護(hù)心通絡(luò)方通過干預(yù)CETP介導(dǎo)脂質(zhì)代謝抗兔動脈粥樣硬化的實(shí)驗研究

王華，何雄

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是冠心病和腦梗死的主要病理基礎(chǔ)，其主要病因為高脂血癥和脂蛋白代謝紊亂［1-2］。膽固醇脂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（CETP）是一種疏水性糖蛋白，在促進(jìn)脂蛋白間的脂質(zhì)交換和轉(zhuǎn)運(yùn)方面發(fā)揮主要作用，抑制CETP的轉(zhuǎn)運(yùn)活性可加速體內(nèi)膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)代謝，降低脂質(zhì)水平，對動脈粥樣硬化的防治具有十分重要的意義［3］。護(hù)心通絡(luò)方是臨床經(jīng)驗方，該方秉承活血化瘀的宗旨，基本功效是活血、通絡(luò)。本課題組前期研究表明，護(hù)心通絡(luò)方對高脂血癥患者療效明顯且穩(wěn)定，尤其對高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）升高作用顯著［4］，同時還能降低大鼠內(nèi)皮細(xì)胞凋亡水平［5］。筆者推測護(hù)心通絡(luò)方通過CETP調(diào)控HDL-C，進(jìn)而影響脂質(zhì)代謝，參與抗AS過程。為驗證這一假說，本研究通過建立動脈粥樣硬化兔模型，從CETP 介導(dǎo)HDL-C 脂質(zhì)代謝角度探討護(hù)心通絡(luò)方抗AS的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物 2.5 月齡雄性新西蘭兔40 只，體質(zhì)量（1.8±0.5）kg，購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SYXK（湘）2019-0009。動物飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗中心，常規(guī)進(jìn)食飲水，飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗。

1.2 藥物及試劑 護(hù)心通絡(luò)方購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心，主要成分：丹參、田三七、西洋參、天麻、葛根、川芎，中藥顆粒經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院鑒定。辛伐他汀片購自海南海靈化學(xué)制藥有限公司，規(guī)格10 mg/片，國藥準(zhǔn)字H20056543。普通飼料（10%脂肪）、高脂飼料（60%脂肪）均購自美國MP Biomedicals公司。蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（貨號G1120）購自北京索萊寶科技有限公司。CETP 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒（貨號GV-E19232）購自上海極威生物科技有限公司。腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子1（ABCA1）、載脂蛋白ApoA-I（apoA-I）和卵磷脂膽固醇脂酰轉(zhuǎn)移酶（LCAT）引物委托上海生工生物工程有限公司合成。鼠抗兔ABCA1（貨號ER1861）、apoA-I（貨號P5608）、LCAT（貨號FNab04722）和β-actin（貨號FNab00873）一抗購自武漢Finetest 生物科技有限公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 動物分組及給藥方法 將40只雄性新西蘭兔按體質(zhì)量編號后按照隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對照組、AS模型組、辛伐他汀組、護(hù)心通絡(luò)方組，每組10 只。空白對照組予普通飼料喂養(yǎng)22 周；其他3 組高脂飼料喂養(yǎng)14 周后，給予普通飼料喂養(yǎng)8周，辛伐他汀組和護(hù)心通絡(luò)方組分別給予辛伐他?。?.33 mg/（kg·d）］和護(hù)心通絡(luò)方［0.34 g/（kg·d）］灌胃8周［5］。

1.4 血脂及CETP 檢測 分別于實(shí)驗前、給藥14 周、給藥22周采血，1 500 r/min離心5 min后分離血清。采用全自動生化分析儀檢測血清HDL-C、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）水平。ELISA 測定血清CETP水平。

1.5 病理組織學(xué)觀察主動脈斑塊形成情況 22周末麻醉并處死動物，分離胸主動脈，4%多聚甲醛固定，常規(guī)制成組織石蠟切片，HE染色，顯微鏡下觀察組織病理改變。

1.6 實(shí)時熒光定量PCR法（qPCR）檢測肝臟ABCA1、apoA-I、LCAT mRNA 表達(dá) 分離處死動物的肝組織，保存于液氮中備用。Trizol 法提取肝臟總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 后行qPCR測定肝臟ABCA1、apoA-I 和LCAT mRNA 的表達(dá)量。ABCA1引物：上游5′-ACGTAGCTGTCGCAGGTCACG-3′，下游5′-GCCTTACTGTCAGAGTGACGCT-3′，產(chǎn)物大小164 bp；apoAI 引物：上游5′-GAACCGATCATCGATGACAAC-3′，下游5′-CGACCTAGCATCGATGACGAC-3′，產(chǎn)物大小152 bp；LCAT引物：上游5′-ATCGACGCACGAATGCTCT-3′，下游5′-GTGGATGCAGGGATGATGTTC-3′，產(chǎn)物大小197 bp；內(nèi)參GAPDH 引物：上游5′-AGAGCACCAHAGGAGGACG-3′，下游5′-TGGGATGGAAACTGTGAAGAG-3′，產(chǎn)物大小103 bp。qPCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)40 次。使用2-ΔΔCt法分析目的基因的相對表達(dá)量。

1.7 Western blot 檢測肝臟ABCA1、apoA-I 和LCAT 蛋白表達(dá)水平 取出液氮中凍存的肝組織，切成1 mm3的小塊。預(yù)冷的PBS充分清洗組織后，使用組織蛋白提取劑獲取組織蛋白，BCA 法測定樣品蛋白濃度。并依次予以SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜，將轉(zhuǎn)好的膜加入5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h。除去封閉液，加入ABCA1、apoA-I、LCAT、β-actin一抗（均為1∶1 000稀釋），4 ℃過夜。次日回收一抗，用TBST洗3次，每次5 min，加入二抗（1∶2 000 稀釋），室溫孵育30 min，TBST 洗滌4 次，每次5 min。滴加新鮮配制的ECL 混合溶液到膜的蛋白面?zhèn)?，于暗室曝光，在不同的光?qiáng)度調(diào)整曝光條件下顯影、定影，計算目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 釆用GraphPad 7.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)多重比較采用Turkey 法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動物死亡情況 實(shí)驗過程中，空白對照組無動物死亡，AS模型組因腹瀉死亡2只，辛伐他汀組和護(hù)心通絡(luò)方組因感染和腹瀉各死亡1只，均予剔除。

2.2 各組兔血脂水平變化 實(shí)驗前各組血清TC、TG、HDL-C、LDL-C 比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。實(shí)驗14 周時，與空白對照組比較，AS 模型組、辛伐他汀組、護(hù)心通絡(luò)方組血清TC、TG、LDL-C升高，HDL-C下降（P＜0.05），提示AS模型均已構(gòu)建成功。實(shí)驗22 周時，與AS 模型組相比，辛伐他汀組、護(hù)心通絡(luò)方組血清TC、TG、LDL-C 下降，HDL-C升高（P＜0.05），見圖1。

2.3 各組兔血清CETP 水平比較 空白對照組、AS模型組、辛伐他汀組和護(hù)心通絡(luò)方組血清CETP水平（μg/L）分別為29.82±3.17、55.41±6.89、40.38±3.21、37.51±4.63，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=63.197，P＜0.01），與空白對照組相比，AS 模型組血清CETP水平升高；與AS 模型組相比，辛伐他汀組和護(hù)心通絡(luò)方組血清CETP水平下降。

2.4 各組兔主動脈壁形態(tài)變化 空白對照組大鼠主動脈內(nèi)膜完整，未見泡沫細(xì)胞和炎性細(xì)胞浸潤，無脂質(zhì)沉積。AS模型組可見主動脈內(nèi)膜明顯增厚，部分內(nèi)皮細(xì)胞脫落，內(nèi)膜下可見泡沫細(xì)胞和脂質(zhì)沉積。辛伐他汀組和護(hù)心通絡(luò)方組的病理學(xué)改變較AS 模型組減輕，見圖2。

2.5 各組兔肝臟ABCA1、apoA-I 和LCAT mRNA 的表達(dá)水平比較 與空白對照組相比，AS模型組肝臟ABCA1、apoA-I、LCAT mRNA 表達(dá)水平降低（P＜0.05）。與AS 模型組相比，辛伐他汀組和護(hù)心通絡(luò)方組肝臟ABCA1、apoA-I 和LCAT mRNA 表達(dá)升高（P＜0.05），見表1。

Fig.1 Changes of serum lipid levels in each group圖1 各組兔血脂水平變化

2.6 各組兔肝臟ABCA1、apoA-I 和LCAT 蛋白表達(dá)水平比較 與空白對照組相比，AS 模型組肝臟ABCA1、apoA-I 和LCAT 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）。與AS 模型組相比，辛伐他汀組和護(hù)心通絡(luò)方組肝臟ABCA1、apoA-I 和LCAT 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），辛伐他汀組和護(hù)心通絡(luò)方組ABCA1、apoA-I 和LCAT 蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2、圖3。

Fig.2 Morphological changes of aortic wall in each group(HE staining,×400)圖2 各組兔主動脈壁形態(tài)變化（HE染色，×400）

Tab.1 Comparison of mRNA expression levels of ABCA1,apoA-I and LCAT in liver between the four groups of rabbits表1 各組兔肝臟ABCA1、apoA-I、LCAT mRNA表達(dá)水平比較 （±s）

Tab.1 Comparison of mRNA expression levels of ABCA1,apoA-I and LCAT in liver between the four groups of rabbits表1 各組兔肝臟ABCA1、apoA-I、LCAT mRNA表達(dá)水平比較 （±s）

＊＊P＜0.01；a與空白對照組比較，b與AS模型組比較，P＜0.05。

Tab.2 Comparison of protein expression levels of ABCA1,apoA-I and LCAT in liver between the four groups of rabbits表2 各組兔肝臟ABCA1、apoA-I和LCAT蛋白表達(dá)水平比較 （±s）

Tab.2 Comparison of protein expression levels of ABCA1,apoA-I and LCAT in liver between the four groups of rabbits表2 各組兔肝臟ABCA1、apoA-I和LCAT蛋白表達(dá)水平比較 （±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與空白對照組比較，b與AS 模型組比較，P＜0.05。

Fig.3 The protein expressions of ABCA1,apoA-I and LCAT in liver of rabbits in each group detected by Western blot assay圖3 Western blot檢測各組兔肝臟ABCA1、apoA-I和LCAT蛋白表達(dá)

3 討論

高脂血癥是冠狀動脈粥樣硬化的主要原因，而他汀類作為臨床應(yīng)用最廣泛的調(diào)脂類藥物，已被證實(shí)可以降低心肌梗死、腦卒中等不良心腦血管事件的發(fā)生率，但長期應(yīng)用容易出現(xiàn)肝腎功能異常、肌肉疼痛等不良反應(yīng)［6］。中醫(yī)藥立足整體，辨證施治，具有不良反應(yīng)少，療效穩(wěn)定的優(yōu)勢。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為高脂血癥以“瘀”為主要病機(jī)，其內(nèi)因為脾弱氣虛、肝腎虧虛，外因為飲食不節(jié)、過逸少勞；內(nèi)外因相互作用導(dǎo)致痰濕內(nèi)生，蘊(yùn)而化瘀。護(hù)心通絡(luò)方中的三七有散瘀、止血、消腫止痛之功效；天麻甘平，入肝經(jīng)，息風(fēng)，定驚，治眩暈眼黑；葛根性味辛甘，性涼發(fā)散；辛者，既可解表，又可通里，在外能舒筋活絡(luò)，在內(nèi)又能通行血?dú)?；諸藥合用，活血不傷血，生新不留瘀。

研究發(fā)現(xiàn)，HDL-C 能夠通過膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)（RCT）、抗炎、抗氧化、抗細(xì)胞凋亡及舒張血管來發(fā)揮保護(hù)血管、抗動脈粥樣硬化的功效，HDL-C 水平降低是脂質(zhì)代謝紊亂的主要原因［7-9］。CETP是一種肝臟合成的糖蛋白，在循環(huán)中大部分與HDL-C 結(jié)合，在促進(jìn)脂質(zhì)交換和轉(zhuǎn)運(yùn)中起關(guān)鍵作用，與動脈粥樣硬化的發(fā)展聯(lián)系緊密［10-11］。RCT包括清除外周細(xì)胞中游離膽固醇及將游離膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟代謝2個過程，其中ABCA1/apoA-I/LCAT 通路在RCT 過程中起至關(guān)重要的作用［12-13］。ABCA1可利用腺苷三磷酸水解釋放的能量將膽固醇和磷脂從外周細(xì)胞流出，與細(xì)胞外的apoA-l 結(jié)合形成盤狀的磷脂復(fù)合物［14］。apoA-Ⅰ是ABCA1介導(dǎo)的通過巨噬細(xì)胞的膽固醇外流的最優(yōu)受體。細(xì)胞內(nèi)的膽固醇通過擴(kuò)散跨膜流出后被盤狀的磷脂復(fù)合物捕獲，形成前β-HDL，CETP 能促使前β-HDL 形成，在LCAT 催化下卵磷脂分子中的脂肪酸轉(zhuǎn)移到游離膽固醇形成膽固醇酯，并移向HDL 的中心，使HDL 顆粒轉(zhuǎn)變成富含膽固醇的成熟HDL-C。HDL-C 一部分通過清道夫受體B1進(jìn)入肝臟，從循環(huán)中清除；另一部分經(jīng)CETP運(yùn)送至含apoB 脂蛋白，CETP 將HDL-C 上的膽固醇脂轉(zhuǎn)移到極低密度脂蛋白（VLDL）和LDL，LDL通過結(jié)合LDL 受體被肝臟清除。因此CETP 可降低循環(huán)中的HDL-C，同時提高LDL-C，高水平的CETP已成為冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的主要危險因素［15-16］。通過降低CETP 水平有助于提高ApoA1 和HDL-C的水平，降低動脈粥樣硬化性心臟病的發(fā)生風(fēng)險［17］。

本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過8周的藥物干預(yù)后，相比造模成功的AS 模型組，護(hù)心通絡(luò)方組大鼠血清CETP 水平明顯下降，HDL-C 升高，TC、TG、LDL-C 水平明顯下降，同時肝臟ABCA1/apoA-I/LCAT 通路的蛋白表達(dá)明顯升高。本課題組前期已證實(shí)護(hù)心通絡(luò)方能明顯升高大鼠HDL-C，降低TC、TG、LDL-C和全血高、中、低切黏度，抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡［4-5］。結(jié)合上述結(jié)果，筆者認(rèn)為護(hù)心通絡(luò)方可能通過抑制CETP 的表達(dá)，進(jìn)而激活A(yù)BCA1/apoA-I/LCAT 通路，提高HDLC的水平，最終減輕兔高脂血癥和動脈粥樣硬化。