一步探討中藥材抑制肺炎支原體的作用機(jī)制，以充分發(fā)揮檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)在中西醫(yī)結(jié)合中的橋梁作用，從而促進(jìn)中西醫(yī)結(jié)合事業(yè)的發(fā)展。